Ch ng n m Corynespora cassiicola gây b nh trên cây cao su phân l p t i Th xƣă ng Xoài, tnhă ìnhăPh c, đ c cung c p b i phòng thí nghi m Công ngh Viăsinh,ăTr ngă i h c M Thành ph H Chí Minh.
2.2.3 Môi tr ng
ậhóa ch t
ứ Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA).
ứ C n 96o, c n 70o, NaCl, HCl, NaOH.
ứ Thu c nhu m crystal violet, lugol, safanin O.
ứ Các lo iăđ ng: glucose, fructose, lactose, manitol, tinh b t, b t b p, m t r
đ ngă(đ tă5ăđ Brix khi b sungăvƠoăn c v i t l 1/20 mL), b t ngô.
ứ Ngu nănit :ăb tăđ u nành, pepton, amoni sunphat ((NH4)2SO4), amoni nitrat (NH4NO3), amoni clorua (NH4Cl).
ứ Các mu i khoáng: FeSO4, NaCl, K2HPO4.3H2O, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, MnSO4.
ứ N c c t,ăn c mu i sinh lý 0,85%.
2.2.4 Thi t b
ậd ng c
ứ Máy ly tâm ứ Máy vortex ứ Máy b n nhi t ứ MáyăđoăpH ứ Máy ch p hình ứ Kính hi n vi ứ Máy l c ứ T l nh ứ Cơnăđi n t ứ Máy ELISA ứ T c y ứ T m ứ T s y ứ N i h p vô trùng 2.2.4.2 D ng c ứ aăpetri
ứ Các lo iămicropipetteăvƠăđ uătípăt ngă ng (100 ậ 1000 µl, 20 ậ 200 µl)
ứ Becher
ứ Erlen
ứ ngăđongă
ứ ng nghi m
2.3 PH NGăPHỄPăNGHIÊN C U
2.3.1 Tái phân l p Bacillus
Sau khi nh n gi ng Bacillus sp. T3 chúng tôi ti n hành c yăriaătrênăđ aămôiă tr ng NA, 30oC/ 24 gi đ ki mă traă hìnhă tháiă đ i th , th catalase và nhu m Gram ki m tra hình thái vi th .
Ngu ên t c
S ăkhácănhauăgi aăváchăt ăbƠoăGram (+) và Gram (ậ)ălƠmăchoăkh ăn ngăb tă
mƠuămƠngăt ăbƠoăv iăthu cănhu măkhác nhau.ăD aăvƠoăđ căđi mănƠyăng iătaăphơnă
thƠnhăhaiănhómăviăkhu n.(Nguy nă căL ngăvƠăcs.,ă2003)
Th c hi n
Vi c nhu măGramăđ c th c hi nănh ăsau:ă
ứ Nh gi tă n c lên m t phi n kính s ch. T o huy n phù v i vi khu n c n nhu m,ăh ănóngănh phi năkínhăchoăđ n khô.
ứ Ph hoàn toàn v t bôi v iăcrystalăviolet.ă yên 1 ậ 2 phút r i nh nhàng r a trôi thu c nhu măd ăb ngăn c.
ứ Nh dung d ch lugol trong kho ng 30 giây r i l i r a nh nhàng v iăn c.
ứ T y c n 96o t 15 ậ 30ăgiơy,ăsauă đóăr aăn c. Ph hoàn toàn v t bôi v i safraninăOăvƠăđ yên trong 1 phút. R a v iăn c.
ứ Th m khô phi n kính v i gi y th m. Khi phi n kính khô hoàn toàn, quan sát
d i kính hi n vi v i v t kính 100.
c k t qu
T bào vi khu n Gram (+) b t màu tím. T bào vi khu n Gram (ậ) b t màu h ng.
Vi khu n có bào t , bào t trong su t không b t màu.
