Sàng lọc vi khuẩn nội sinh có khả năng kích thích tăng trưởng và kháng nấm Collectotrichum SP. Gây bệnh trên cây ớt

G năđơy,ă tătr ăthƠnhăm tăm tăhƠngăćăgiáătr ăkinhăt ăcaoăvìăngoƠiăs ăd ngălƠmăgiaăv ăt iăcònăđ căs ăd ngătrongăcôngănghi păch ăbi năth căph măvƠă d căli u.ăTrongăchuy năđ iăcơyătr ng,ă

KHOA: CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH

GVHD 1: ThS Nguy n Thanh Thu n GVHD 2: ThS Nguy năV năMinh

SVTH: Nguy n Th Thùy Linh MSSV: 1053010394

Khóa: 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, Tháng 05 n m 2014

L I C Mă N



hoàn thành đ tài này, em xin g i l i c m n đ n các Th y Cô

khoa Công Ngh Sinh H c, tr ng i h c M Thành ph H Chí Minh

đã gi ng d y và truy n đ t ki n th c cho em trong su t nh ng n m v a

qua

Em xin g i c m n sâu s c đ n th y Nguy n Thanh Thu n, th y

Nguy n V n Minh đã t n tình h ng d n, ch b o cho em trong su t th i

gian em th c hi n đ tài Em xin c m cô D ng Nh t Linh, ng i đã

truy n đ t nhi u kinh nghi m quý báu và t o đi u ki n cho chúng em

hoàn thành t t chuyên đ th c t p t t nghi p

Em xin c m n th y an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch

Nguy n Th M Linh và các anh, ch trong phòng thí nghi m đã luôn

ng h , giúp đ em trong lúc làm đ tài

Bên c nh đó, tôi xin c m n các b n c a tôi, các b n trong nhóm làm đ tài và các b n sinh viên h c vi c phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh đã luôn quan tâm, giúp đ tôi trong quá trình th c hi n đ tài này

Cu i cùng con xin c m n Cha, M , c m n gia đình đã luôn bên

con, t o m i đi u ki n t t nh t đ con hoàn thành vi c h c c a mình

M C L C

DANH M C VI T T T iv

DANH M C B NG v

DANHăM CăS ă vi

DANH M C HÌNH vii

DANH M C BI Uă viii

T V Nă 1

PH N 1: T NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 CÂY T VÀ B NHăTHÁNăTH ăTRểNăCỂYă T 5

1.1.1 T ng quan v cây t 5

1.1.2 B nhăthánăth ătrênăcơyă t 6

1.2 VIăKHU NăN IăSINH 7

1.2.1 S ăl c v vi khu n n i sinh 8

1.2.2 M t s ho tătínhăkíchăthíchăt ngătr ng cây tr ng c a vi khu n n i sinh 8

1.2.3 Tình hình nghiên c u th gi i 13

1.2.4 Tình hình nghiên c uătrongăn c 14

PH N 2: V T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 16

2.1 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U 17

2.2 V T LI U 17

2.3 THI T B , D NG C ,ăMÔIăTR NG 17

2.3.1 Thi t b 17

2.3.2 D ng c 18

2.3.3 Môiătr ng, hóa ch t và thu c nhu m 18

2.4 PH NGăPHÁPăTHệăNGHI M 19

2.4.1 B trí thí nghi m 19

2.4.2 Ph ngăpháp 20

2.5 PH NGăPHÁPăTH NG KÊ S LI U 42

PH N 3: K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 43

3.1 K T QU PHÂN L P VI SINH V T N I SINH 44

3.1.1 Quanăsátăđ i th 44

3.1.2 Quan sát vi th 47

3.2 PHÂN L P N M COLLECTOTRICHUM SP GÂY B NH THÁN TH ăTRểNăCỂYă T 49

3.2.1 K t qu thu th p m u b nh 49

3.2.2 K t qu phân l p n m b nh 50

3.2.3 K t qu th nghi m lây b nh nhân t o 51

3.3 K T QU XÁCă NH KH N NGăC NHăNIT ăPHỂNăT 52

3.4 K T QU XÁCă NH KH N NGăHÒAăTANăLỂN 52

3.4.1 nh tính kh n ngăhòaătanălơn 52

3.4.2 K t qu đ nhă l ng hòa tan lân c a các ch ng vi khu n th nghi m 53

3.5 K TăQU ăXÁCă NHăKH ăN NGăSINHăIAA 55

3.6 K T QU KH O SÁT KH N NGă KHÁNGă N M COLLECTOTRICHUM SP 57

3.7 K T QU NH DANH SINH HÓA CÁC CH NG M NH 60

3.8 K T QU TH KH N NGăT NGăTHệCHăGI A CÁC CH NG 63

PH N 4: K T LU NăVẨă NGH 64

4.2 NGH 65 TÀI LI U THAM KH O 66

PH L C 74

DANH M C VI T T T

C capsici Colletotrichum capsici

C nigrum Colletotrichum nigrum

DANH M C B NG

B ng 2 1 Xây d ngăđ ng chu n phospho 26

B ng 2 2 Xây d ng đ ng chu n IAA 29

B ng 3 1 K t qu quanăsátăđ i th các ch ng vi khu n n i sinh 44

B ng 3 2 K t qu quan sát vi th các ch ng vi khu n n i sinh 47

B ng 3 3 K t qu đ nhăl ng hòa tan lân c a các ch ng 53

B ng 3 4 K tăqu ăđ nhăl ngăsinhăIAAăc aăcácăch ng 55

B ngă 3.5ă ng kính vòng c ch và ph nă tr mă c ch n m Collectotrichum sp c a vi khu n 58

B ng 3.6 K t qu đ nh danh c a ch ng TL2 60

B ng 3.7 K t qu đ nh danh c a các ch ng TL5, TL11, TL19 61

B ng 4.1 Giá tr OD600nm c aăđ ng chu n phospho 87

B ng 4.2 K t qu OD600nm xácăđ nh phospho trong d ch nuôi c y 87

B ng 4.3 Giá tr OD c aăđ th đ ng chu n IAA 88

B ng 4.4 K t qu OD530nm xácăđ nh IAA trong d ch nuôi c y 89

B ng 4.5 K t qu đoăđ ng kính vòng kháng n m và ph nătr mă c ch n m 90

DANHăM CăS

S ăđ 2 1 Quy trình thí nghi m 19

S ăđ 2.ă2ăQuyătrìnhăđ nhăl ng phospho 27

S ăđ 2.ă3ăQuyătrìnhăđ nhăl ng IAA 30

DANH M C HÌNH

Hình 1.1 C u trúc phân t c a IAA và tryptophan 12

Hình 3 1 Phân l p vi khu n n iăsinhătrênăTSAă(A),ăvƠăđ aămôiătr ng TSA đ i ch ng c y d ch r a cu i cùng (B) 46

Hình 3.2 Hình nhăquanăsátăđ i th m t s ch ng vi khu n n i sinh trên môi tr ng NA 47

Hình 3 3 Hình nh quan sát vi th c a m t s ch ng vi khu n n i sinh d i v t kính 100X 50

