Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh trên cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài: “ Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh hồ tiêu (Piper nigrum L.) huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông”, nhận quan tâm giúp đỡ thầy, cô giáo Bộ môn sinh học thực nghiệm, Khoa khoa học tự nhiên & công nghệ Viện Công nghệ sinh học & Môi trường trường Đại học Tây Nguyên, tập thể, cá nhân, gia đình bạn bè Trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Phương Hạnh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ truyền đạt kiến thức, dìu dắt tơi suốt q trình thực đề tài hồn chỉnh chun đề Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô giáo Bộ môn Sinh học thực nghiệm, khoa Khoa học Tự nhiên & Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện CNSH MT quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập rèn luyện trường Đại học Tây Nguyên Tôi xin cảm ơn bố mẹ người quan tâm, chăm sóc, lo lắng, chia sẻ lúc tơi gặp khó khăn, mệt mỏi Gia đình ln nguồn động viên to lớn tôi, giúp hồn thành tốt chương trình học chun đề tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn thân thương đến tất bạn bè tập thể lớp Cơng Nghệ Sinh Học khóa 2014 tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Buôn Ma Thuột, tháng năm 2018 Sinh viên Phan Thị Mộng Trầm MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Giới hạn đề tài .2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU .3 1.1 Tổng quan hồ tiêu 1.1.1 Lịch sử phát triển hồ tiêu 1.1.2 Đặc điểm thực vật học hồ tiêu 1.1.3 Yêu cầu sinh thái hồ tiêu .7 1.1.4 Sâu bệnh hại hồ tiêu 1.2 Tổng quan tuyến trùng Meloidogyne incognita 11 1.2.1 Đặc điểm tuyến trùng Meloidogyne incognita 11 1.2.2 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne incognita 14 1.3.Tổng quan vi sinh vật vùng rễ 15 1.4 Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật kiểm sốt tuyến trùng hại thực vật.16 1.4 Tình hình nghiên cứu nước .21 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 21 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 23 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nội dung nghiên cứu .26 2.2 Đối tượng nghiên cứu .26 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 2.4 Hóa chất- dụng cụ thiết bị nghiên cứu 26 2.5 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 26 2.6 Phương pháp nghiên cứu 28 2.6.1 Thu thập, phân lập chủng VSV vùng rễ hồ tiêu (Piper nigrum L.) Chư Sê, Gia Lai 28 2.6.1.1 Phương pháp thu mẫu xử lí mẫu: .28 2.6.2.Tuyển chọn chủng VSV vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita cao phòng thí nghiệm (in vitro) 29 2.7 Phương pháp xử lý số liệu .32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .33 3.1 Kết phân lập chủng vi sinh vật vùng rễ hồ tiêu Chư Sê, Gia Lai 33 3.1.1 Kết phân lập vi khuẩn vùng rễ hồ tiêu 33 3.1.2 Kết phân lập nấm vùng rễ hồ tiêu .38 3.1.3 Kết phân lập xạ khuẩn vùng rễ hồ tiêu 45 3.2 Kết tuyển chọn chủng VSV vùng rễ có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita cao phòng thí nghiệm (in vitro) .47 3.2.1 Kết tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita 47 3.2.2 Kết tuyển chọn nấm vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita 49 3.2.3 Kết tuyển chọn xạ khuẩn vùng rễ kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 Kết luận 55 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO .56 PHỤ LỤC 61 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HL : Hiệu ức chế tiêu diệt tuyến trùng KAM : Kenknight & Munaier PDA : Potato dextrose Agar TSA : Trypticase Soy Agar TT : Tuyến trùng VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn vùng rễ phân lập huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai (Trên môi trường TSA) 32 Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái chủng nấm vùng rễ phân lập huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai (Môi trường PDA) 37 Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn vùng rễ phân lập huyện Chư Sê, tỉnh Gia Lai (trên môi trường KAM) 44 Bảng 3.4: Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita chủng vi khuẩn 46 Bảng 3.5: Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita chủng nấm 49 Bảng 3.6: Hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita chủng xạ khuẩn 52 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình1.1: Đặc điểm hồ tiêu Hình 1.2: Tuyến trùng xâm nhập gây u sưng rễ 13 Hình 1.3: Vòng đời tuyến trùng 15 Hình 3.1: Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn 37 Hình 3.2: Đặc điểm hình thái chủng nấm .43 Hình 3.3: Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 45 Hình 3.4: Hình ảnh tuyến trùng tử vong .47 Hình 3.5: Hình ảnh tuyến trùng bị vây hệ sợi nấm .50 Hình 3.6: Hình ảnh tuyến trùng tử vong .52 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hồ tiêu (Piper nigrum L.) cơng nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao, trồng nhiều nơi có giá trị xuất cao giới Hiện nay, nước có khoảng 100.000 trồng hồ tiêu, trồng nhiều tỉnh Bình Dương, Bình Phước, Đồng Nai, Gia Lai, Đắk Lắk Bà Rịa- Vũng Tàu ( Hiệp hội Hồ tiêu Việt Nam, 2013) Trong đó, tỉnh Tây Nguyên chiếm 51,6%, tỉnh Đông Nam Bộ chiếm 39,6% diện tích hồ tiêu nước Từ năm 2000 đến nay, Việt Nam quốc gia xuất hồ tiêu lớn giới, theo Tổng cục Hải quan, từ đầu năm đến tháng 11/2016, nước ta xuất 164.299 hạt tiêu, trị giá 1,327 tỷ USD, chiếm 50% sản lượng tồn cầu với suất hồ tiêu bình qn nước đạt 2,16 tiêu khô ha, xếp vào loại cao giới Trong Tây Nguyên khu vực đứng đầu diện tích, suất sản lượng hồ tiêu.[14] Trong năm gần đây, diện tích Hồ tiêu Tây Ngun nói chung, huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông nói riêng tăng nhanh việc canh tác loại hộ dân gặp nhiều khó khăn Một đối tượng gây hại quan trọng tiêu tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) Meloidogyne incognita Người nông dân chủ yếu sử dụng số loại thuốc hố học có thị trường Tuy biện pháp thể rõ mặt trái sử dụng khơng có hiệu kháng thuốc, lại ảnh hưởng xấu đến chất lượng nông sản đặc biệt gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu sử dụng số loại thuốc hóa học đặc hiệu Marshal, Oncol, Nokaphho… Hiệu việc sử dụng thuốc có làm giảm mật độ tuyến trùng, vườn bị bệnh phải áp dụng thuốc cho năm Việc sử dụng thuốc liên tục dẫn đến tượng kháng thuốc, cân hệ sinh vật vi sinh vật đất, dễ dẫn đến tượng bộc phát dịch bệnh khác đặc biệt ảnh hưởng môi trường tồn dư thuốc nông sản làm giảm suất chất lượng hồ tiêu [1] Đứng trước tình hình biện pháp tối ưu để phòng chống bệnh hồ tiêu sử dụng loài vi sinh vật địa để đối kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita hại tiêu, tơi tiến hànhthực đề tài nghiên cứu: “Phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn, nấm mốc nội sinh rễ tiêu kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh hồ tiêu (Piper nigrum L.) huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông.” Mục tiêu nghiên cứu đề tài Phân lập mô tả chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh từ mẫu rễ thu thập huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông Tuyển chọn chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh hồ tiêu huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài nghiên cứu tuyển chọn số chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh có khả kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh hồ tiêu, đồng thời cung cấp dẫn liệu khoa học khả đối kháng số xạ khuẩn, nấm nội sinh hồ tiêu làm sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng làm chế phấm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne incognita 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết đề tài góp phần vào việc tạo chế phẩm sinh học để phòng trừ bệnh tuyến trùng Meloidogyne incognita