Th nghi m c t l se Ngu ên t c
Các vi sinh v t hi u khí hay k khí tùy nghi ch a chu iă đi n t có
cytochromeăđ u có enzym catalase (tr các Streptococcus spp.). Enzym này là m t trong nh ng enzym có vai trò b o v t bào kh i nh ng t năth ngăb i nh ng d n xu tăăđ c tính cao c a oxi phân t trong t bào. Các vi sinh v t này có kh n ngă
bi năd ngăn ngăl ngătheoăph ngăth c theo v i oxi là ch t nh năđi n t cu i cùng trong chu i truy năđi n t , t o H2O2. Catalase s th y phân hydrogen peroside (H2O2) thành H2O và O2 ng năch n s tích t c a các phân t cóăđ c tính cao này trong t bào. (Tr năLinhăTh c, 2010)
Cách th c hi n
Dùng que c y l y m t ít khu n l căđ t trên m t phi n kính. Nh m t gi t H2O2 3% lên sinh kh i c a khu n l c trên phi n kính.
K t qu
Th nghi m:ăăd ngătínhăă (+) có b t khí do O2 t o ra. âm tính (ậ) không có s i b t khí. Th nghi măđ i ch ng: (+) Staphylococcus aureus.
(ậ) Streptococcus fecalis.
2.3.2 Xác đ nh ho t tính ch t kháng n m ch ng Bacillus sp. T3
b ng ph ng pháp khu ch tán gi ng th ch
Chúngătôiăti năhƠnhăth ăkh ăn ngăkhángăn m c aăch ngăBacillus sp. T3 th ă nghi măb ngăph ngăphápăkhu chătánăgi ng th ch. (Ingroff và cs., 1995; Kumar và cs., 2009)
2.3.2.1 M i tr ng chu n b
ứ Môiătr ng NB và PDAăđ c h p vô trùng 121oC trong 20 phút.
ứ PDAăđ căđ vƠoăđ aăPetriă(đ ng kính 90 mm) v i th tích 20 mL.
2.3.2.2 Chu n b vi khu n th nghi m
Ch ng vi khu năđ c c y ria vào th ch NA, 24 gi 37oC. Ch n 1 khu n l căđ n,ăc y vào 3 mL NB, 37oC trong 24 gi .
emăd ch vi khu năđoăODă b c sóng 610ănm,ăđi u ch nhăsaoăchoăđ t trong kho ng 0,08 ậ0,1ăt ngă ng v i m tăđ vi khu n là 1 ậ 2 x 108 CFU/ mL.
L c d ch n i sau ly tâm, s d ng màng l c 0,2 m.
D ch vi khu năđƣăchu n b c năđ c s d ng trong vòng 15 phút. 2.3.2.3 Chu n b n m Cor nespor c ssiicol th nghi m
C yăn mătrênămôiătr ngăth chăPDAă ă ă30o
Cho vào ng n m m tăítăn c mu i 0,85% có ch a 0,05% Tween 80, dùng que c y c o nh trên m t khóm n măđ l y bào t .
oăODă530ănmăđi u ch nhăsaoăchoăđ t trong kho ng t 0,08 ậ 0,12ăt ngă đ ngăv i m tăđ bào t là 1 x 106 CFU/ mL.
N măđƣăchu n b c năđ c s d ng trong vòng 15 phút. 2.3.2.4 Ti n hành th nghi m
DùngăqueăbôngăvôătrùngănhúngăvƠoăd chăn măđƣăchu n b , ép que vào thành
ngăchoăráoăn c,ăsauăđóătr iăđ u trên m t th ch. L p l i 3 l n, m i l n xoay h p 60o.
c l đ ng kính 6 mm trong b n th ch b ng d ng c ti t trùng. D ch vi khu năđ c nh vào trong l kho ng 50ă L.ă
yên kho ng 15 phút cho d ch vi khu n khu ch tán vào l p th ch. 4 ậ 5 ngày 28oC r i xem k t qu vòng kháng n m.
Thí nghi măđ c th c hi n v i 3 l n l p l i. X lý th ng kê ANOVA m t
y u t b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0.
2.3.2.5 K t qu
Vi khu n có kh ăn ngăkhángăn măkhiăxungăquanhăl ăcóăvòngăkhángăn m.