Hình 3.4 M t s m u b nh thu th păđ c 51

Hình 3.5 Hình nhăquanăsátăđ i th c a n m b nhătrênămôiătr ng PDA 51

Hình 3.6 Bào t n m b nhăquanăsátăd i kính hi n vi 52

Hình 3.7 Tri u ch ng b nh thán th ătrênăqu tăđ c gây b nh nhân t o

51

Hình 3.8 Kh n ngă phátă tri n c a ch ng TL2 trênă môiă tr ngă vôă đ m Ashby 52

Hình 3.9 Kh n ngăhòaătanălơnăc a ch ng TL4 trênămôiătr ng Pikovskaya

53

Hìnhă3.10ă nhăl ng phospho tan trong d ch nuôi c y 54

Hìnhă3.11ă nhăl ng kh n ngăsinhăIAAătrongăd ch nuôi c y 57

Hình 3.12 Kh n ngăđ i kháng n m Collectotrichum sp c a ch ng TL5

58

Hình 3.13 Th kh n ngăđ i kháng gi a các ch ng TL5 và TL11 63

DANH M C BI U

Bi uăđ 3.ă1ă th bi u di n n ngăđ phospho tan d ch nuôi c y các ch ng

54

Bi uăđ 3.ă2ă th bi u di n n ngăđ IAA trong d ch nuôi c y các ch ng 56

Bi uăđ 3.3ă th bi u di n ph nătr mă c ch n m (%) 59

Bi uă đ 4.1.ă th t ngă quană gi a m tă đ quang và n ngă đ phospho

chu n 88

Bi uăđ 4.2.ă th t ngăquan gi a m tăđ quang và n ngăđ IAA chu n 90

T V Nă

tăđ căxemălƠăm tătrongănh ngăcơyătr ngăquanătr ngănh tă ăv̀ngănhi tă

đ i,ăđ căs ăd ngălƠmăgiaăv ăph ăbi nătrongăb aă năhƠngăngƠyă ăn cătaăc ngă

nh ătrênătoƠnăth ăgi i.ăTheoăt ăch căNôngăl ngăth ăgi iă(FAO,ă2003),ădi nă

tích tr ngă tătrênătoƠnăth ăgi iălƠăkho ngă1ă700ă000ăhaăđ ăs năxu tă tăt i,ăvƠăkho ngă1ă800ă000ăhaăđ ăs năxu tă tăkhô;ăt ngădi nătíchă3ă729ă900ăhaăv iăt ng

s năl ngă20ă000ă000ăt nă[54]

G năđơy,ă tătr ăthƠnhăm tăm tăhƠngăćăgiáătr ăkinhăt ăcaoăvìăngoƠiăs ăd ngălƠmăgiaăv ăt iăcònăđ căs ăd ngătrongăcôngănghi păch ăbi năth căph măvƠă

d căli u.ăTrongăchuy năđ iăcơyătr ng,ă tălƠălo iăcơyăd ătr ngănh ngăl iăchoă

hi uăqu ăkinhăt ădoănhuăc uăcaoăc aăth ătr ngăn iăđ aăvƠăxu tăkh uădoăđ́ădi nătíchătr ngă tă ăn cătaăđangăngƠyăcƠngăgiaăt ng.ăHi nănayănhuăc uătiêuăth ă tă

đ ă ph că v ă ch ă bi nă th că ph mă c aă cácă th ă tr ngă nh :ă Trungă Qu c,ă ƠiăLoan,ầăr tăl nănênăgiáă tăđangă ăm căr tăcaoă[59]

NgƠyănay,ăcơyă tăh uănh ăđưăđ cătr ngăquanhăn mănênăvi căch măścăvƠă

qu nălíăd chăh iătrênăđ iăt ngăcơyătr ngănƠyăc ngătr ănênăph căt păh n,ănh tălƠăvƠoănh ngăth iăđi măth iăti tăkhôngăthu năl iălƠmă nhăh ngăkhôngănh ăđ nă

n ngăsu tăvƠăch tăl ngă t.ăCơyă tăc năph iăćăch ăđ ădinhăd ngăthíchăh păđ ăphátătri năt t,ăt ngăc ngăkh ăn ngăch ngăch uăv iăcácăy uăt ăb tăl iăc aăth iă

ti tăvƠăd chăh i.ăBênăc nhăđ́,ăvi căqu nălíăd chăh iăc ngălƠăm tăv năđ ăquană

tr ngăb iătrongăsu tăth iăgianăsinhătr ng,ăcơyă tăb ăhƠngăch căđ iăt ngăb nhă

h iăt năcông.ăTheo Isaac (1992), b nhădoăn m,ăviăkhu năvƠăvirusălƠănh ngăkh́ă

kh năl năchoăs năxu tă t.ăB nhăthánăth ăgơyăraăb iăloƠi Colletotrichum sp., héo xanhăviăkhu nădoăPseudomonas solanacearum gơyăra,ăvƠăb nhăkh mă t do vi rútăđ mă(CVMV)ăho căvirut kh măd aăchu tă(CMV)ălƠănh ngălo iăb nhăpháă

ho iănghiêmătr ngănh tăc aă tă[54]

Doăđ́ăđ ăvi cătr ngă tăđ tăk tăqu ăt t,ăng iănôngădơnăph iăćăch ăđ ăch măśc,ădinhăd ngăh pălíăvƠăqu nălíăt tăcácăđ iăt ngăd chăh i.ăHi năt iătrênăth ă

tr ngăc ngăđưăćăm tăs ăs năph măphơnăb́năvƠăthu căb oăv ăth căv tăćăth ă

nênăr tăđ căh iăv iămôiătr ngăvƠăng iănôngădơn.ă căbi t,ăđ ăđi uătr ăm tăs ă

b nhă h iă di nă ti nă nhanhă vƠoă th iă kìă choă tráiă ng iă nôngă dơnă th ngă phunăthu căvƠoăsátăth iăgianăthuăho chănênăkhôngăđ măb oăanătoƠnăv ăsinh,ăgơyăđ că

h iăchoăng iătiêuăd̀ng.ă

M tătrongănh ngăchi năl căquanătr ngălƠă ngăd ngăCôngăngh ăSinhăh cătrongăs năxu tăphơnăb́năviăsinhăph căv ăchoănôngănghi păvƠăquaăđ́,ăhiăv ngăs ăđemăl iăchoăth ăgi iăm tăngu năth căph măanătoƠnăvƠăćăgiáătr ăkinhăt ăcao

M tăs ănghiênăc uăchoăth yăr ng,ăviăkhu năv̀ngăr ăvƠăviăkhu năn iăsinh phơnăl păt ăr ăcơyălúaăćăkh ăn ngăthúcăđ yăt ngătr ngăb ngăkh ăn ngăc ăđ nhănit ăt ădo,ăhòaătơnălơn,ăsinhăhormonăIAAầăvƠă căch ăcácăb nhătrênăcơyătr ng

[3], [55], [56] Bênăc nhăđ́,ăki măsoátăd chăb nhăb ngăph ngăphápăsinhăh că(ki măsoátăsinhăh c)ăđangăd nătr ăthƠnhăxuăh ngăph ăbi năvƠăđ căápăd ngă

r ngă rưiă trongă Nôngă nghi pă ă nhi uă n că trênă th ă gi iă [16] Trongă đ́,ă bi năphápăs ăd ngăviăsinhăv tănh ăm tătácănhơnăki măsoátăvƠăphòngăng aăb nhăh i đangăd nătr ănênăph ăbi nă[7],ăvìăhi uăqu ăr̃ăr tămƠăńămangăl i,ăcácăch ngăviăsinhăv tăl aăch năph iăćăho tătínhăđ iăkhángăcao,ă năđ nhătrongăth iăgianădƠiămƠăkhôngăgơyăh iăchoăđ ngăv t,ăth căv tă[16].ăM tăs ăviăsinhăv tăn iăsinhăćă

ho tătínhăsinhăh căt oăraăcácăch tăkhángăsinhăđ iăkhángăv iăcácăviăsinhăv tăgơyă

b nhăchoăcơyăch ăc ngăđưăđ cănghiênăc uă[19]

