Tối ưu hóa môi trường lên men vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. T3 nhằm nâng cao hoạt tính kháng nấm Corynespora cassiicola

B GIÁO DO I HC M TP. H CHÍ MINH  BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  tài: TNG LÊN MEN VI KHUN NI SINH Bacillus sp. T3 NHM NÂNG CAO HOT TÍNH KHÁNG NM Corynespora cassiicola KHOA CÔNG NGH SINH HC CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH  SINH HC PHÂN T GVHD : ThS. NGUY SVTH : NGUYN THÀNH TRUNG MSSV : 1053010856 KHÓA : 2010  2014 Tp. H Chí Minh, tháng 5 nm 2014 LI C   tài này, ngoài s c gng ca bn thân còn có s ng dn ca thy cô, anh ch và s  ca bn bè. u tiên, em xin chân thành ct c các thy cô Khoa Công ngh Sinh Hi Hc M Tp. H t cho em nhng kin thc nn tng nht, em xin cy Nguyt Linh và thy luôn bên cng, truyt kinh nghing viên em  tài. Con c, co mu kin tt nh con hoàn thành vic hc ca mình. Em xin chân thành c ch Võ Ngc Yn Nhi, anh t Phi nhng i ch luôn ng h  tài. Bên cem xin cn, các em trong phòng thí nghim Công ngh Vi sinh i hc M Thành ph H Chí Minh tâm, giúp  em trong quá trình thc hi tài này. Mt ln na, em xin gn tt c các thy cô, anh ch, bn bè li bi kính chúc sc khe, may mn, gt hái nhi Tp. H Chí Minh, Ngày 17 tháng 06 4 NGUYN THÀNH TRUNG  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG i C T V 1  TNG QUAN TÀI LIU 4 1.1 GII THIU V CÂY CAO SU Hevea brasiliensis muell. arg 5 1.1.1 Phân loi hc 5 1.1.2 Ngun gc 5 1.1.3 m thc vt hc 5 1.1.4 Vai trò và tình hình sn xut 5 1.1.5 Tình hình bnh hi trên cây cao su 6 1.1.6 Tình hình nghiên cu ch phm sinh hc cho cây cao su 6 1.2 RYNESPORA TRÊN CÂY CAO SU 7 1.2.1 Phân b 7 1.2.2 Triu chng bnh trên cây cao su 7 1.2.3 Tác hi bnh rng lá Corynespora trên cây cao su 9 1.2.4 Cách phòng tr 11 1.3 NM Corynespora cassiicola 12 1.3.1 Lch s phát hin nm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 12 1.3.2 Phân loi hc 12 1.3.3 m hình thái 12 1.3.4 m sinh lý 13 1.3.5 Kh n ti 14 1.3.6 Kh  14 1.3.7 ng xâm nhp và kh nh ca nm Corynespora cassiicola 15 1.4 TNG QUAN V Bacillus 15 1.4.1 Phân loi 15 1.4.2  17 1.4.3 ng 17  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG ii 1.4.4 ng dng ca Bacillus 19 1.4.5 Cht chuyn hóa kháng nm ca Bacillus 20 1.5 QUY HOCH THC NGHIM 22 1.5.1 ch thc nghim 22 1.5.2 m quy hoch thc nghim 22 1.5.3 ng ca quy hoch thc nghim 23 1.5.4 Thí nghim sàng lc 24 1.5.5 T 26 1.5.6 Phn mm quy hoch thc nghim Minitab 16 30  VT LIU 37 2.1 THM NGHIÊN CU 38 2.2 VT LIU NGHIÊN CU 38 2.2.1 Chng vi sinh vt nghiên cu 38 2.2.2 Chng nm Corynespora cassiicola th nghim 38 2.2.3 ng  hóa cht 38 2.2.4 Thit b  dng c 38 2.3 PHÁP NGHIÊN CU 40 2.3.1 Tái phân lp Bacillus 40 2.3.2 nh hot tính cht kháng nm ca chng Bacillus sp. T3 bng pháp khuch tán ging thch 41 2.3.3 Kho sát n c ch nm Corynespora cassiicola b pháp phun dch lc nuôi cy chng Bacillus sp. T3 42 2.3.4 Xây da giá tr OD 610 và m t bào 44 2.3.5 Xây dng ca Bacillus sp. T3 45 2.3.6 Chn la các yu t  ng ti hot tính cht kháng nm ca chng Bacillus sp. T3 46 