Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây Neem (Azadirachta indica A. Juss)

BăGIÁOăDCăVẨăẨOăTO TRNGăIăHCăMăTP.ăHăCHệăMINH KHOAăCỌNGăNGHăSINHăHC  BÁO CÁO KHịAăLUN TTăNGHIP Tên đ tài: KHOăSÁTăHOTăTệNHăKHÁNGăKHUN,ă KHÁNG NMăGỂYăBNHăCA VIăKHUNăNIă SINH VÀ CAOăCHITăT CÂY NEEM (Azadirachta indica A. Juss) KHOAăCỌNGăNGHăSINHăHC CHUYểNăNGẨNH:ăNỌNGăNGHIPăậ DC GVHD: ThS.ăDngăNhtăLinh SVTH: BùiăVnăThin MSSV: 1053010721 Niên khóa: 2010 - 2014 Tp.ăHăChí Minh, tháng 5 nmă2014 Li cmăn  hoàn thành đ tài này, em xin gi li cm n đn các quý thy, cô khoa Công Ngh Sinh Hc, trng i hc M thành ph H Chí Minh đã ging dy và truyn đt kin thc c bn đ giúp em làm c s cho đ tài nghiên cu. Em xin gi lòng bit n chân thành và sâu sc đn cô Dng Nht Linh đã tn tình hng dn, đng viên, truyn đt nhng kin thc và kinh nghim quý báu, to mi điu kin thun li đ em hoàn thành tt trong sut thi gian thc hin đ tài này. Em xin cm n thy an Duy Pháp, ch Võ Ngc Yn Nhi, ch Nguyn Th M Linh và nhng ngi anh, ngi ch luôn ng h, giúp đ em trong lúc làm đ tài nghiên cu. Bên cnh đó, tôi xin cm n các bn ca tôi, các bn sinh viên phòng thí nghim công ngh vi sinh, hóa - môi trng đã đng viên giúp đ tôi trong sut quá trình thc hin đ tài. Cui cùng con xin cm n M, cm n gia đình đã luôn bên con, to mi điu kin tt nht đ con hoàn thành vic hc ca mình. Hoàn thành đ tài nghiên cu cùng vi nhng k nim đp và tôi đã hc hi thêm đc nhiu kinh nghim cng nh áp dng nhng kin thc đã hc trong nghiên cu. Em xin gi li chúc sc khe đn tt c ngi thy, ngi cô đáng kính khoa Công ngh sinh hc, Trng i Hc M TP. H Chí Minh, xin chúc thy cô ngày càng gt hái đc nhiu thành công. Tôi xin chúc các bn ca tôi s hoàn thành tt công vic hc tp ca mình ti trng và thành công trong cuc sng. Xin chân thành cm n. Sinh viên thc hin Bùi Vn Thin Tháng 5/2014 KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN i DANH MC CÁC T VIT TT ANOVA One-way analysis of variance C. albicans Candida albicans CFU Colony Forming Unit ậ năv hình thành khun lc Cs Cng s CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DMSO Dimethyl sulfoxid E. coli Escherichia coli MHA Muller Hinton agar M. gypseum Microsporum gypseum MIC Minimum Inhibitory Concetration ậ Nngăđ c ch ti thiu NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar S. aureus Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar SE Standard Error S. typhi Salmonella typhi TSA Trypticase Soy Agar T. rubrum Trichophyton rubrum T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN ii DANH MC HÌNH NH Hình 1.1. Cu trúc ca các hp cht có hot tính sinh hc t cây neem 12 Hình 2.1. Kt qu kháng vi khun, vi nm bngăphngăphápăkhuch tán qua ging thch 39 Hình 2.2. Th nghim MIC ca cao chit trong thch 41 Hìnhă3.1.