D aătrênănh ngăc ăs ăđ́,ăchúngătôiăti năhƠnhănghiênăc uăđ ătƠiăắS̀ng l c vi

khu n n i sinh ć kh n ng ḱch th́ch t ng tr ng v̀ kháng n m

Collectotrichum sp gây b nh trên cây t”

 N i dung nghiên c u:

 Phơnăl păviăkhu năn iăsinhăcơyă t

 Phơnăl păn măCollectotrichumăsp.ă(gơyăb nhăthánăth )ăt m u t

b nhăthuăđ c

 SƠngăl căch ngăviăkhu năćăkh ăn ngăc ăđ nhăđ m,ăhòaătanălân,

sinh IAA vàăkhángăn măCollectotrichum sp gây b nh trên cây t

 nh danh nh ng ch ng vi khu n có ho t tính m nh

PH Nă1: T NG QUAN

TÀI LI U

1.1 CÂY T VÀ B NHăTHÁNăTH ăTRểNăCỂYă T

1.1.1 T ng quan v cây t

Cây t (Capsicum sp) thu c chi Capsicum, h cà (Solanaceae), có ngu n g c t Nam M , t m t loài t cay hoang d iăđ c thu n hóa và tr ng

châu Âu, nă cáchăđơyăh nă500ăn m.ăCó hai nhóm t ph bi n là t cay

(Capsicumfrutescens L.) và t ng t (Capsicum annuum L.) t ng tăđ c tr ng

nhi u châu Âu, châu M và m tăvƠiăn c chơuăÁ,ăđ c s d ngănh ăm t

lo i rau xanh ho că d̀ngă đ ch bi n t ng tă đ c tr ng n c ta t cu i

nh ngăn mă60ănh ngăv i di n tích r t nh tăcayăđ c tr ng ph bi n n ,ăchơuăPhiăvƠăcácăn c nhi tăđ i khác,ăđ c s d ng làm gia v t cay là

cây có giá tr kinh t và tr ng ph bi năh nă t ng t Trong s các cây tr ng

thu c h cà (Solanaceae), cây t có t m quan tr ng th hai ch sau cà chua [17]

Theo Bosland và Votava (2003) qu t có nhi u l i th trong vi c n u

n ng Trong qu t có ch a nhi u ch t hóa h c bao g m ch t d u d bayăh i,ă

d u béo, capsaicinoit, carotenoit, vitamin, protein, ch t s i và các nguyên t khoáng ch t Nhi u thành ph n trong qu t có giá tr dinhăd ng quan tr ng,

làm gia v , m̀iă th mă vƠă mƠuă s c Qu t giúp làm gi m nhi m x và

cholesterol, giàu vitamin A và C, nhi u khoáng kali, axit folic và vitamin E Trong qu tăt iăch a nhi uăvitaminăCăh năsoăv i qu thu c h cây có múi và

ch a nhi uăvitaminăAăh năsoăv i c cà r t Hai nhóm ch t hóa h c quan tr ng

trong t là capsaicinoit và carotenoit Capsaicinoit là alkaloit t o ra v cay cho

qu t M t s l ng l n carotenoit cung c p giá tr dinhăd ng cao và màu s c

cho qu t [54]

t là cây m tăn m, còn d ng hoang d i (qu r t nh ) có th s ng và

cho qu liên t c trong nhi uăn m.ă tălƠăcơyă aănhi t Nhi tăđ thích h p cho s sinhătr ng và phát tri n c a t là 25 ậ 28oC ban ngày và 18 ậ 20oCăbanăđêm.ă

Cây c n nhi u ánh sáng Thi u ánh sáng nh t là vào th iăđi m ra hoa s làm

gi m t l đ u trái c a cây tăc ngăch uăđ c h n th i k raăhoaăvƠăđ u trái,

đ mă(đ tăvƠăkhôngăkhí)ăđ́ngăvaiătròăquanătr ng trong vi c hình thành kh i

qu không mn.ăTuyănhiên,ăđ măđ t quá cao (trên 80%) s làm b r kém

phát tri n, cây còi c c [17]

1.1.2 B nh thán th trên cây t

 Phân b

B nhăr tăph ăbi nă ănhi uăn cătrênăth ăgi i,ăđ căbi tălƠăcácăn căcó khí

h uănhi tăđ i.ăB nhăgơyăh iăn ngăn ătrênăh uăh tăcácăc̀ngătr ngă tăn căta, gây

th iăqu ă tăhƠngălo t.ăT ăl ăb nhă ănh ngăru ngănhi m b nhăn ngăćăth ăl năt iă

70% [9] Côngătácăphòngătr ăb nhăthánăth ăt iăcácăv̀ngătr ngă tăch aăth căs ămangăl iăhi uăqu ădoănh ngăhi uăbi tăv ăb nhăthánăth ăc aăng iătr ngă tăcònă

h năch ,ăvi căgieoătr ngăcácăgi ngă tăliênăt cănhi uăn măđưăt oăđi uăki năthu nă

l iăchoăb nhăb̀ngăphátăm nhăgơyăkh́ăkh năchoăvi căphòngătr ă[14]

 Tri u ch ng

B nhăćăth ăh iăthơn,ălá,ăqu ăvƠăh t,ănh ngăh iăch ăy uătrênăqu ăvƠoăgiaiă

đo năchín.ăTri uăch ngăb nhătrênăláăbanăđ uălƠăcácăđ mătrònămƠuăxám,ăsauăđ́ă

l năd nălênăthƠnhăcácăđ mămƠuănơu,ăkhô,ăhìnhătrònăho căb uăd c.ăV tăb nhăphátătri năl nălênăvƠăliênăk tănhauălƠmăkhôăcháyăm tăm ngăláălƠmăláăúaăvƠngăvƠă

r ng.ăTri uăch ngătrênătrái banăđ uălƠăm tăđ mănh ,ăh iăl̃m,ă tătrên b ăm tă

v ăqu ,ăsauă2-3ăngƠyăkíchăth căv tăb nhăćăth ălênăt iă1cmăđ ngăkính.ăV tă

b nhăth ngăćăhìnhăthoi,ăl̃m,ăphơnăranhăgi iăgi aămôăb nhălƠăm tăđ ngămƠuăđenăch yăd cătheoăv tăb nh.ăTrênăb ăm tăv tăb nhăćănh ngăch mănh ălƠăđ a cƠnhăc aăn măb nh.ăCác v tăb nhăćăth ăliênăk tăv iănhauălƠmăqu ăb ăth i, v ăkhôăćămƠuătr ngăvƠngăb nă[9], [13]

