Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cây lúa có hoạt tính kích thích tăng trưởng cây trồng và kháng nấm Rhizoctonia sp. gây bệnh trên cây lúa

Li Cm n   hoàn thành khóa lun tt nghip này, bên cnh s c gng ca bn thân, em đã nhn đc s hng dn vƠ giúp đ nhit tình ca thy cô, gia đình, bn bè. Li đu tiên, con xin cm n ba m và các anh ch đã luôn  bên cnh ng h tinh thn, tip sc cho con trong nhng lúc khó khn, luôn to mi điu kin tt nht đ con an tâm thc tp. Em xin chân thành cm n thy cô trong Khoa Công ngh Sinh hc, trng i hc M Thành ph H Chí Minh đã truyn đt nhng kin thc nn tng vô cùng quý giá, to tin đ đ em tip tc hc tp, nghiên cu. Em xin gi li cm n chơn thành nht đn thy Nguyn Thanh Thun, thy Nguyn Vn Minh, cô Dng Nht Linh, cm n thy cô luôn bên cnh đnh hng truyn đt kinh nghim, đng viên em hoƠn thƠnh đ tài. Em xin cm n thy an Duy Pháp, ch Võ Ngc Yn Nhi, ch Nguyn Th M Linh, anh Hà Ch Linh và các anh, ch, các bn, các em  phòng vi sinh đã ng h, giúp đ em trong sut thi gian em thc hin đ tài. Cui cùng em xin chân thành cm n nhng ngi thơn đã luôn bên cnh ng h em v mi mt và là ngun đng viên tinh thn rt ln đ em có th yên tâm thc hin đ tài. Em xin chân thành cm n. Sinh viên thc hin Lê Th Ho Tháng 5/2014 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO DANH MC CH VIT TT CFU Colony Forming Unit đ m đc H Gi IAA Indole Acetic Acid MS Minimal Salt NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth OD Optical Density ppm Parts per milion TSA Tryticase Soy Agar TSB Tryticase Soy Brot BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO DANH MC BNG Bng 2.1 Xây dng đng chun phospho 21 Bng 2.2 Xây dng đng chun IAA 23 Bng 3.1 Kt qu quan sát đi th ca các chng đc phân lp 35 Bng 3.2 Kt qu quan sát vi th 37 Bng 3.3 Kt qu đnh lng phân gii lân ca các chng 41 Bng 3.4 Kt qu đnh lng sinh IAA ca các chng 44 Bng 3.5 Kt qu kho sát phn trm c ch 46 Bng 3.6 Kt qu quan sát đi th, vi th ca 2 chng vi khun phân lp t phân Dasvila. 48 Bng 3.7 Kt qu đnh danh 2 chng vi khun phân lp t phân Dasvila 48 Bng 3.8 Kt qu đnh lng kh nng sinh IAA ca chng DV2 50 Bng 3.9 Tng hp các chng có kh nng kích thích tng trng cây trng 51 Bng 3.10 Kt qu đnh danh sinh hóa ca vi khun thuc nhóm Azotobacter 53 Bng 3.11 Kt qu đnh danh sinh hóa ca vi khun thuc Bacillus 54 Bng 3.12 Kt qu chiu dài r, thân lúa, trng lng ti, trng lng khô 58 Bng 1 Giá tr OD ca đ th đng chun phospho 78 Bng 2 Kt qu OD 600nm xác đnh phospho trong dch nuôi cy 78 Bng 3 Giá tr OD ca đ th đng chun IAA 79 Bng 4 Kt qu OD 530nm xác đnh IAA trong dch nuôi cy 80 Bng 5 Kt qu OD 530nm xác đnh IAA trong dch nuôi cy 87 Bng 6 Kt qu đo chiu dài r ca các nghim thc 88 Bng 7 Kt qu đo chiu dài thân ca các nghim thc 90 Bng 8 Kt qu cân trng lng ti ca các nghim thc 92 Bng 9 Kt qu cân trng lng khô ca các nghim thc 94 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO DANH