ăcăđim cây neem (Azadirachta indica A. Juss) 53 Hình 3.2. Hình nhăquanăsátăđi th vi khun ni sinh t cây neem 56 Hình 3.3. Kt qu quan sát vi th chng KT1 phân lpăđc t cây neem 57 Hình 3.4. Kh nngăkhángăkhun ca cao chit t lá neem 60 Hình 3.5. Kh nngăkhángăkhun ca cao chit t v thân neem 63 Hình 3.6. Kh nngăkhángăkhun S. typhi ca các chng ni sinh t cây neem 64 Hình 3.7. Kh nngăkhángănm ca cao chit t lá neem 67 Hình 3.8. Kh nngăkhángănm ca cao chit t v thân cây neem 70 Hình 3.9. Kt qu kháng nm gây bnh ca mt s chng vi khun ni sinh t cây neem 72 Hình 3.10. Kt qu MIC ca mu cao chit t lá neem bng dung môi methanol kháng khun gây bnh 77 Hình 3.11. Kt qu MIC ca mu cao chit t v thân bng dung môi ethanol kháng vi nm gây bnh 78 KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN iii DANH MC BNG Bng 1.1. Mt s công dngădc liu trong các b phn ca cây neem 7 Bng 1.2. Mt s hp cht có trong cây neem và tác dngădc lý ca chúng 9 Bng 3.1. Khiălng cao chităthuăđc bng các dung môi khác nhau 53 Bng 3.2. Kt qu quanăsátăđi th vi khun ni sinh t cây neem 55 Bng 3.3. Kt qu quan sát vi th vi khun ni sinh t cây neem 56 Bngă3.4.ăng kính vòng vô khun ca cao chit t lá neem 58 Bngă3.5.ăng kính vòng vô khun ca cao chit t v thân neem 61 Bng 3.6. Kt qu đnh tính kh nngăkhángăviăkhun gây bnh ca vi khun ni sinh t cây neem 63 Bng 3.7. Kt qu đng kính kháng nm ca cao chit t lá neem 65 Bng 3.8. Kt qu đng kính kháng nm ca cao chit t v thân cây neem 68 Bng 3.9. Kt qu đnh tính kh nngăkhángăviănm gây bnh ca vi khun ni sinh t cây neem 70 Bngă3.10.ăng kính vòng kháng nm gây bnh ca vi khun ni sinh t cây neem 72 Bng 3.11. Kt qu nngăđ c ch ti thiu (MIC) ca cao chit t lá cây neem kháng các chng vi sinh vt gây bnh 73 Bng 3.12. Kt qu nngăđ c ch ti thiu (MIC) ca cao chit t v thân cây neem kháng các chng vi sinh vt gây bnh 75 Bng 3.13. Kt qu đnh danh sinh hóa chng ni sinh KT2 79 KHÓA LUN TT NGHIP DANH MC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN iv DANH MCăSă Săđ 2.1. Quy trình thí nghim 32 Săđ 2.2. Quy trình chun b và chit xutăcaoădc liu 35 DANH MC BIUă Biuăđ 3.1. nhăhng caădungămôiăđn khiălng cao chităthuăđc t lá và v thân neem 54 Biuăđ 3.2. So sánh kt qu kháng khun ca các loi cao chit t lá neem 59 Biuăđ 3.3. So sánh kt qu kháng khun ca các loi cao chit t v thân neem 62 Biuăđ 3.4. So sánh kt qu kháng nm ca các loi cao chit t lá neem 66 Biuăđ 3.5. So sánh kt qu kháng nm ca các loi cao chit t v thân neem 69 KHÓA LUN TT NGHIP MC LC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN v MC LC DANH MC CÁC T VIT TT i DANH MC HÌNH NH ii DANH MC BNG iii DANH MCăSă iii DANH MC BIUă iv MC LC v T VNă 1 PHN I: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. TNG QUAN V NGUYÊN LIU 4 1.1.1. Gii thiu chung v cây neem (Azadirachta indica A. Juss) 4 1.1.2. Thành phn hóa hc và các cht có hot tính t cây neem 8 1.1.3. Sălc v vi sinh vt ni sinh 12 1.2. TNG QUAN V MT S VI KHUN GÂY BNHăTRểNăNGI 13 1.2.1. Staphylococcus aureus 13 1.2.2. Escherichia coli 14 1.2.3. Salmonella typhi 15 1.2.4. Pseudomonas aeruginosa 16 1.3. TNG QUAN V MT S VI NM GÂY BNHăTRểNăNGI 17 1.3.1. Candida albicans 17 1.3.2. Dermatophytes 19 1.4. KHÁI QUÁT V PHNGăPHÁPăCHITăCAOăDC LIU 21 1.4.1. K thut chit ngm kit (Percolation) 22 1.4.2. K thut chit ngâm dm (Maceration) 23 1.4.3. K thut chit Sohxlet 23 1.4.4. Côăđc và sy khô 24 KHÓA LUN TT NGHIP MC LC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN vi 1.5. KHÁI QUÁT V PHNGăPHÁPăTH HOT TÍNH KHÁNG KHUN, KHÁNG NM 25 1.5.1. Phngăphápăkhuch tán 25 1.5.2. Phngăphápăphaăloƣngăliênătip 26 1.5.3. Mô hình sàng lc tác dng kháng vi sinh vt ca cao chită dc liu theo Mitscher & cs. 27 PHN II: VT LIUăVẨăPHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 29 2.1. VT LIU 30 2.1.1. aăđim và thi gian nghiên cu 30 2.1.2. iătng nghiên cu 30 2.1.3. Thit b, dng c, hóa chtăvƠămôiătrng 30 2.2. PHNGăPHÁPăNGHIểNăCU 32 2.2.1. B trí thí nghim 32 2.2.2. Xácăđnh tên khoa hc ca cây thuc 33 2.2.3. Quy trình thu nhn và x lý mu 33 2.2.4. Quy trình chit xutăcaoădc liu và phân lp vi khun ni sinh t cây neem 34 2.2.5. nh tính kh nngăkhángănm, kháng khun gây bnh 37 2.2.6. Xácăđnh nngăđ c ch ti thiu (MIC) ca cao chit vi vi khun và vi nm gây bnh 40 2.2.7. nh danh vi khun ni sinh bng test sinh hóa 43 PHN III: KT QU VÀ THO LUN 51 3.1. KT QU GIÁMăNH TÊN KHOA HC CA CÂY 52 3.2. KT QU CHITăCAOăDC LIU VÀ PHÂN LP VI KHUN NI SINH T CÂY NEEM 53 3.2.1. Kt qu kho sát nhă hng ca dung môi chită đn khiă lng cao chităthuăđc t lá và v thân cây neem 53 3.2.2. Kt qu phân lp vi khun ni sinh t cây neem 55 KHÓA LUN TT NGHIP MC LC SVTH:ăBỐIăVNăTHIN vii 3.3. KT QU NH TÍNH KH NNGăKHÁNGăNM, KHÁNG KHUN 58 3.3.1. Kt qu đnh tính kh nngăkhángăviăkhun gây bnh 58 3.3.2. Kt qu đnh tính kh nngăkháng vi nm gây bnh 64 3.4. KT QU XÁCă NH NNGă  C CH TI THIU (MIC) CA CAO CHIT 73 3.5. KT QU NH DANH SINH HÓA CHNG VI KHUN NI SINH 79 Phn IV: KT LUNăVẨă NGH 80 4.1. KT LUN 81 4.2. KIN NGH 83 TÀI LIU THAM KHO 84 PH LC 90 KHÓA LUN TT NGHIP T VNă SVTH:ăBỐIăVNăTHIN 1 T VNă Vit Nam nm trong khu vc nhităđi nóng m,ăngi dân tip xúc nhiu vi bùnăđt mătăkéoădƠiăchínhălƠăđiu kin thun li cho các loài vi khun, vi nm phát trin mnh, các bnh v da và niêm mc do nm, nhim trùng do vi khun gây ra ngày càng ph bin và nghiêm trng (Nguyn Th Sinh, 1983; Al-Alawi và cs., 2005). Bên cnhăđó,ăvic s dng thucăđ tr bnh ngày càng gia tng,ăphngăphápăcha tr hin nay ch yu là dùng kháng sinh nên dnăđn tình trng kháng thuc ca vi sinh vt (Trn Xuân Thuyt, 2011). Mt trong nhngăhng nghiên cu tác nhân kháng nm, kháng khun mi là tìm các hp cht có ngun gc t thc vt. Hin nay cùng vi s phát trin ca y hc, các bài thuc t thc vtăđc s dngăđ cha bnh ngày càng nhiu. Bên cnhăđó,ămt s nghiên cuătrcăđơyăđƣăchoăthy rng, vi khun ni sinh thc vt có kh nngăsinhăraă