Vòng kháng n m
Hình 2.1. K tăqu ă hángăn măc aăviă hu n
2.3.3 Kh o sát n ng đ c ch n m Corynespora cassiicola b ng
ph ng pháp phun d ch l c nuôi c y ch ng Bacillus sp. T3
Ph ngăphápănƠyă v i m căđíchăth nghi m kh n ngă c ch c a d ch l c nuôi c y Bacillus sp. T3 đ i v i n m Corynespora cassiicola đƣăphátătri n trên môi
2.3.3.1 Ngu ên t c
Trong quá trình phát tri n vƠăt ngătr ng vi khu n Bacillus có kh n ngăt o ra các h p ch t kháng n m, c ch s phát tri n c a n m hay tiêu di t n m. ( ottoneăvƠăcs., 2003)
2.3.3.2 M i tr ng chu n b
Môiătr ng NB,ămôiătr ng t iă u,ămôiătr ngăPDAăvƠăn c c t đ c h p
vô trùng 121oC trong 20 phút. (Zhao và cs., 2010) 2.3.3.3 Chu n b vi khu n và n m th nghi m
Vi khu năđ cănuôiăt ngăsinhătrongă20ămLămôiătr ng NB và môiătr ng t i
u trên máy l c v i t căđ 200 vòng/ phút trong 54 gi .
Sauăth iăgianănuôiăc y,ălyătơmă10000ăvòng/ăphútătrongă10ăphútăthuăd chăn i,ă l căquaămƠngăl că0,2 m.ă(Shrivastava và cs., 2013)
N m Corynespora cassiicola đ că nuôiă trênă đ aă môiă tr ng PDA 30oC trong 4 ngày. (Zhao và cs., 2010)
2.3.3.4 Cách th c hi n
Phunăs ngăd ch l c nuôi c y vi khu n Bacillus sp. T3 lên b m t đ aămôiă tr ngăđƣănuôiăn m trên theo các n ngăđ : d ch l c nguyên, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, v i th tích phun 2 mL/ đ a.ăDch l căđ c pha v iăn c c t vô trùng theo các
n ngăđ nh ătrên.
aă đ i ch ng:ă phună s ngă 2ă mLă n c c t vô trùng lên b m tă đ a môi
tr ngăđƣănuôiăn m. (Gong và cs., 2006)
Thí nghi m l p l i 3 l n. K t qu th nghi m kh n ngăkhángăn măđ c x lý th ng kê ANOVA m t y u t b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠă đ c
trìnhăbƠyăd i d ng: V (mm) ± sai s . 2.3.3.5 K t qu
Ghi nh n t căđ phát tri n c a khu n l c n m và bi u hi n c aăt ăn m sau khi phun d ch l c m i n ngăđ khác nhau, trong 4 ngày liên ti p.
K t qu trênăđemăsoăsánhăv i t căđ phát tri n và bi u hi năt ăn m c aăđ aă
2.3.4 Xây d ng đ ng t ng quan gi a giá tr OD
610và m t đ t
bào
2.3.4.1 Ngu ên t c
Khi m t pha l ng có nhi u phân t không tan thì s hình thành m t h huy n
phùăvƠăcóăđ đ c b i các ph n t hi n di nătrongămôiătr ng l ng làm c n ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng t i. T bào vi sinh v t là m t th c th nên khi hi n
di nătrongămôiătr ngăc ngălƠmămôiătr ng tr nênăđ c.ă đ c c a huy n phù t l
v i m tăđ t bào. Trong m t gi i h n c aăđ đ c và m tăđ t bào, có th xác l p
đ c quan h t l tuy n tính gi a m tăđ t bƠoăvƠăđ đ c.ăDoăđó,ăcóăth đnh
l ng m tăđ t bào m t cách gián ti păthôngăquaăđoăđ đ c b ng cách so màu
cácăb c sóng t 550 ậ 610 nm. (Tr năLinhăTh c, 2010) 2.3.4.2 Ti n hành
ứ Ch ng Bacillus sp. T3 đ că ho tă hóaă trongă 20ă mL môiă tr ngă N ă trong
37oC/ 18 gi ă(Sreekumar và cs., 2010),ăt căđ ăl că200ăvòng/ phút (Chen và cs., 2007).