2.3.7 Thit k thí nghim tìm yu t  n quá trình lên t tính cht kháng nm theo thit k Plackett  Burman 49  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG iii 2.3.8 Thí nghim khu 50 2.3.9 Tìm khong tcho quá trình lên men bc 51 2.3.10 Thí nghim b mt ch nh giá tr ta các yu t 53  KT QU VÀ THO LUN 55 3.1 TÁI PHÂN LP 56 3.2 TH KH CH TÁN GING THCH 56 3.3 TNG LÊN MEN CHO CHNG Bacillus sp. T3 57 3.3.1 a giá tr OD 610 và m t bào 57 3.3.2 ng kính vòng kháng nm 58 3.3.3 Sàng lc các yu t ng 61 3.3.4 Xnh yu t ng chính theo ma trn Plackett  Burman 68 3.3.5 Thí nghim khu 73 3.3.6 Thí nghim tìm khong tc 75 3.3.7 Thí nghing b mt theo thit k thí nghim Box  Behnken 77 3.4 KHO SÁT HOT TÍNH CHT KHÁNG NM THEO THI GIAN 84 3.5 SO SÁNH KH T NM Corynespora cassiicola CA MÔI NG TNG NB 85  KT LUN VÀ KIN NGH 91 TÀI LIU THAM KHO 93 PH LC 102  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG iv DANH MC CH VIT TT ANOVA Oneway analysis of variance C. cassiicola Corynespora cassiicola CFU Colony forming unit Cs. Cng s NA Nutrent Agar NB Nutrient Broth nm nanomet OD Optical Density PTN Phòng thí nghim PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth P  B Plackett  Burman VSV Vi sinh vt WHO World Health Organization  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG v DANH MC CÁC BNG Bng 1.1. Kt hp du trong ma trn 25 Bng 1.2. Ma trn quy hoch vi N = 12, K = 11 25 Bng 2.1. Các ngun o sát 47 Bng 3.1. Kt qu phân lp 56 Bng 3.2. Kt qu th kh ng ging khuch tán 57 Bng 3.3. Giá tr OD 610 và m t bào (Log (N/mL)) 58 Bng 3.4. Giá tr xây dng ng cong hot tính cht kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 59 Bng 3.5. Kt qu các nguo sát 61 Bng 3.6. Kt qu các ngun cacbon kho sát 63 Bng 3.7. Kt qu các ngun khoáng kho sát 64 Bng 3.8. Kt qu dãy pH kho sát 65 Bng 3.9. Kt qu dãy nhi kho sát 67 Bng 3.10. Kt qu các yu t chn lc 68 Bng 3.11. Giá tr các bin s trong thí nghim Plackett  Burman tìm yu t nh n hot tính kháng nm chng Bacillus sp. T3 68 Bng 3.12. Thit k thí nghim Plackett  Burman và kt qu thí nghim vi các m ca các yu t 69 Bng 3.13. B trí thí nghim khu cho 4 yu t ng chính 73 Bng 3.14. Tc chuyc chng Bacillus sp. T3 75 Bng 3.15. Kt qu ng kính vòng kháng nc sau khi thc hin p pháp leo dc chng Bacillus sp. T3 76 Bng 3.16. Giá tr tng m trong thit k thí nghim Box  Behnken 77 Bng 3.17. B trí và kt qu thí nghim Box  Behnken chng Bacillus sp. T3 78 Bng 3.18ng kính vòng kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 84 Bng 3.19. Kt qu th nghim phun dch lc c ch nm Corynespora cassiicola chng vi khun Bacillus sp. T3 nuôi cng NB 86  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG vi Bng 3.20. Kt qu th nghim phun dch lc c ch nm Corynespora cassiicola chng vi khun Bacillus sp. T3 nuôi cng t 88 Bng 3.21. Tóm tt kt qu nghiên cu 90  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG vii DANH MC BI Bi n tính gia OD 610 và m t bào Bacillus sp. T3 58 Bi ng theo thi gian chng Bacillus sp. T3 59 Bi 3.3. ng kính vòng kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 60 Bi 3.4. Kt qu các nguo sát 62 Bi 3.5. Kt qu các ngun cacbon kho sát 63 Bi 3.6. Kt qu các ngun khoáng kho sát 64 Bi 3.7. Kt qu dãy pH kho sát 66 Bi 3.8. Kt qu dãy nhi kho sát 67 Bi 3.9ng kính vòng kháng nm theo thi gian chng Bacillus sp. T3 85  TH  th 3.1.  