 Nguyên nhân gây b nh

B nhă doă haiă lo iă n mă Colletotrichum nigrum Ell et Hals và

Colletotrichum capsici (Syd.)ă Butleră andă Bisbyă gơyă ra.ă Haiă lo iă n mă trênă

th ngăsongăsongăpháăh iălƠmăqu ă tăb ăth iănhanhăch́ng.ă

aăcƠnhăc aăn măC nigrum ćăđ ngăkính t ă120ăậ 280ăµmăćănhi uălôngăgaiăđenănh nă ăđ nh,ăkíchăth că55ă- 190 x 6,5 - 65µm.ăBƠoăt ăphơnăsinhă

hình b uăd căho căhìnhătr ăhaiăđ uătròn,ăkhôngămƠu,ăđ năbƠo,ăkíchăth că18ă- 25ăxă3ăµm.ăCƠnhăbƠoăt ăphơnăsinhăng năhìnhăg yăkíchăth că20ă- 50ăxă25ăµm.ă ă

n măC capsici thìăđ aăcƠnhăćăđ ngăkínhă70ăậ 100 µm có lông gai màu nâu

s m,ăđ nhăćămƠuăh iănh tăćănhi uăng năngangăvƠădƠiăt iă150ăµm.ăBƠoăt ăphơnăsinhăkhôngămƠu,ăđ năbƠo,ăh iăcongăhìnhăl iăli m,ăkíchăth că17ă- 28 x 3 ậ 4 µmăćăgi tăd uăbênătrong.ăBƠoăt ăphơnăsinhăc aăhaiălo iăn mănƠyăn yăm mătrongăn căsauă4ăgi ,ănhi tăđ ăthíchăh păchoăn măgơyăb nhălƠă28 ậ 30oC.ăB nhăphátătri năm nhătrongăđi uăki nănhi tăđ ăcao,ă măđ ăcao.ăBƠoăt ăphátătánănh ăgíăvƠănh ăcônătr̀ng

B nhă gơyă thi tă h iă l nă trongă nh ngă n mă m aă nhi u.ă ă n că ta,ă b nhăphátătri năm nhăvƠoăthángă5ă- 7ăkhiăcơyă tăđangă ăth iăk ăthuăho chăqu ăB nhăcònă gơyă h iă vƠoă giaiă đo nă sauă thuă ho chă trongă quáă trìnhă b oă qu nă vƠă v năchuy n.ă ănh ngăru ngăb́năđ mănhi u,ăm tăđ ătr ngăcaoăth ngăb nhăn ng.ă

Gi ng t chìa vôi Hu và s ng bò nhi m b nhăn ngăh năcácăgi ng ch thiên và

m t s gi ng Thái Lan nh p n i N m t n t i trên h t gi ngăd i d ng s i n m

và bào t phơnăsinhăvƠătrênătƠnăd ăcơyăb nh Bào t phân sinh có s c s ng cao, trongăđi u ki n khô m căd̀ătƠnăd ăb v̀iătrongăđ t v n có th n y m m vào v

sau [9]

 Bi n pháp phòng tr

Tiêu di t ngu n b nh D n s chătƠnăd ăcơyăb nh, ch n h t gi ng kh e,

s ch b nh X lý h t gi ng v iăn c nóng 52 oC trong 2 gi ho c KMnO4 0,1%

t 1 - 2 gi ho c v i các lo i thu c tr n m

Luân canh v i cây tr ng khác h B trí m tăđ tr ng thích h p Di t côn

trùng h i qu Khi b nh xu t hi n có th phun m t vài lo i thu c sau: Benlate 50WP 1 kg/ ha; Topsin M 70WP 0,4 ậ 0,6 kg/ ha; Score 250ND 0,5 lít/ ha [9]

1.2 VIăKHU NăN IăSINH

1.2.1 S l c v vi khu n n i sinh

Viăkhu năn iăsinhălƠăviăkhu năs ngătrongămôăth c v tăđ cătìmăth yă ă

r ,ăthơn,ălá,ăqu ăc aăth căv t.ăV̀ngăr ălƠăn iăxu tăphátănhi uăviăkhu năn iăsinhăchuiăvƠoăr ,ăthơn,ăláăđ ăs ngăn iăsinhăsauăkhiăxơmănh păvƠoăcơyăch ăćăth ăt pătrungăt iăv ătríăxơmănh păho cădiăchuy năđiăkh păn iătrongăcơyăđ năcácăh ăm chă

c aăr ,ăthơn,ălá,ăhoaă[58],ăchúngăkhôngăćăbi uăhi năraăbênăngoƠi,ăkhôngăgơyătácă

đ ngăx uăđ năth căv tămƠăchúngăn iăsinhăvƠăthúcăđ yăs ăt ngătr ngăc aăth că

gi ngă[46],ăviăkhu năn iăsinhăth căv tăđ cătìmăth yătrongăh uăh tă ăcácăloƠiă

th căv t,ăgi aăchúngăhìnhăthƠnhăm tălo tăcácăm iăquanăh ăkhácănhauănh ăc ngăsinhăt ngăh ,ăc ngăsinhădinhăd ng,ăh iăsinhầă

Viăkhu năn iăsinhăthúcăđ yăth căv tăt ngătr ng,ăt ngăn ngăsu tăvƠăđ́ngăvaiătròălƠăm tătácănhơnăđi uăhòaăsinhăh c.ăViăkhu năn iăsinhăs năxu tăhƠngălo tăcácăs năph măt ănhiênăćăl iăchoăth căv tăkỦăch ămƠătaăćăth ă ngăd ngătrongăyă

h c,ănôngănghi păhayăcôngănghi p.ăNgoƠiăraăńăcònăćăti măn ngălo iăb ăcácă

ch tăgơyăôănhi mătrongăđ tăb ngăcáchăt ngăc ngăkh ăn ngăkh ăđ cătrênăth că

v tăvƠălƠmăchoăđ tătr ănênămƠuăm ăthôngăquaăvi căhòaătanălơnăvƠăc ăđ nhăđ m.ă

Th tăv y,ănhi uănghiênăc uăđưăch ăraăr ngăviăkhu năn iăsinhăćăkh ăn ngăki măsoátăđ căm măb nhătrênăth căv t,ă ăcônătr̀ngăvƠăc ă ătuy nătr̀ng.ăTrongăm tă

s ătr ngăh păchúngăćăth ăđ yăm nhăt căđ ăn yăm măc aăh t,ăthúcăđ yăs ăhìnhă thƠnhă cơyă conă trongă đi uă ki nă b tă l i [26] vƠă nơngă caoă kh ă n ngă t ngă

tr ngăc aăth căv tă[24].ăViăkhu năn iăsinhăcònăćăth ăng năch năm măb nhăphátătri năb ngăcáchăt ngăh păcácăch tăn iăsinhătrungăgian,ăquaăđ́ăđ ăti păt că

t ngăh păcácăch tăchuy năh́aăvƠăcácăh păch tăh uăc ăm i

1.2.2.1 S c đ nh nit phân t c a vi khu n

 Quá trình c đ nh nit phân t

M t trong nh ng quá trình vi sinh v t h căćăỦăngh aăl năđ i v i nông

nghi p là quá trình c đ nhănit ăphơnăt ă mălƠădinhăd ng thi t y uăđ cây

tr ngăsinhătr ng và phát tri n Trong nông nghi p,ăn ngăsu t c a cây tr ng

đ c cung c p ch y u b ngăcáchăd̀ngăcácăphơnăđ măvôăc ănh ngăphơnănƠyăthìăđ tăđ và có h iăchoămôiătr ng Trong kho ng không khí trên m iăhectaăđ t

có t i 80.000 t nă nit ă nh ngă ng i, gia súc và cây tr ngă đ u không có kh

n ngăs d ngăđ cănit ă d ng phân t này Cây tr ngătrênătoƠnătráiăđ t m i

n măs d ng kho ng 100-110 tri u t nănit ,ătrongăkhiăđ́ăphơnăđ m hóa h c c a

t t c cácăn c trên th gi i ch b sung kho ng 30% s l ngănit ăb l yăđi.ă

Mu n phá v ba liên k t trong phân t nit ă(N=N)ăđ d t o ra các lo i phân

hóa h c, c n ph i s d ngăcácăđi u ki n k thu t r t ph c t p (nhi tăđ cao, áp

su t cao, ch tăxúcătácăđ t ti n) Theo tính toán, mu n t ng h p ra 1 t n NH3 t N2 và H2 c năn ngăl ngăt ngăđ ngăv i n ngăl ngăsinhăraădoăđ t cháy h t 5

t năthanăđá.ăTrongăkhiăđ́ăviăsinhăv t,ătrongăđ́ăćăviăkhu năđ́ngăvaiătròăch y u

trong quá trình t o ra ngu năđ m mà cây tr ng có th s d ngăđ c thông qua

quá trình c đ nhăđ m c a chúng T các vi n c nh v sinh thái và kinh t , s

c đ nhăđ m sinh h c do s liên k t gi a vi khu n v i cây tr ngălƠăđi u mong

đ i thi t y u, nh tălƠăđ i v i các cây tr ng có giá tr kinh t quan tr ng [2],

[11], [12]