ứ Phaăloƣngăhuy năphùăt ăbƠoăđƣăt ngăsinhăsaoăchoăthuăđ căcácăhuy năphùăcóă
giáătr ăOD610l năl tăb ngă0,1;ă0,2;ă0,3;ă0,4;ă0,5.
ứ nhăl ngăt ăbƠoătrongcácăhuy năphùăb ngăph ngăphápăđ măkhu năl c.
Phaăloƣngăcácăhuy năphùăt ăbƠoăđƣăđ căđi uăch nhăv ăcácăgiáătr ăOD610
thƠnhăcácăn ngăđ ăphaăloƣngă10-1
, 10-2, 10-3, 10-4,ăầ
Hút 0,1 mL huy nă phùă ă m iă n ngă đ ă phaă loƣngă c yă trangă trênă môiă tr ngăNAă(24ăậ 48 gi / 37oC),ăm iăn ngăđ ăl păl iă3ăl n.
mă s ă khu nă l că ă cácă n ngă đ :ă ch nă n ngă đ ă cóă s ă khu nă l că m că
trongăkho ngăđ măthíchăh pă(25ăậ 250ăkhu năl c/ăđ a),ăđ măs ăl ngăt ă
bƠoătrênăc ă3ăđ aăc aăcùngăn ngăđ ăphaăloƣng.
Trongăđó:
A: là m tăđ t bào (CFU/ mL) N: là t ng s khu n l căđ măđ c
ni: là s đ aăđ căđ m n ngăđ pha loãng i V: là s mL d ch m u c y vào m iăđ a.
fi: là n ngăđ pha loãng có s khu n l căđ c ch năđ m.
ứ Xây d ng bi u đ t ngă quană gi a giá tr OD610 và n ngă đ t bào b ng ph n m m Exel c a Microsoft.
2.3.5 Xây d ng đ ng cong t ng tr ng c a Bacillus sp. T3
2.3.5.1 Ngu ên t c
S sinhă tr ng qu n th vi sinh v tă đ c nghiên c u b ng cách phân tích
đ ngă congă sinhă tr ng trong m t môiă tr ng nuôi c y vi sinh v tă theoă ph ngă
pháp nuôi c y theo m (batch culture) ho c trong m t h th ngăkín.ăCóăngh aălƠăviă
sinh v tăđ c nuôi c y trong m t thi t b kín, trong quá trình nuôi c y không thay
đ i,ă môiătr ng và th i gian nuôi c y càng kéo dài thì n ngăđ ch tădinhăd ng càng gi m sút, các ch t ph th i c aătraoăđ i ch tăcƠngăt ngălên.ăN u l y th i gian nuôi c y là tr c hoành và l y s logarit c a s l ng t bào s ng làm tr c tung s có th v đ căđ ngăcongăsinhătr ng c a các vi sinh v t sinh s n b ng cách phân
đôi.ă ngăcongănƠyăcóă4ăgiaiăđo n (phases) khác nhau.
Hìnhă2.2.ă ngăcongăsinhătr ng trong h th ng lên men kín
Khi c y vi sinh v t vào m tămôiătr ng m i s l ngăth ngăkhôngăt ngălênă
ngay,ăđóălƠăgiaiăđo n ti m phát hay pha lag.ăSauăđó,ăviăsinhăv t b tăđ uăsinhătr ng,
s l ng t bƠoăt ngăd n,ăgiaiăđo n này g i là pha log. Theo th i gian, ngu n dinh
d ngătrongămôiătr ng tr nên c n ki t cùng v i s tíchăl yăc aăđ c ch t. S t ngă tr ng d ng l iăvƠăđiăvƠoăphaă năđ nh, trong pha này s l ng t bào s ng là không
thayăđ i (stationary phase). N u ti p t c nuôi c y, các t bào b tăđ u ch tăvƠăđiăvƠoă
pha suy tàn (death phase).