MCăSă S đ 2.1 B trí thí nghim 19 S đ 2.2 Quy trình đnh lng phospho 22 S đ 2.3 Quy trình đnh lng IAA 24 DANH MC BIUă Biu đ 3.1  th biu din nng đ phospho tan dch nuôi cy các chng 42 Biu đ 3.2  th biu din nng đ IAA trong dch nuôi cy các chng 45 47 Biu đ 3.3  th biu din phn trm c ch nm bnh ca 2 chng V5 và D5 47 Biu đ 3.4 So sánh hƠm lng IAA sinh ra ca chng DV2 so vi các chng vi khun ni sinh 50 Biu đ 3.5  th chiu dài r ca các nghim thc 58 Biu đ 3.6  th biu din chiu dài thân ca các nghim thc 59 Biu đ 3.7  th biu din trng lng ti ca các nghim thc 59 Biu đ 3.8  th biu din trng lng khô ca các nghim thc 60 Biu đ 3.9 đ th biu din hiu qu kích thích tng trng GPE (%) 60 Biu đ 1  th tng quan gia mt đ quang và nng đ phospho chun. 78 Biu đ 2  th tng quan gia mt đ quang và nng đ IAA chun. 79 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO DANH MC HÌNH NH Hình 1.1 Cu trúc phân t ca IAA và tryptophan 10 Hình 1.2 Hình thái Bacillus 12 Hình 1.3 Hình thái Azotobacter trên môi trng vô đm và t bào vi khun Azotobacter 15 Hình 3.1 Hình đi th ca mt s chng vi khun trên môi trng NA 36 Hình 3.2 Phân lp vi khun ni sinh trên môi trng TSA (A) vƠ đa đi chng cha nc ra mu cui cùng (B) 37 Hình 3.3 Mt s hình nh quan sát vi th mt s chng phân lp đc (X100) 39 Hình 3.4 Kh nng phát trin ca vi khun V18, B3, V7, B5, V3, D1 trên môi trng vô đm 39 Hình 3.5 Kh nng phơn gii lân ca vi khun trên môi trng Pikovskaya 40 Hình 3.6 Phn ng màu phospho hòa tan ca các chng 42 Hình 3.7 Phn ng màu gia thuc th FeCl 3 -H 2 SO 4 và IAA sinh ra bi vi khun 45 Hình 3.8 Th nghim kép và kho sát phn trm c ch nm Rhizoctonia sp. ca chng D5 47 Hình 3.9 Sn phm phân Dasvila và phân lp chng vi khun t phân. 49 Hình 3.10 Hình nh vi khun DV2 và DV1 phát trin trên môi trng vô đm Ashby 49 Hình 3.11 Hình nh kh nng sinh IAA ca chng DV2 lp li 3 ln 51 Hình 3.12 Kt qu th kh nng tng thích gia các chng vi khun đc la chn 55 Hình 3.13 Ht lúa ny mm trên đa agar 56 Hình 3.14 Ht lúa ny mm đc ngâm trong dch khun tng ng vi tng nghim thc 56 Hình 3.15 Giai đon lúa phát trin đc 3 ngày, 7 ngày, 19 ngày sau khi gieo 57 Hình 3.16 Chiu dài r gia các nghim thc 61 Hình 3.17 Chiu cao thân gia các nghim thc 61 Hình 1 Kh nng lên men đng glucose ca vi khun 85 Hình 2 Phn ng VP Hình 3 Phn ng citrat 85 Hình 4 Kh nng phơn gii tinh bt Hình 5 Kh nng di đng 85 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO Hình 6 Th nghim catalase Hình 7 Th nghim oxidase 86 Hình 8 Phn ng nitrat Hình 9 Phn ng Indol 86 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO MC LC PHN 1: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1 VI KHUN NI SINH 4 1.1.1 S lc v vi khun ni sinh 4 1.1.2 Tình hình nghiên cu trong nc 5 1.1.3 Tình hình nghiên cu trên th gii 6 1.2 S C NHăNITăPHÂN T CA VI KHUN 6 1.2.1 Quá trình c đnh nit phơn t 6 1.2.2 C ch quá trình c đnh nit phơn t 7 1.3 VI KHUN HÒA TAN LÂN 8 