 C ch quá trình c đ nh nit phân t

Trong quá trình c đ nhăđ m sinh h c, khâu then ch t c a toàn b chu trìnhăNit ălƠăs kh liên k t c a N2 thành NH3 nh vào ngu năn ngăl ng ATP,

s ho tăđ ng c a ph c h p enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase S c

đ nhăđ m c a vi khu năđ c mô t quaăph ngătrìnhăph n ng :

N2 + 8 H+ + 8 e- + 16 ATP => 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi

Amonia (NH3)ă đ c t o ra trong chu trình ti p t c k t h p v i chu i cacbonăđ đ ng hóa thành nh ngăacidăaminăđ u tiên cung c p cho cây tr ng

Trong không khí, N2 d ng r t b n và s l ng r t phong phú, chi m 78,16%

theo th tích và 75,5% theo kh iăl ng Cây tr ngăc ngănh ăcácăloƠiăđ ng v t vƠăng i không có kh n ngăđ ng hóa tr c ti p ngu n N2 t do t không khí Quá trình c đ nhăđ m x y ra trong t bào vi khu n và vi khu nălamăđ u gi ng

nhau là nh chúng có h th ng gen nif (ni là ch vi t t t c a nitrogen-nit ăvƠăfă

là fixing-c đ nh)ă đi u khi n quá trình t ng h p enzym nitrogenase

Nitrogenase là h enzym xúc tác cho ph n ng kh N2 thành NH3.ăNh ăv y, h

th ngăgenănifăđ c xem là h th ngăgenăđi u khi n cho quá trình c đ nhăđ m

sinh h c [2], [12]

Ngày nay nhi u nhà nghiên c u khoa h căđưăch ng minh NH3 v a là s n

ph m c a quá trình c đ nhănit ăphơnăt v a là nhân t đi u hoà ho t tính c a

enzym nitrogenase Khi NH3 tíchăl yăđ n m t n ngăđ nh tăđ nh thì nó làm đìnhăch t c kh c ho tăđ ng c a nitrogenase Ki uăđi uăhoƠănh ăv y g iălƠăắă

i u hoà liên h ng c”.ăTuyănhiênăNH3 khôngăthamăgiaăđi u hoà tr c ti p mà

thông qua m t protein khác là enzym glutamin synthetase.ăăKhiăămôiăătr ng

có nhi u NH3 thì enzym này b adenin hoá nên tr ng thái b t ho t.ăNg c

l iămôiătr ng v i n ngăđ NH3 th p ho c không có thì không b adenin hoá và enzym s d ng ho tăđ ng Khi tr ng thái ho tăđ ng nó s ho t hóa h gen

ch u trách nhi m t ng h p nitrogenase [12]

1.2.2.2 Vi khu n hòa tan lân

 Vai trò c a lân đ i v i cây tr ng

Lân là m t trong nh ng nguyên t đaăl ng c n thi t cho cây tr ng sinh

tr ng và phát tri n vì nó có thành ph n c a protit t o nên nhân t bào, c n cho

vi c t o ra các b ph n m i cho cây, tham gia t ng h păaxítăamin.ăNh ăv y lân

gi vai trò r t quan tr ng trongăđ i s ng c a t bƠo.ăKhiăcơyăt ngătr ng, hình

thành nên nhi u t bào m i thì c n ph i có thêm nucleo-protit và cây ph i hút

phát tri năđ c Nhìn chung, lân s năćătrongăđ t c n cho s phát tri n c a th c

v t r t th p ch kho ng 400-1200 mg/kg và h u h t d ng mà cây tr ng không

th h păthuăđ c [11], [12]

 C ch phân gi i lân c a vi khu n

Trongăđ tăc ngăćănhi u loài vi sinh v t có vai trò quan tr ng trong quá

trình chuy n hóa lân trong t nhiên t d ng khó tiêu sang d ng d tiêu qua quá trình oxi hóa và kh h p ch tăphosphate.ăLơnăkh́ătiêuăth ng trong các d ng khoángă nh ă phosphateă canxi [(Ca3(PO4)2], apatit, phosphoric, phosphate s t (FePO4), phosphate nhôm (AlPO4),ầăviăsinhăv t có th chuy n hóa chúng sang

d ng d tiêu Vi khu n phân gi i phosphate (PSB) s ng ph bi n vùng r có

th kh c ph c v nă đ trên b ng cách ti t ra các acid h u c ă vƠă enzymeă

phosphatase chuy n phosphate không tan thành phosphate hòa tan (ion

monobasicăvƠădibasic)ăđ cây tr ng có th s d ng.ă ng v tă năth c v t và

bi n phospho h uăc ăth c v t thành phospho h uăc ăđ ng v t [43]

 Vi sinh v t hòa tan lân h u c

Vi sinh v t hòa tan lân h uăc ăch y u g m Bacillus và Pseudomonas ángăchúăỦălƠăB megaterium var phosphatsum có kh n ngăhòaătanălơnăh uăc ăcao,ăđ ng th i B megaterium còn có kh n ngăhìnhăthƠnhăbƠoăt nên s c s ng

r t m nh Phân gi iă xácă đ ng v t, th c v t axít nucleic, nucleotid,

phospholipid, s n ph m phân gi i cu i cùng là H3PO4 Quá trình phân gi i c n

s tham gia c a nhi u nhóm VSV thu c các gi ng Bacillus và Pseudomonas Quá trình có th bi u di n t ngăquátătheoăs ăđ sau [12]:

Nucleoproteină ăănucleină ăăaxítănucleică ăănucleotideă ăăH3PO4 Leucithină ăăGlyceroăphosphată ăăH3PO4

Nhi u vi khu nă nh ă Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus

butyricus, Pseudomonas fluorescens có kh n ngăphơnăgi i Ca3(PO4)2 và b t apatit

C ăch quá trình phân gi i Ca3(PO4)2 có liên quan m t thi tăđ n s s n

sinh axít trong quá trình s ng c a VSV Tác d ng v i m t trong b n lo i axít: H3PO4, H2CO3, HNO3, H2SO4,ătrongăđ́ăH2CO3 r t quan tr ng Chính H2CO3

đưălƠmăchoăCa3(PO4)2ăphơnăgi i Quá trình phân gi iănh ăsau [12]