M i lo i vi khu n l iăcóăđ ngăcongăt ngătr ngăriêng,ădoăđóăc n ph i kh o
sátăđ ngăcongăt ngătr ng c a ch ng vi khu năđangăquanătơmăđ xácăđ nhăđ c
th i gian thu nh n s n ph m thích h p. (Nguy năThƠnhă t, 2011) 2.3.5.2 Ti n hành
ứ Ho t hóa gi ng: vi khu năđ c ho t hóa b ng cách l y m t ít sinh kh i t
môiătr ng th ch nghiêng NA vào ng nghi m ch a 20 mL môi tr ng NB,
37oC/ 18 gi .
ứ i u ch nh d ch khu năđ t giá tr OD có m tăđ t bào kho ng 108 t bào/
mL.ăSauăđóăb sung vào 20 mLămôiătr ng kh o sát trong bình erlen 100 mL v i t l b sung 1/ 20 theo th tích. d ch khu n 37oC, t căđ l c 200 vòng/ phút. (Chen và cs. , 2007; Ghribi và cs., 2011)
ứ Theo dõi s t ngătr ng c a vi sinh v t kh o sát trong 0 gi , 6 gi , 12 gi , 18 gi , 24 gi , 30 gi , 36 gi , 42 gi , 48 gi , 54 gi , 60 gi và 72 gi b ng
cáchăđoăOD610đ xácăđnh m tăđ t bào.
ứ S d ngăđ ng t ngăquanăgi a m tăđ t bào và OD610 đ suy ra m tăđ t
bào t i các giá tr ODăt ngă ng t i m i th iăđi m kh o sát.
ứ Xây d ngăđ th bi u di năđ ngăcongăt ngătr ngăxácăđnh th iăgianăt ngă tr ng t iă uăc a Bacillus sp. T3 b ng ph n m m Excel c a Microsoft.
2.3.6 Ch n l a các y u t nh h ng t i ho t tính ch t kháng n m
c a ch ng Bacillus sp. T3
2.3.6.1 Ch n l ngu n nit
Các ngu nă nit đ c kh o sát là: b tă đ u nành, pepton, amoni sunphat ((NH4)2SO4), amoni nitrat (NH4NO3), amoni clorua (NH4Cl), v i kh iăl ng kh o
sátăđ c trình bày trong b ng 2.1 (Wang và cs., 2008; Cao và cs., 2010; Shrivastava và cs., 2013; Song và cs., 2013).
B ng 2.1. Các ngu nănit ă h o sát
Ngu nănit Kh iăl ngă h oăsátă(g/ L)
tăđ uănƠnhăă 3
Pepton 10
Amoni sunphat ((NH4)2SO4) 8
Sodium nitrat (NaNO3) 5
Amoni nitrat (NH4NO3) 6
Amoni clorua (NH4Cl) 8
Môiă tr ng lên men ch n l c ngu n nit t iă uă g m có K2HPO4 1 g/ L,
MgSO4 0,5 g/ L, glucose 10 g/ L, nhi tăđ 30oC, pH 7, và ngu n nit c n kh o sát.
2.3.6.2 Sàng l c ngu n cacbon
Các ngu n cacbonă đ c s d ng: fructose, glucose, lactose, manitol, tinh b t, b t b p, m t r đ ng. N ngăđ t t c các ngu n cacbon b sung là 20 g/ L.
Môiă tr ng ch n l c ngu n cacbon t iă uă baoă g m: K2HPO4 (1 g/ L) và MgSO4 (0,5 g/ L), ngu nănit ăt iă uăv i kh i l ng 10 g/ L, nhi tăđ 30oC, pH 7, và ngu n cacbon kh o sát. (Wang và cs., 2008; Cao và cs., 2010; Shrivastava và cs., 2013; Song và cs., 2013)
2.3.6.3 Ch n l ngu n khoáng
Các ngu năkhoángăđ c s d ng: FeSO4, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, CaCO3, MnSO4, n ngăđ t t c ngu n khoáng b sung là 0,1%.