1.3.1 Vai trò ca lơn đi vi cây trng 8 1.3.2 Vi sinh vt hòa tan lân hu c 8 1.3.3 Vi sinh vt hòa tan lơn vô c 8 1.4 VI KHUN SINH IAA 9 1.5 BNH KHÔ VN TRÊN LÚA DO NM BNH Rhizoctonia sp. GÂY RA 10 1.5.1 Triu chng 10 1.5.2 c đim phát sinh phát trin 11 1.6 VI KHUN Bacillus 12 1.7 VI KHUN Azotobacter 14 PHN 2: VT LIUăVẨăPHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 16 2.1 THIăGIANăVẨăAăIM NGHIÊN CU 17 2.2 VT LIU 17 2.3 THIT B, DNG C,ăMỌIăTRNG 17 2.3.1 Thit b 17 2.3.2 Dng c 17 2.3.3 Môi trng 17 2.3.4 Thuc th 18 2.4 PHNGăPHÁPăTHC HIN 19 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO 2.4.1 B trí thí nghim 19 2.4.2 Phng pháp phơn lp 20 2.4.3 nh tính kh nng sinh NH 3 ca vi khun 20 2.4.4 Xác đnh kh nng hòa tan lơn 21 2.4.5 Xác đnh kh nng sinh IAA 23 2.4.6 Th kh nng đi kháng nm bnh và kho sát phn trm c ch 25 2.4.7 nh danh chng đc la chn 26 2.4.8 Thí nghim th kh nng tng thích gia các chng đc la chn . 31 2.4.9 Thí nghim trng lúa 32 PHN 3: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 34 3.1 KT QU QUANăSÁTăI TH 35 3.2 KT QU QUAN SÁT VI TH 37 3.3 KH NNGăC NHăNITăPHỂNăT 39 3.4 KH NNGăHọAăTANăLỂN 40 3.4.1 nh tính kh nng hòa tan lơn 40 3.4.2 nh lng kh nng phơn gii lân ca các chng 40 3.5 KH NNGăSINHăIAA 43 3.6 KT QU KIM TRA KH NNGăI KHÁNG NM 46 3.7 KT QU PHÂN LP,ăXÁCăNH HOT TÍNH KÍCH THÍCH TNGăTR NG THC VT CA VI KHUN TRONG PHÂN VI SINH DASVILA 48 3.7.1 Kt qu quan sát đi th, vi th, đnh danh 48 3.7.2 Kt qu kho sát kh nng c đnh đm 49 3.7.3 Kt qu kho sát kh nng sinh IAA t 2 chng vi khun phân lp t phân Dasvila 49 3.8 KT QU NH DANH MT S CHNG VI KHUNăC LA CHN 51 3.8.1 Kt qu đnh danh s b 53 3.8.2 Kt qu đnh danh chng dng trc, Gram (-), không bào t 53 3.8.3 Chng dng trc, Gram (+), có bào t 54 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO 3.9 KT QU TH KH NNGăTNGăTHệCHăGIA CÁC CHNG VI KHUNăC LA CHN 55 3.10 KT QU TRNG LÚA 55 3.10.1 Chn ging, m ht ging ny mm, tin hành trng lúa 55 3.10.2 Kt qu mt s đc tính nông hc 57 PHN 4: KT LUNăVẨă NGH 65 4.1 KT LUN 66 4.2  NGH 66 BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP SVTH: LÊ TH HO 1 T VNă Lúa (Oryza sativa L.), thuc h Hòa Bn lƠ cơy ng cc quan trng nht trong s phát trin th gii vƠ lƠ lng thc chính ca hn na dân s th gii (FAOSTAT: http://faostat3.fao.org). Ngày nay, Thái Lan và Vit Nam lƠ hai nc xut go hƠng đu trong th trng lúa go th gii. Theo FAOSTAT, tng sn lng lúa go nm 2012 ca Vit Nam là 43.661.569,64 tn (FAOSTAT: http://faostat3.fao.org). Có nhiu phng pháp đ tng nng sut cng nh kim soát nm gây bnh, trong đó có bin pháp s dng hóa cht nông nghip. Phân bón và thuc hóa hc ngƠy cƠng đc nông dơn a chung và s dng đn mc d tha. iu này chng nhng làm tiêu tn tin bc mà còn gây tác hi đn đt trng, ngun nc, làm cho môi trng b ô nhim vƠ đc bit, nh hng trc tip đn cuc sng con ngi cng nh nhng sinh vt sng trong môi trng. S dng phơn bón vi sinh đ thay th cho phân bón hóa hc là vn đ đang quan tâm và chú ý vì phân bón vi sinh không nhng giúp nơng cao nng sut cây trng mà còn thân thin vi môi trng (Nguyn Th Hunh Nh và cs., 2013). Mt s nghiên cu cho thy rng, vi khun ni sinh phân lp t đt trng hoc r cây lúa có kh nng thúc đy tng trng bng kh nng c đnh nit t do, hòa tan lân, sinh hormon tng trng nh acit indol acetic (IAA)… vƠ c ch các bnh trên cây trng (Cao Ngc ip và cs., 2009; Verma và cs., 2011; Wang và cs., 2009). Kích thích tng trng thc vt do vi sinh vt có th thông qua c ch trc tip và gián tip. Kích thích trc tip là cung cp cht dinh dng thông qua các c ch nh c đnh nit phơn t, hòa tan lân và các cht dinh dng khác, đng thi sn sinh các hormon IAA, axit gibberellic, cytokinin. Kích thích gián tip mà các vi sinh vt có li c ch các vi sinh vt gây bnh có hi cho s tng trng và phát trin ca thc vt (Raddadi và cs., 2008), đng thi tng kh nng đi kháng nm bnh cho cây trng. [...]... l i ích c a vi sinh v t n i sinh, chúng tôi mong mu n th c hi tài: c vi sinh v t n i sinh cây lúa có ho t tính kích ng cây tr ng và kháng n m Rhizoctonia sp gây b nh trên cây lúa it m sàng l c ch ng có ho sinh h n xu t phân n m cho cây, kích ng h p nhi u kích thích t th c v t, kháng n m và góp ph n phát tri n n n nông nghi p b n v ng Phân l p vi khu n n i sinh cây lúa nh m sàng l c ch ng có kh phân... khi cây lúa m sinh h c 5 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 1.1.3 Tình hình nghiên c u trên th gi i N và cs p và mô t m vi khu n n i sinh t các loài th c v t khác nhau Rosenblueth và cs (2006) m t danh sách toàn di n c a vi khu n n i sinh c phân l p t m t lo t các b ph n c a cây p vi khu n n i sinh t cây c Zinniel và cs Theo nghiên c u c a Fahey và cs (1991) cho th y r ng vi khu n n i sinh có kh m soát sinh. .. khu n n i sinh có kh tan lân, t ng h p kích thích t IAA nhi u trong nh h cC m, hòa các cây nông nghi c ti n hành khá i vi n nghiên c u và phát tri n sinh h c i n Th Hu nh Nh và cs (2013) phân l p các dòng vi khu n n i sinh có kh ng t ng h p IAA và c m trên c y chu i; Nghiên c u c a H ng Hi p và cs (2011) phân l p và nh n di n vi khu n n i sinh trong cây Cúc Xuyên Chi Nguy n H u Hi p và cs (2008) n... n i sinh sinh cây không ph i thu c h u Khi vi khu n n t r n i cây lúa cao s n cho th y tính tích c c bi v thông qua s s s c ng d ng k thu ng c Vi khu n n t r còn giúp cây lúa h p thu nhi u lân, kali và s t so v i cây không b sung vi khu n n t r ng th i v i nh ng thí nghi m ch ng minh các dòng vi khu n n t r này t ng h p và phóng thích các ch ng giúp cho cây m c ng thành v i nh ng h p ch t IAA và c... m sàng l c ch ng có kh phân t , hòa tan lân, sinh IAA và kháng n m có kh ng cây tr ng , kháng Rhizoctonia sp cây lúa h cao Thí nghi th SVTH: LÊ TH H O t 2 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P T NG QUAN TÀI LI U SVTH: LÊ TH H O 3 