Ca3(PO4)2 + 4 H2CO3 + H2Oă ăCa(HPO4)2.H2O + Ca(HCO3)2

1.2.2.3 Vi khu n sinh IAA

IAA (Indole-3-Acetic Acid) là m t hormon quan tr ngă đ c s n xu t

b i m t s PGPR, có r t nhi u nghiên c uăđưăch ng minh r ng khi cây tr ng

đ c x lý v i IAA do PGPR s n xu t s giaă t ngă s phát tri n Vi c vi

khu n Bacillus RC23, Paenibacillus polymyxa RC05, B subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B Megaterium RC01, B simplex RC19 v iătrƠăđưălƠmăgiaăt ngăt l r so v iăđ i ch ng do vi khu n có

kh n ngăsinhăIAA.ăM t nghiên c u khác cho th y Azospirillum không ch có

kh n ngă c đ nhă đ m mà còn có kh n ngă s n xu t IAA Các ch ng

Azospirillum đ c nghiên c u cho th y r ng s n ph m IAA ph thu c vào môi

tr ng nuôi c y và ti n ch t tryptophan [43]

Hình 1.1 C u trúc phân t c a IAA và tryptophan [60]

Theo Koga (1991), có 3 l trình tiêu bi u nh t cho s bi năđ i c a tryptophanăthƠnhăIAAăvƠăđ c mô t chi ti tănh ăsau:

L- L trình Indole-3-pyruvic acid:

Tryptophan indole-3-pyruvic acid  indole-3-acetaldehyde  IAA

 L trình Tryptamine:

Tryptophan  tryptamine  indol-3-acetaldehyde  IAA

 L trình indole-3-acetamic:

Tryptophan  indole-3-acetamide  IAA

H u h t các vi khu nă ćă íchă nh ă Rhizobium,ă Bradyrhizobium,ă vƠă

Azospirillum t ng h păIAAăquaăđ ng Indole-3-pyruvic acid M t vài vi khu n

gây b nhănh ăPseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, và Erwinia

herbicola t ng h păIAAătheoăđ ngindole-3-acetamide [43]

1.2.3 Tình hình nghiên c u th gi i

M tănghiênăc uăc aăLodewyckxăvƠăc ngăs ă(2002) [41] nêuălênăph ngăphápăphơnăl păvƠămôăt ăđ căđi măviăkhu năn iăsinhăt ăcácăloƠiăth căv tăkhácănhau.ăD aătrênăn năt ngănghiênăc uăc aăHallmannăvƠăc ngăs ă(1997) [34] và LodewyckxăvƠăc ngăs ă(2002) [41], Rosenblueth và Martinez-Romero (2006)

[48] đưăcôngăb ăm tădanhăsáchătoƠnădi năc aăviăkhu năn iăsinhăđ căphơnăl pă

t ăm tălo tăcácăb ăph năc aăcơy.ăM tăs ănghiênăc uăc aăSturzăvƠăMathesonă

(1996) [52],ăDuijffăvƠăc ngăs ă(1997) [27], Krishnamurthy và Gnanamanickam

(1997) [38] đưăch ăraăr ngăviăkhu năn iăsinhăćăkh ăn ngăki măsoátăđ căm mă

b nhătrênăth căv t,ănghiênăc uăc aăAzevedoăvƠăc ngăs ă(2000)ă[22] viăkhu nă

n iăsinhăćăkh ăn ngăki măsoátăđ căm măb nhă ăcônătr̀ngăvƠănghiênăc uăc aăHallmannăvƠăc ngăs ă(1997,ă1998)ă[34], [35] c ngăđưăch ăraăr ngăviăkhu năn iă

sinhăćăkh ăn ngăki măsoátăđ căm măb nhăc ă ătuy nătr̀ng.ăNghiênăc uăc aă

Chanway (1997) [26] ch ăraătrongăm tăs ătr ngăh păchúngăćăth ăđ yăm nhă

t căđ ăn yăm măc aăh t,ăthúcăđ yăs ăhìnhăthƠnhăcơyăconătrongăđi uăki năb tăl iăvƠănơngăcaoăkh ăn ngăt ngătr ngăc aăth căv t.ăViăkhu năn iăsinhăcònăćăth ă

ng nă ch nă m mă b nhă phátă tri nă b ngă cáchă t ngă h pă cácă ch tă n iă sinhă trungăgian,ăquaăđ́ăđ ăti păt căt ngăh păcácăch tăchuy năh́aăvƠăcácăh păch tăh uăc ă

m i.ăNghiênăc uăc aăStrobelăvƠăc ngăs ă(2004) [50] v ăc ăch ăs năsinhăch tăchuy năh́aăm iătrongăs ăđaăd ngăsinhăh căc aăviăkhu năn iăsinhăćăth ăphátă

hi năcácălo iăthu căm iăđ ăđi uătr ăćăhi uăqu ăcácăb nhă ăng i,ăth căv tăvƠă

đ ngăv t

Hi n nay các nhà nghiên c u quan tâm nhi uăđ n nh ng loài vi khu n

n iăsinhăćăđ c tính t tănh ăviăkhu n có kh n ngăc đ nhănit ătrongăkhôngăkhí,ă

t ng h p kích thích t auxin, giúp lo i b các ch t gây ô nhi mămôiătr ng,

t ngăhƠmăl ng các ch tăkhoáng,ăt ngăkh n ngăkhángăb nh [47]

M t s nghiên c u v vi khu n n i sinh cây tăđưăđ c th c hi n trong

nh ngăn măg năđơy.ăNghiên c u c a Paul và c ng s (2013) [45] v m t s

ch ng vi khu n n i sinh cây t và ho t tính kháng n m c a chúng trong phòng thí nghi m cho th y nhi u ch ng vi khu n n i sinh phân l păđ c t cây t có

ho t tính kháng n m,ă trongă đ́ă chiă nhi u nh t là Pseudomonas, ti pă đ n là

Bacillus và Burkholderia và s đaăd ng c a các loài vi khu năkhácăđ c phân

l pă vƠă xácă đ nh, g m các chi Actinobacter, Arthrobacter, Enterobacter,

Escherichia, Kitasatospora, Pandoraea, Pantoea, Rhizobium, Ralstonia, Paenibacillus và Serratia M t nghiên c u khác c a Allu và c ng s (2014) [21] đưăphơnăl p,ăxácăđ nhăcácăđ c tính sinh hóa và PGP c a ch ng vi khu n n i

sinh Pseudomonas aeruginosa đ c phân l p t trái tăđ có ho t tính kháng

n m b nhăthánăth

1.2.4 Tình hình nghiên c u trong n c

ưăćănhi u nghiên c u v vi khu n n i sinh trong các loài cây Vi t Namănh ăNguy n Th Thu Hà (2008) [5] đưăphơnăl păđ c vi khu n n i sinh

trong m t s lo i c ch nănuôi,ăCaoăNg că i p và Nguy năThƠnhăD ngă(2010)ă

phân l p vi khu n n i sinh trong cây khóm tr ngătrênăđ t phèn huy n B n L c,

t nh Long An và huy năV nhăThu n, t nh Kiên Giang Cao Ng că i p và c ng

s phát hi n vi khu n n iă sinhă trongă cơyă lúaă m̀aă đ c s n (Oryza sativa L.)

tr ng đ ng b ng sông C u Long Nghiên c u c aăL ngăTh H ng Hi p và

Cao Ng că i p (2011) [6], phân l p và nh n di n vi khu n n i sinh trong cây

Cúc Xuyên Chi Nghiên c u c a Nguy n Th Ng c Bích, Cao Ng că i p

ARDRA IGS Tuy nhiên v năch aăćănghiênăc u nào v vi khu n n i sinh cây tăđ c th c hi n