th các ng chính (Main Effects Plot) 71  th 3.2 th ng mc biu th giá tr ta các yu t 82  th 3.3 th b mt biu th giá tr ta các yu t 82  SVTH: NGUYN THÀNH TRUNG viii CÁC H Hình 1.1. Hai d 8 m có l và vin vàng 8 Hình 1.3. Héo và bu lá 8 Hình 1.4. Dn lá 8 Hình 1.5. Khun lc nm Corynespora cassiicola ng PDA 13 Hình 1.6. Bào t nm Corynespora cassiicola nhum bng dung dch lactophenol 13  ng nghiên cu 23 Hình 1.8. Thit k CCD vm trc và 5 ln lp li tm thí nghim trung tâm (0,0) 29 Hình 1.9. Ma trn b trí thí nghim theo thit k Box  Behnken 30 Hình 1.10. Giao din phn mm Minitab 16.2.0 31 Hình 2.1. Kt qu kháng nm ca vi khun 42 Hình 2.2ng trong h thng lên men kín 45 Hình 3.1. Hình thái nhum Gram vi khun Bacillus sp. T3 56 Hình 3.2. Hình thái khun lc vi khun Bacillus sp. ng NA 56 Hình 3.3. Kt qu th kh ng ging khuch tán chng Bacillus sp. T3 57 Hình 3.4. Kt qu giá tr ta các yu t ng chính 83 [...]... y vi khu n) (Nguy n nguyên ng m i sau khi x cs., 2013) Trong nghiên c u này, chúng tôi t p trung chính vào nghiên c u ng t ng vi khu n n i sinh Bacillus sp T3 nh m nâng cao ho t tính kháng n m Corynespora cassiicola T tài nghiên c T ng lên men ch ng vi khu n n i sinh Bacillus sp T3 nh m nâng cao ho t tính n m Corynespora cassiicola M c tiêu: T ng lên men ch ng vi khu n n i sinh Bacillus sp T3 nh m nâng. .. p ch t sinh h SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG ch t kháng 2 n m và kháng khu n, các enzym ngo i bào, các ch và các ch t ho ng b m t (Bottone và cs., 2003) Ch ng Bacillus sp sinh ng th c v t c cung c p b i phòng thí nghi m Công ngh Vi i H c M Tp H in vitro c ch Corynespora cassiicola K t qu tính c ch n m Corynespora cassiicola Bacillus sp T3 và tiêu di i v i ch ng vi khu n n i sinh c n m Corynespora cassiicola. .. Bacillus sp Bacillus subtilis (Berkeley và cs., 2002) Bacillus Bacillus brevis antigen virus vi m gan B, CGTase (Hong và cs., 2005; và cs cs., 2009) 1.4.5 Ch t chuy n hóa kháng n m c a Bacillus Bacillus (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009) Bacillus tính kháng Bacillus (Zhang và cs., 2008; Kumar và cs., 2009) Enzym: Bacillus Bacillus Wen Teish và cs Bacillus cereus QQ308 Fusarium SVTH: NGUY N THÀNH... NGUY N THÀNH TRUNG 11 1.3 Corynespora cassiicola 1.3.1 L ch s phát hi n n m Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei Corynespora m 1896 Cooke Cercospora melonis Corynespora maizei Corynespora vignicola Kawamura Liu (Kawamura, 1948) loài là Corynespora cassiicola Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei (Wei, 1950) 1.3.2 Phân lo i h c Theo nghiên c u phân lo i g Corynespora cassiicola t (Kirk và cs.,... Bacillus xan Bacillus ính kháng (Toure và cs., 2004; Hong và