gây nên, góp phần quan trọng việc ứng dụng biện pháp sinh học phòng trừ bệnh có hiệu an tồn với mơi trường sức khoẻ người Giới hạn đề tài Thời gian thực đề tài: từ tháng 02/2018 đến tháng 05/2018 Đề tài tiến hành phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn, nấm nội sinh có hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita gây bệnh hồ tiêu huyện Đăk R’Lấp, Đăk Song tỉnh Đăk Nông C Xử lý thống kê ANOVA trắc nghiệm phân hạng hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita chủng nấm tuyển chọn ONEWAY so_TT_chet BY CHUNG_NAM /POLYNOMIAL=1 /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN T3 C DUNNETT ALPHA(0.05) Oneway 86 Descriptives so_TT_c het 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Lower Deviation Std Error Bound Upper Bound Minimum Maximum DC 1.3333 1.52753 88192 -2.4612 5.1279 00 3.00 N1 28.0000 1.00000 57735 25.5159 30.4841 27.00 29.00 N2 18.0000 2.00000 1.15470 13.0317 22.9683 16.00 20.00 N3 24.6667 2.08167 1.20185 19.4955 29.8378 23.00 27.00 N5 26.6667 1.52753 88192 22.8721 30.4612 25.00 28.00 N6 15.6667 3.78594 2.18581 6.2619 25.0715 13.00 20.00 N7 24.6667 1.52753 88192 20.8721 28.4612 23.00 26.00 N8 22.6667 1.52753 88192 18.8721 26.4612 21.00 24.00 N10 18.6667 2.08167 1.20185 13.4955 23.8378 17.00 21.00 N12 19.3333 1.52753 88192 15.5388 23.1279 18.00 21.00 N13 21.6667 1.52753 88192 17.8721 25.4612 20.00 23.00 N14 15.3333 1.52753 87 88192 11.5388 19.1279 14.00 17.00 Test of Homogeneity of Variances so_TT_chet Levene Statistic 1.120 df1 df2 12 Sig 26 386 88 ANOVA so_TT_che t Sum of Squares Between Groups (Combined) LContrast i n eDeviation a r T e r m Within Groups Total 1777.692 91.079 1686.614 Mean Square df 12 148.141 39.845 Sig .000 91.079 24.497 000 11 153.329 41.240 000 96.667 26 1874.359 38 89 F 3.718 Homogeneous Subsets 90 so_TT_chet Subset for alpha = 0.05 CHUNG _NAM N Dunc DC ana 1.33 N14 15.33 N6 15.67 N2 18.00 18.00 N10 18.67 18.67 18.67 N12 N13 N8 N3 24.67 24.67 24.67 N7 24.67 24.67 24.67 N15 26.00 26.00 N5 26.67 N1 19.33 19.33 19.33 21.67 21.67 21.67 22.67 22.67 22.67 91 28.00 so_TT_chet Subset for alpha = 0.05 CHUNG _NAM N Dunc DC ana 1.33 N14 15.33 N6 15.67 N2 18.00 18.00 N10 18.67 18.67 18.67 N12 N13 N8 N3 24.67 24.67 24.67 N7 24.67 24.67 24.67 N15 26.00 26.00 N5 26.67 N1 19.33 19.33 19.33 21.67 21.67 21.67 22.67 22.67 22.67 92 28.00 93 D Xử lý thống kê ANOVA trắc nghiệm phân hạng hoạt tính kháng tuyến trùng Meloidogyne incognita chủng xạ khuẩn tuyển chọn ONEWAY SO_TT_CHET BY CHUNG_XA_kHUAN /POLYNOMIAL=1 /STATISTICS DESCRIPTIVES HOMOGENEITY /PLOT MEANS /MISSING ANALYSIS /POSTHOC=DUNCAN T3 C DUNNETT ALPHA(0.05) 94 Descriptives SO_TT_ CHET Std N Mean Deviation Std 95% Confidence Error Interval for Mean Minimum Maximum Lower Upper Bound Bound DC 2.6667 2.51661 1.45297 -3.5849 8.9183 00 5.00 X1 16.3333 1.52753 88192 12.5388 20.1279 15.00 18.00 X2 15.0000 3.60555 2.08167 6.0433 23.9567 12.00 19.00 X3 16.6667 4.72582 2.72845 4.9271 28.4062 13.00 22.00 Total 12 12.6667 6.69237 1.93192 8.4145 16.9188 00 22.00 95 Test of Homogeneity of Variances SO_TT_CHET Levene Statistic 1.746 df1 df2 Sig 235 96 ANOVA SO_TT_C HET Sum of Squares Between Groups df F Sig (Combined) 404.667 134.889 12.263 002 LContrast i n eDeviation a r 248.067 248.067 22.552 001 156.600 78.300 7.118 017 88.000 11.000 492.667 11 T e r m Within Groups Total Mean Square 97 Homogeneous Subsets SO_TT_CHET Subset for alpha = 0.05 CHUNG_XA_ kHUAN N Duncana DC X2 15.0000 X1 16.3333 X3 16.6667 Sig 2.6667 1.000 571 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 98 Ý KIẾNCỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN Nhận xét: Đối với khóa luận tốt nghiệp ( Đánh dấu vào ô ký tên vào ý kiến chọn lựa sau): Ký tên Đồng ý thông qua báo cáo Không đồng ý thông qua báo cáo Đăk Lăk, ngày tháng năm 2017 NGƯỜI HƯỚNG DẪN (Ký ghi rõ họ tên) 99 PGS.TS Nguyễn Anh Dũng 100