PH Nă2: V T LI U VÀ

C U

2.1 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U

tƠiăđ c th c hi n trong th i gian t 01/11/2013 ậ 22/05/2014 t i phòng

thí nghi m Công ngh Viăsinh,ăTr ngă i h c M thành ph H ChíăMinhă(c ăs

3)

22 m u cây t kh e m nhăđ c thu th p t các ru ng t.ăTrongăđ́,ă15ăm u

đ c l y Ch G o (Ti n Giang) và 7 m uăđ c l y BìnhăD ng

4 m u t b b nhăthánăth ădoăn m Collectotrichum sp.ăgơyăra.ăTrongăđ́,ă2ă

m uă đ c l y Ch G o (Ti n Giang) và 2 m uă đ c l y ph ng Phú M ,

2.3.3 Môi tr ng, hóa ch t và thu c nhu m

Môiă tr ng: NA, NB, TSA, TSB, PDA, Pikovskaya, Ashby, MS, Clark-

Lubs,tinhb t

Thu c nhu m: thu c nhu m tím k t tinh (crystal violet), safranin O, lugol, lactophenol

Thu c th :gi y th oxidase,ă Kovac’s,ă Gressă A,ă Gressă B,ă ă ậ naphtol 5%,,

thu c th catalase H2O2 5%,Nessler’s,ăSalkowskiăR2ă(FeCl3 ậH2SO4), dung d ch axít Molybdic, dung d ch thi c ậaxít clohydric

2.4.1 B trí thí nghi m

D a vào m cătiêuăđ tài chúng tôi ti n hành thí nghi mătheoăs ăđ 2.1

S ăđ 2 1 Quy trình thí nghi m

Sàng l c vi khu n n i sinh có kh n ngăc đ nhăđ m, phân

gi i lân, sinh IAA và kháng n m

nh danh các ch ng có ho t tính cao

Th kh n ngăt ngăthíchăgi a các ch ng

2.4.2 Ph ng pháp

2.4.2.1 Phân l p vi khu n n i sinh

 L y m u

L y m uălƠăkhơuăđ u tiên và quan tr ng nh t trong quá trình tìm ki m và

phân l p m t ch ng vi sinh v t Vi c ch n l a ph iăđ m b o sao cho kh n ngăćă

s hi n di n c a ch ng vi sinh v t là cao nh t M uăđ c l y, t t nh t là ti n hành

ngay quá trình phân l p tuy n ch n [53]

Vi sinh v t n iăsinhăđ c ti n hành phân l p t các lá, thân, r c a cây t

kh e m nh, không sâu b nh M uăđ c ti n hành phâp l p trong vòng 6 gi tính t

khi m uăđ c thu th p

 X lý m u và phân l p

lo i tr các vi sinh v t còn bám trên b m t, m uăsauăkhiăđ c thu th p

đ c ti n hành x lỦănh ăsauă:ă

- B c 1: r a s ch ph nă môăvƠă láăd iăvòiăn c m nh, c t thành các

đo n nh 2 ậ 4ăcmăđ d thao tác

- B că2:ăngơmăm uăv iăethanolă70%ătrongă2ăphút

- B că 3:ă ngâm trong dung d ch sodium hypochlorite 4-6% trong 1,5

phút

- B că4:ăngâm trong ethanol 70% trong 30 giây

- B că5:ăr aăm uăv iăn căc tăvôătr̀ng

- B că6:ăđ tătrênăgi yăh păvôătr̀ng

- B că7:ăki mătraăm uăđ tăyêuăc u

ki m tra kh n ngăcácăviăsinhăv t còn sót l i trên b m t m u sau khi

kh trùng, l yă200ă lăn c c tăvôătr̀ngăđưăr a m u b c th 5 (l n cu i) c y

trang kho ng 0,1 mL lênăcácăđ aămôiătr ng Tryptic Soy Agar (TSA) và 30oC

N u sau 24 gi cácăđ aămôiătr ng này không có s xu t hi n các khu n l c thì

các m uăđưăkh tr̀ngăđ t yêu c u [53], [4]

- B c 8: n u kh trùng b m tăđ t yêu c u, ti n hành phân l p vi sinh v t

n i sinh.M uăsauăkhiăđ c x lý xong ti n hànhăd̀ngăd ngăc ăđưăkh ătr̀ng nghi n

thân (r ,ălá,ătrái)ăraăvƠăđ tăm uătrênăđ aămôiătr ng TSA, 37oCătrongăvƠiăngƠyăđ

cho s phát tri n c a vi khu n n i sinh [53]

 Làm thu n

Ti n hành c yăriaătrênămôiătr ngăNAăchoăđ năkhiăthuăđ c nh ng khu n

l căćăđ đ ngăđ u v hình d ngăc ngănh ămƠuăs c C y gi gi ng l i trên môi

tr ng NA hay d ng canh l ng NB

 Ti n hành quan sát đ i th và vi th

D a vào hình thái khu n, màu s c,ăkíchăth căđ nh n bi t các lo i vi sinh

v tăkhácănhauăvƠăđ c th ng kê các ch ng phân l păđ c t các m u thí nghi m

Quanăsátăđ i th : b ng m tăth ng, hay dùng kính lúp c m tay nh n xét v kíchăth c, màu s cầc a khu n l c vi sinh v t n i sinh

Quan sát vi th :ăđ quan sát vi khu n n i sinh ta ti n hành nhu m Gram và quanăsátăd i kính hi n vi v t kính 100X

 Nhu m Gram : nh măxácăđ nhăhìnhă d ngăt bào vi khu n, d ng c u hay

tr c, quan sát cách s p x p d ngăđ năl , d ng chu i hay chùm, và phân bi t tính

ch t b t màu Gram (ậ) ho c Gram (+) Cách ti n hành:

- t tiêu b năđưăph t kính và c đ nh m u lên thanh th y tinh ch U

- Nhu m b ng dung d ch crystal violet trong 1 phút, r aăn c, th m khô

- Nhu m l i b ng dung d ch lugol trong 1 phút, r aăn c, th m khô

- T y màu b ng c n 96o, kho ng 15-20ăgiơyă(choăđ n khi v a th y m t màu),

r aăn c, th m khô

- Nhu m b sung b ng dung d ch safranin trong 30 giây, r aăn c, th m khô

- Quan sát b ng v t kính d u,ăđ ph́ngăđ i 1.000 l n

Vi khu n Gram (+) b t màu tím crystal violet, vi khu n Gram (-) b t màu

- Sau khi r a s ch có th nhìn rõ nh ng tri u ch ngăđi n hình c a v t

b nh, c t nh ng m u có v t b nh dài kho ng 1 ậ 3 cm (g m c ph n t bào

kh e và t bào b nh)

- Ti n hành kh trùng b m t m uăquaăcácăb c: r a nhanh mô b nh

b ng ethanol 70%, r i nhúng mô b nh vào dung d ch natri hypochlorite 1% trong ethanol 10% kho ng 1 -5 phút, ti p theo r a l i mô b nh v iăn c c t

- N u kh trùng b m tăđ t yêu c u,ăđ t mô b nh lênămôiătr ng PDA

nhi tăđ 27 ± 2oC trong vài ngày [1], [4]

 Làm thu n

làm thu n n m m c chúng tôi ti năhƠnhăph ngăphápăc yăđ năbƠoă

t trênămôiătr ng PDA

- Quanăsátăđ i th : b ng m tăth ng, hay dùng kính lúp c m tay

- Quan sát vi th :ăđ quan sát ti n hành làm tiêu b n n m m c, r i quan sát

hình thái h căd i kính hi n vi v t kính 10X, 40X

 Làm tiêu b n n m m c.ăT̀yăvƠoăđi u ki n th c t chúng tôi ti n hành làm

tiêu b n n m m c theo các cách sau:

 Cách 1: L y m t lam kính s ch,ătrong,ăđưăs y khô Nh 1 gi t lactophenol

lên gi a lam kính Dùng que c y nh năđ u l y m t ph n khóm n m m cătrênăđ aă

th chămôiătr ng PDA (c ph n m cătrênăvƠăd i m t th ch)ăđ vào gi t dung

d ch lactophenol Dùng kim có cán hay que c y nh n dìm n m vào gi t dung d ch lactophenolăđ th mă t Khi n m b th mă tăhoƠnătoƠnăthìăđ y lá kính lên trên và

ép nh [8]

L uăỦ:

- Khiăđ yăláăkínhăđ ngăđ có b t khí, n u có s g păkh́ăkh nătrongăkhiăsoiă

kính

- Khi ép nh lá kính, nên dùng gi y th m b t dung d ch Lactophenol th aăđ

dung d ch không tràn lên trên m t lá kính

- Ph ngăphápănƠyăd̀ngătrongătr ng h p c n quan sát ngay các m u n m

m c

 Cách 2: l y m t lam kính s ch,ătrong,ăđưăs y khô C t m t khung gi y l c

hình vuông c nhă2cmăvƠăćăđ dày c a c nhăkhungălƠă0,3ăcm.ă t khung gi y lên

gi a lam kính r iăb măd chămôiătr ng PDA bán l ng (c 10µL) lên lam kính vào

gi a khung gi y Ti păđ n c y n măălênătrênămôiătr ng v a m iăb măvƠoă(c y

đ năbƠoăt hay c yăđ nh s i n m) yălamenălênăvƠăđ t lên thanh ch U trong

bu ng m ( đơyăs d ng đ aăpetriăbênătrongăćăch aăbôngăgònă tăăbênătrênăćăđ t

thanh ch U b ng th yătinh).ă trong 2 ngày, l y lam kính ra b khung gi y l c,

ti n hành nhu m b ng lactophenol và quan sát [8]

L uăỦ:ă

- C n chú ý thao tác vô trùng tránh nhi m sinh v t khác làm sai l ch k t qu

- Bu ng măvƠăn c c tăb măvƠoăt oămôiătr ng măđưăđ c h p kh trùng

121oC trong 20 phút

làm thu n n m m c chúng tôi ti năhƠnhăph ngăphápăc yăđ năbƠoăt :

- B c 1: kh trùng que c y

- B c 2 + 3: t o dung d ch bào t b ng cách dùng que c y l y m tăl ng

nh s i n m trên m t th ch có l n bào t ho c l y m t chút bào t t kh i bào t

l n c a n m b nh r i cho vào ng nghi m ch aă10mLăn c vô trùng

- B c 4: l c ng nghi măđ phân tán các bào t và ki m tra m tăđ bào t

b ng cách quan sát ng nghi mătr c ánh sáng ho c ki m tra m t gi t d ch bào t

d i kính lúp soi n i Tránh t o d ch bào t v i m tăđ bào t quá cao

- B c 5: làm loãng v iăn c vô trùng n u c n

- B că6:ăđ d ch bào t vào m tăđ aăpetri có ch a m t l p m ngămôiătr ng

- B c 9: ki mătraăđ aăPetriăd i kính lúp soi n i v i ngu năsángăphíaăd i

- B c 10: dùng m t que c y d p c t l y ra m t bào t n y m m và chuy n

sang m tăđ aămôiătr ng m i [1]

2.4.2.3 Thí nghi m lây b nh nhân t o

 V t li u: Trái t (c trái xanh và trái chín) kh e, s ch b nh

 Ti n hành:

- t nh ng qu tăđưăchu n b s n lên khay nh a, phun m

- Hòa d ch bào t n mă (đ t m tă đ là 106 bào t /mL),ă sauă đ́ă d̀ngă

micropipet nh vài gi t d ch bào t lên qu đ nh gây b nh

- Ph nilonălênătrênăđ cách li và gi m Theo dõi s bi u hi n tri u ch ng

Ti nă hƠnhă xácă đ nh kh n ngă c đ nhă nit ă phơnă t trênă đ aă môiă tr ng

Ashby Nh ng ch ng vi khu n có kh n ngăc đ nhănit ăphơnăt s t ngătr ng trênămôiătr ngăvôăđ m này [8]

2.4.4 Xác đ nh kh n ng hoà tan lân

2.4.4.1 Nguyên t c

Khi c y vi khu nă lênă môiă tr ng ch a h p ch t phospho khó tan là

Ca3(PO4)2, vi khu n có kh n ngă hòaă tană Ca3(PO4)2 s t o ra vòng trong xung quanh khu n l c [28]

2.4.4.2 nh tính kh n ng hòa tan lân

Ti năhƠnhăđ nhăl ngăhòaătanălơnătrênămôiătr ng Pikovskaya b ngăph ngă

pháp c yăđi m 37oC C sau 24 gi đ c k t qu ă c k t qu đ n 5-7 ngày

Khu n l c có kh n ngăhòaătanălƠănh ng khu n l c có vòng phân gi i quanh khu n

l cătrênămôiătr ng Pikovskaya [8], [20]

2.4.4.3 nh l ng kh n ng hòa tan lân

Xây d ngăđ ng chu năphosphoălƠmăc ăs đ đ nhăl ng kh n ngăhòaătanălơnătheoăcácăb căđ c trình bày b ng 2 1

B ng 2 1 Xây d ngăđ ng chu n phospho

Cách th c hi n: cho vào t ngă bìnhă đ nh m că 10ă mLă l ng dung d ch

phospho chu nănh ătrênăt ngă ng v i n ngăđ 10-100 ppm B sung 10 mL dung

d ch axít ậclo molybdic vào L căđ u,ă thêmăn c c tăđ t 40 mL Nh 0,25 mL

dung d ch thi căaxítăclohydricăphaăloưng.ăThêmăn c t i v ch Tr năđ u dung d ch vƠăđoătrênămáyăsoămƠuă b căśngă600ănm.ăXácăđ nh m tăđ quang c a m i dung

d ch

Các ch ng có kh n ngăhòaătanălơnăđ căđ nhăl ngătheoăs ăđ 2.2

- Lên men thu d ch nuôi c y trong môi tr ng l ng Pikovskaya v i

th tích c y 5%, 37oC/ 7 ngày

- Ly tâm thu d ch n i 6000 vòng/phút trong 20 phút

- Th v i thu c th (axít ậclo molybdic, thi c axít clohydric)

- So k t qu v aăthuăđ c v iăđ ng chu năphosphoăđ xácăđ nh đ c

n ngăđ phospho hòa tan c a các ch ng vi khu n th nghi m

2.4.5 Xác đ nh kh n ng sinh IAA

2.4.5.1 Nguyên t c

IAAăđ c t ng h p t vi khu n, khi tác d ng v i thu c th Salkowski R2

(FeCl3 ậH2SO4) s t o ra ph c h p có màu h ng nh tăđ năđ m tùy theo n ngăđ

IAA [30], [32]

2.4.5.2 nh l ng IAA trong d ch nuôi c y vi khu n

Xây d ngăđ ng chu năIAAălƠmăc ăs đ đ nhăl ng kh n ngăsinhăIAAătheoăcácăb căđ c trình bày b ng 2.2

B ng 2 2 Xây d ng đ ng chu n IAA