Môiătr ng ch n l c ngu n khoáng t iă uăbaoăg m: ngu n cacbon t iă uă(10ă
g/ L) và ngu n nit ăt iă uă(10ăg/ăL), nhi tăđ 30oC, pH 7, và ngu n khoáng kh o sát. (Wang và cs., 2008; Cao và cs., 2010; Shrivastava và cs., 2013; Song và cs., 2013)
2.3.6.4 Ch n l pH thích h p
Dãy pH kh o sát: pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9 (đi u ch nh pH b ng HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N).
Môiătr ng t iă uăbaoăg m: ngu n cacbon t iă uă(10ăg/ăL)ăvƠăngu nănit ăt i
uă(10ăg/ăL), ngu n khoáng t iă uă(0,1%),ănhi tăđ 30oC và pH kh o sát. (Wang và cs., 2008; Cao và cs., 2010; Shrivastava và cs., 2013; Song và cs., 2013)
2.3.6.5 Ch n l nhi t đ thích h p
Dãy nhi tăđ kh o sát: 30oC, 35oC, 40oC, 45oC, 50oC.
Môiătr ng t iă uăbaoăg m: ngu n cacbon t iă uă(10ăg/ăL)ăvƠăngu nănit ăt i
uă(10ăg/ăL), ngu n khoáng t iă uă(0,1%),ăpHăt iă u,ăvà nhi tăđ kh o sát. (Wang và cs., 2008; Cao và cs., 2010; Shrivastava và cs., 2013; Song và cs., 2013)
2.3.6.6 Ti n hành thí nghi m
Ho t hóa gi ng: vi khu năđ c ho t hóa b ng cách l y m t ít sinh kh i t
môiătr ng th ch nghiêng NA vào bình erlen ch aă20ămLămôiătr ng NB. Nuôi c y
l c 37oC/ 18 gi , t căđ l c 200 vòng/ phút (Chen và cs., 2007).
i uăch nhăd chăkhu năđ tăgiáătr ăOD610 cóăm tăđ ăt ăbƠoăkho ngă108 t ăbƠo/ă mL.ăSauăđóăb ăsungăvƠoă20ămLămôiătr ngăkh oăsátătrongăbìnhăerlenă100ămLăv iăt ă l ă1/ă20ătheoăth ătíchădùng.ăNuôiăc yăl că ă30oC,ăth iăgianăd aăvƠoăk tăqu ăxơyăd ngă đ ngăcongăho tătínhăch tăkhángăn m,ăt căđ ăl că200ăvòng/ăphút.ăSauăth iăgianănuôiă c y,ălyătơmă10000ăvòng/ăphútătrongă10ăphútăthuăd chăn i,ăl căquaămƠngăl că0,2 m.ă
(Shrivastava và cs., 2013)
DùngăqueăbôngăvôătrùngănhúngăvƠoăd chăn mă(đƣchu năb ănh ăm că2.3.2.3),ă épă queă trênă thƠnhă ngă choă ráoă n c,ă sauă đóă tr iă đ uă trênă b ă m tă đ aă môiă tr ngă PDA.ăL păl iă3ăl n,ăm iăl năxoayăđ aă60o,ăr iăđ ăchoăráoăm tăth chă(IngroffăvƠăcs., 1995). c l đ ng kính 6 mm trong b n th ch b ng d ng c ti t trùng.
Hút 50 µL d ch l c vi khu n cho vào m i l th ch. 30oC trong 4 ngày thì ti năhƠnhăđánhăgiáăkh n ngăkhángăn m gây b nh c a ch ng Bacillus sp. T3 b ng vi căđoăđ ng kính vòng kháng n m.
Thí nghi măđ c l p l i 3 l n. X lý th ng kê ANOVA m t y u t b ng