các cht có kh nngăng dng đ sn xutăkhángăsinh,ăđóălƠăngun cht kháng khun, kháng nm có timănngăquan trng dùng cho vic phòng tr các loi nm và vi khun gây bnh (Ryan và cs., 2008). Các loài thc vt này có trong t nhiên, d kim li ít có nhng tác dng ph choăconăngi,ădoăđóăđƣăthuăhútăs quan tâm ca các nhà nghiên cuăhóaăsinhăvƠăyădc hcătrongăncăcngănhătrênăth gii (Võ Th MaiăHng,ă 2009). Trong rt nhiu thc vtă đc s dng vi mcă đíchă cha bnh, cây neem (Azadirachta indica A. Juss) là mt loi thoădc an toàn cho s dngătrongăđiu tr nhiu loi bnh ttăđƣăvƠăđangăđcăquanătơm.ăNeemăđcăngi nă s dngăđu tiênă đ h tr sc khe t 4.500ă nmă trcă đơy.ă LoƠiă cơyă nƠyă mc hoang và trng nhiu  các tnh min Nam Trung B nhăBìnhăThun, Ninh Thun. Nhng hp cht đc chit xut t neemănhănimbin,ănimbinon,ămargocin,ăazadirachtin, ăcóătácădng kháng siêu vi, kháng nm, kháng khun, chngăst,ăchng viêm, chng khi u, gim đau,ălƠmăm soăvƠătngăcng min dch (Võ Quang Yn, 1996; Conrick, 2001).ăNmă [...]... khoa h c v cây neem r t ít Vì v y, nh m phát huy và phát tri n ngu n nguyên li u s chúng tôi th c hi c, k t h p gi a y h c c truy n và y h c hi tài: i, o sát ho t tính kháng vi khu n, vi n m gây b nh c a vi khu n n i sinh và cao chi t t cây neem (Azadirachta indica M c tiêu: Nghiên c u ho t tính kháng vi khu n, vi n m gây b nh c a vi khu n n i sinh và cao chi t t cây neem (Azadirachta indica A Juss) N... (Azadirachta indica A Juss) N i dung th c hi n bao g m: Chi t xu c li u t lá và v thân cây neem Th nghi m ho t tính kháng khu n, kháng n m gây b nh t cao chi t lá và v thân neem nh n c ch t i thi u c c li u t lá và v thân neem v i vi khu n, vi n m gây b nh Phân l p và kh o sát ho t tính kháng khu n, kháng n m c a vi khu n n i sinh t cây neem N 2 KHÓA LU N T T NGHI P T NG QUAN TÀI LI U PH N I: T NG QUAN TÀI... T NGHI P TV u cao chi t lá neem b c, ethanol và u cho th y ho t tính kháng 10 ch ng vi khu n gây b Hashmat và c ng s o sát cao chi t cây neem b ng methanol có kh Bacillus subtilis v c ch s c u cao chi t lá neem b ng n-hexan c ch Salmonella typhi và Candida albicans v i ng kính c ch 17 mm và 28 mm 2009, Verma ch ng x khu n n i sinh t cây neem có kh c ch c 55 c 54,4 % ho ng c a vi khu n và n m b nh c... nh và th m chí c ng v c v t H t c các loài th c v t (kho ng 400.000) ch a m t ho c nhi u vi sinh v t n i sinh (Khan, 2007) Chúng sinh s ng ph n l n các cây kh e m nh, trong các mô khác nhau, h t, r , thân, cành và lá Th c v t ký ch ích r ng rãi b il i ng nh ng vi sinh v t n i sinh này, và các vi sinh v t n i kháng các tác nhân gây b nh khác nhau b ng cách s n xu t kháng sinh cho th c v t ký ch Vi sinh. .. xu t t cây neem thì azadirone và các d n xu t c a nó, nimbin, salannin, meliantriol, nimbidin gi vai trò ch l c trong vi c th hi n ho t tính sinh h c M i ch ng th c và hi u qu d ch chi t t cây