cs., 2005) Bacillus Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus (hydroxybutyrate) Bacillus pasteurii Bacillus thuringiensis sâu vi sinh Bacillus thuringiensis subsp SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG 19 Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E coli, S aureus, Shigella, Vibrio sp nên Bacillus sp Bacillus subtilis ... trên cây cao su (Phan Thành Oidium heveae Colletotrichum gloeosporioides chim Drechslera heveae Petch, Phytophthora spp Corynespora cassiicola 1.1.6 Tình hình nghiên c u ch ph m sinh h c cho cây cao su Corynespora cassiicola ích (Han và cs., 2005; Klich và cs., 1994) SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG 6 n nay vi c nghiên c u ch ph su v c quan tâm tr b nh r ng lá trên cây cao c c Corynespora cassiicola Bacillus. .. soát hóa h s d ng ph bi n nh m làm gi m s nh c s d ng quá nhi t tr ng c a Corynespora cassiicola ã gây tác t bi n kháng thu c ng x kh c ph c nh c c các nhà u, ng d ng và khuy n khích s d ng Bi n pháp này s d ch, kí sinh, vi sinh v t, các s n ph m có ngu n g c sinh h c c th o m c, s n ph m công ngh sinh h nh iv i ng, suy m do bi n pháp hóa h c gây ra, hi n nay bi n pháp sinh h khoa h c ng chuy n gen kháng. .. d ng sinh d ng th i ch t dinh d ng (Nguy giúp nó c Qu 1.4.3.4 Các loài Bacillus sinh s n b ng hình th bào Khi t thành, th nhân s t p trung gi a t bào và phân chia tr c ti p t 1 t thành 2 t bào m i Hai t y t 1 t bào vi khu ng u i ti p t t o ra 2n t bào u sau m t th Do v y, s sinh s n c a vi khu p s nhân cs., 2009) 1.4.4 ng d ng c a Bacillus Bacillus sphatase, cellulase, Ngoài ra, Bacillus xan Bacillus. .. tính n m Corynespora cassiicola M c tiêu: T ng lên men ch ng vi khu n n i sinh Bacillus sp T3 nh m nâng cao ho t tính n m Corynespora cassiicola N i dung th c hi n: bao g m Corynespora cassiicola in vitro T u ki n nuôi c y s n xu t ch t kháng n m b ng ho ch th c nghi m So sánh kh t n m Corynespora cassiicola c ng t i ng NB SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG 3 TÀI SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG 4 1.1 O SU Hevea brasiliensis... nhiên, Bacillus có i bào t Quá trình hóa bào t b SVTH: NGUY N THÀNH TRUNG u vào cu i th i k sinh 18 ng, phát tri n, khi g u ki n th i ch t có h ch u ch n ki t ho c có tích lu các s n ph m m n i b t c a bào t Bacillus là có kh u nhi t, c và men phân gi i nh có l p v bào t Trong th i k m i b u hình thành n i bào t , Bacillus ti t ra kháng sinh tiêu di t các vi khu n xung quanh thành t bào c a vi khu . BÁO CÁO KHÓA LUN TT NGHIP  tài: TNG LÊN MEN VI KHUN NI SINH Bacillus sp. T3 NHM NÂNG CAO HOT TÍNH KHÁNG NM Corynespora cassiicola KHOA CÔNG NGH SINH HC. hot tính kháng nm Corynespora cassiicola. T  tài nghiên cTng lên men chng vi khun ni sinh Bacillus sp. T3 nhm nâng cao hot tính nm Corynespora. cao hot tính nm Corynespora cassiicola  Mc tiêu: T    ng lên men chng vi khun ni sinh Bacillus sp. T3 nhm nâng cao hot tính nm Corynespora cassiicola. Ni dung