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P 1.1 1.1.1 VI KHU N N I SINH c v vi khu n n i sinh Thu t ng vi sinh v t n i sinh bao g m t t c các sinh v t có toàn b ho c m t ph n th i gian chu k s ng... Sturz và Matheson (1996), Duijff và cs., (1997), Krishnamurthy và Gnanamanickam (1997) sinh có kh ra r ng vi khu n n i c m m b nh trên th c v t; nghiên c u c a Azevedo và cs., (2000), vi khu n n i sinh có kh c m m b nh và nghiên c u c a Hallmann và cs (1997, 1998) sinh có kh c m m b nh c Chanway, (1997) ch ra trong m t s m m c a h t, thúc kh ra r ng vi khu n n i tuy n trùng Nghiên c u c a ng h p chúng có. .. Vân và cs.) ng có kh ng h p kích thích t auxin (Barbieri và cs., 1986), giúp lo i b các ch t gây ô nhi ng (Kobayashi và cs., 2000) ng các ch t khoáng, nh (Fahey và cs., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây tr ng h p th t t ch ng ( c D u và cs., 2007) Vi khu n n i sinh SVTH: LÊ TH H O 4 BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P (Ryan và cs., 2007) 1.1.2 Tình hình nghiên c c c ta, vi c nghiên c u các vi khu n n i sinh. .. t l i và nâng cao ng c a th c v t Vi khu n n i sinh còn có th nm m b nh phát tri n b ng cách t ng h p các ch t n ti p t c t ng h p các ch t chuy n hóa và các h p ch t h Nghiên c u c a Sun và cs (2008), v s i ng c a vi khu n n i sinh vùng r lúa b ng k thu t phân tích trình t 16S rDNA Nhi u tác gi nm i quan h gi a vi khu n n t r và cây lúa, chúng xâm nhi m vào r lúa theo nghiên c u c a Terouchi và Syono,... vào quá trình hô h p và quang h p c u ch a lân Trong r t nhi u quá trình sinh hóa x y ra trong cây luôn có s tham gia c a lân Vi sinh v t s bi m t ph i lân thành d ng mu i c c cây s d ng, m t ph i d ng này c c Ca3(PO4)2 Nh ng d i d ng khó tan nh ng có pH thích h p s chuy n hóa và bi n thành d ng d tan Trong quá trình này vi sinh v t gi vai trò quan tr ng (B , 2011) 1.3.2 Vi sinh v t hòa tan lân h Vi. .. nào (Khan, 2007) i m t lo t các vi khu n Vùng r là p giáp gi a r th c v phát c ng các ch t h t ng s ng và các ngu n s ng khác nhau cho các vi sinh v Th c v t có th t i vùng r c a chúng nh s h p thu các ch m và oxy t vùng r ; và các ch t do r ti t ra (El-Shatnawi và cs., 2001) Vùng r t phát nhi u vi khu n n i sinh chui vào r s ng n i sinh; sau khi xâm nh p vào cây ch có th t p trung t i v trí xâm nh . vi sinh vt ni sinh, chúng tôi mong mun thc hin đ tài: ”SƠng lc vi sinh vt ni sinh cây lúa có hot tính kích thích tng trng cây trng và kháng nm Rhizoctonia sp. gây bnh trên cây. bnh trên cây trng (Cao Ngc ip và cs., 2009; Verma và cs., 2011; Wang và cs., 2009). Kích thích tng trng thc vt do vi sinh vt có th thông qua c ch trc tip và gián tip. Kích thích. sinh cơy lúa có kh nng c đnh nit phơn t, hòa tan lơn, sinh IAA, kháng nm Rhizoctonia sp. gơy bnh trên cây lúa.  Phơn lp vƠ đnh danh s b các chng vi khun t sn phm phơn vi sinh