neem có ph c báo cáo là có kh ng r n nay các ho t ch t t cây neem m soát trên 400 loài sinh v (vi n m, vi khu n, virus) gây b nh th c v iv nhi ng khác nhau Vì v y các t ng v t Các ho t ch t t cây ng v ng và vô... chu l p l i và tính liên thông gi a các phòng thí nghi m trong c áp d ng trên th gi i: Các tiêu chu n v c s d ng: nh ho t tính kháng n m men: CLSI, 2008, M27 A3 nh ho t tính kháng n m s i: CLSI, 2008, M38 A2 nh ho t tính kháng khu n c a vi khu n hi u khí: CLSI, 2009, M7-A8 1.5.3 Mô hình sàng l c tác d ng kháng vi sinh v t c a cao chi c li u theo Mitscher và cs Ch t kháng vi sinh v l n cao chi c li... (16) Hình 1.1 C u trúc c a các h p ch t có ho t tính sinh h c t cây neem 1.1.3 c v vi sinh v t n i sinh Vi sinh v t n i sinh (Endophyte) là thu t ng ch các sinh v t trong toàn b ho c m t ph n chu k s ng c n xâm nh p vào các mô c a th c v t gây nhi m trùng không có bi u hi n thành tri u ch ng (Khan, 2007) N 12 KHÓA LU N T T NGHI P T NG QUAN TÀI LI U Vi sinh v t n có kh c s chú sau khi phát hi c chúng... lá, B nh v máu, r i lo n m t, ng a, loét da, b ng và b nh hoa và trái phong 1.1.1.5 c tính H p ch c trích t h t neem có tính h s t và tr s c Bình và Ph m Bách Cúc, 1996) ng s u v ho t tính sinh h c c a cây neem cho th y d ch chi t b ng chloroform c a v carrageenin gây ra phù n chân có tác d ng h u h s t th c ch ng thân cây có tác d ng ch ng chu t và vi m tai chu t, chi t xu t t methanol c a lá c Bên... g phân bi t v c tr ng ph bi n t i Vi t Nam Cây neem thích h p ng t t Ninh Thu n, Bình Thu n Ông nh, 1991) i và c n nhi c bi t cây sinh cao kho ng 1000 m, tính t m c o R cái m c sâu, có th dài g p hai l n chi u cao c a cây (Lâm nh, 1991) 1.1.1.3 m hình thái Neem là cây thân g n 20 m, u ki n thích h p có th cao t i 40 m, ch u h n t t Nhánh cây r ng kính kho ng 15 Thân cây th ng, v c 20 m i dày, xù xì,... Mahmoodin (5) Kháng khu n h t Gallic acid (6), epicatechin (7) và catechin (8) V cây Ch u hòa mi n d ch Margolone (9), margolonone (10) và V cây Kháng khu n Lá cây Kháng n m isomargolonone (11) Cyclic trisulphide (12) và cyclic tetrasulphide (13) Polysaccharides Ch ng vi m Polysaccharides GIa (14), Gib Polysaccharides GIIa (15), GIIIa (16) NB-II peptidoglycan S trong ngo V cây Ch iu V cây Ch ng vi m V cây u . Azadirachtia indica A. Juss (Biswas và cs., 2002). Cóăbaăcơyătngăt vi cây Azadirachta indica A. ăJussăđóălƠ:ăMelia azadirachta L., Melia indica và Antelaca azadirachta.ăNgiătaăthng hay. hot tính kháng vi khun, vi nm gây bnh c a vi khun ni sinh và cao chit t cây neem (Azadirachta indica A. Juss).  Ni dung thc hin bao gm: Chit xutăđc cao dc liu t lá và v. Clinical Laboratory Standards P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar S. aureus Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar SE Standard Error S. typhi Salmonella