Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu tô mộc (caesalpinia sappan l )

BỘ GIÁO DỤC – ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU TÔ MỘC (Caesalpinia sappan L.) Chuyên ngành: Vi sinh – SHPT GVHD: ThS Dương Nhật Linh SVTH: Nguyễn Thời Thịnh MSSV: 1153010789 Khóa: 2011 – 2015 Bình Dương, tháng 05 năm 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH LỜI CẢM ƠN Sau ngày khóa luận tốt nghiệp vừa qua, em nhận nhiều kiến thức, kinh nghiệm thực hành nhờ vào giúp đỡ dạy nhiệt tình cô, chị để em hoàn thành tốt phần thực tập Nay em xin gửi lời tri ân tới: Cô Dương Nhật Linh giành nhiều thời gian, tâm huyết, trực tiếp truyền đạt cho em nhiều kiến thức bổ ích, tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành tốt đợt thực tập Các thầy cô thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học – Ngành vi sinh, SHPT – Trường ĐH Mở TP.HCM truyền dạy cho em kiến thức tảng để em vận dụng tập Chị Nguyễn Thị Mỹ Linh quan tâm, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm quý báu thực hành hết lòng giúp đỡ em hoàn thành phần thực tập Bên cạnh đó, xin cảm ơn bạn tôi, bạn sinh viên phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh – sinh học phân tử động viên giúp đỡ suốt trình thực đề tài Lời tri ân cuối xin chân thành gửi tới cha mẹ chỗ dựa vững cho con, tạo điều kiện tốt đường học tập phát triển Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày gặt hái nhiều thành công công việc sống Xin chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày 05 tháng 05 năm 2015 SVTH Nguyễn Thời Thịnh SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH ThS DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT I DANH MỤC BẢNG II DANH MỤC HÌNH ẢNH III DANH MỤC SƠ ĐỒ IV DANH MỤC BIỂU ĐỒ IV ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) 1.1.1 Vị trí phân loại tô mộc 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố, trồng trọt thu hái 1.1.4 Tác dụng trị liệu theo kinh nghiệm nhân gian 1.1.5 Dược tính 1.1.6 Nghiên cứu hóa học 1.2 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 12 1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI 12 1.3.1 Escherichia coli 12 1.3.2 Salmonella typhi 13 1.3.3 Pseudomonas aeruginosa 14 1.3.4 Staphylococcus aureus 15 1.4 KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CAO DƯỢC LIỆU 16 1.4.1 Các loại cao dược liệu 16 1.4.2 Kỹ thuật chiết Soxhlet 16 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI 19 1.5.1 Thế giới 19 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH 1.5.2 Trong nước 20 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU 22 2.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất môi trường 22 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Bố trí thí nghiệm 23 2.2.2 Xác định tên khoa học thuốc 25 2.2.3 Quy trình thu nhận xử lý mẫu 25 2.2.4 Phân lập làm vi sinh vật nội sinh 26 2.2.5 Khảo sát đại thể vi thể chủng vi khuẩn nội sinh phân lập 26 2.2.6 Định tính khả kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh từ tô mộc (Caesalpinia sappan L.) 27 2.2.7 Định lượng khả kháng khuẩn, kháng nấm dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc (Caesalpinia sappan L.) 29 2.2.8 Phương pháp chiết xuất cao dược liệu từ tô mộc (Caesalpinia sappan L.) 31 2.2.9 Thử giới hạn nhiễm khuẩn cao chiết 33 2.2.10 Khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết từ tô mộc (Caesalpinia sappan L.) 34 2.2.11 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khuẩn gây bệnh 35 2.2.12 Định danh vi khuẩn nội sinh test sinh hóa 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) 46 3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH 46 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY TÔ MỘC (CAESALPINIA SAPPAN L.) 50 3.3.1 Kết định tính khả kháng khuẩn vi sinh vật nội sinh từ tô mộc 50 3.3.2 Kết định lượng khả kháng khuẩn dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 53 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY TÔ MỘC(CAESALPINIA SAPPAN L.) 56 3.4.1 Kết định tính khả kháng nấm vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 56 3.4.2 Kết định lượng khả kháng nấm dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 57 3.5 ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CAO NHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ CÂY TÔ MỘC 60 3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI LƯỢNG CAO CHIẾT THU ĐƯỢC TỪ CÂY TÔ MỘC 61 3.7 KẾT QUẢ THỬ GIỚI HẠN NHIỄM KHUẨN CỦA CAO CHIẾT 63 3.8 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CAO CHIẾT TỪ CÂY TÔ MỘC 64 3.9 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT 66 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 4.1 KẾT LUẬN 70 4.2 ĐỀ NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 79 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc Cs Cô ̣ng sự E coli Escherichia coli M canis Microsporum canis M gypseum Microsporum gypseum MHA Muller Hinton agar MRSA Methicillin – resistant Staphylococcus aureus vi khuẩn gram dương mọc thành cụm chùm nho, tăng trưởng MRSA không bị ức chế methicillin, oxacillin nhiều kháng sinh khác MIC Minimum Inhibitory Concetration – Nồng độ ức chế tối thiểu NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NXB Nhà xuấ t bản P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S aureus Staphylococcus aureus S typhi Salmonella Typhi T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes T rubrum Trichophyton rubrum TSA Trypticase Soy Agar SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH i KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Ưu nhược điểm phương pháp chiết Soxhlet 17 Bảng 2.1 Nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh chất thử (MIC) 36 Bảng 3.1 Kết quan sát đại thể vi thể vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 46 Bảng 3.2 Kết định tính khả kháng vi khuẩn bệnh vi khuẩn nội sinh 51 Bảng 3.3 Kết định lượng khả kháng khuẩn gây bệnh dịch lọc vi khuẩn nội sinh (mm) 53 Bảng 3.4 Kết định tính khả kháng nấm bệnh vi khuẩn nội sinh 56 Bảng 3.5 Kết định lượng khả kháng nấm bệnh dịch lọc vi khuẩn nội sinh (mm) 58 Bảng 3.6 Kết định danh sinh hóa chủng nội sinh 61 Bảng 3.7 Khối lượng cao chiết thu dung môi khác 62 Bảng 3.8 Kết số lượng nấm vi khuẩn sống lại cao chiết từ tô mộc 63 Bảng 3.9 Đường kính vòng kháng khuẩn cao chiết từ tô mộc 64 Bảng 3.10 Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết từ vỏ thân tô mộc kháng chủng vi sinh vật gây bệnh (µg/ mL) 67 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái giải phẫu tô mộc Hình 1.2 Cấu trúc hợp chất có hoạt tính sinh học từ tô mộc 11 Hình 1.3 Túi chứa dược liệu chiết Soxhlet 18 Hình 2.1 Kết vòng kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh 29 Hình 2.2 Kết kháng vi khuẩn, vi nấm phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 31 Hình 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu thân (A) rễ (B) tô mộc (C) Đĩa đối chứng 48 Hình 3.2 Kết quan sát đại thể vi thể vi khuẩn VT8 nội sinh 49 Hình 3.3 Kết quan sát đại thể vi thể vi khuẩn VT6 nội sinh 49 Hình 3.4 Kết khả thử đối kháng chủng vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 52 Hình 3.5 Kết định lượng vòng kháng vi khuẩn gây bệnh dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 54 Hình 3.6 Kết định lượng vòng kháng vi nấm gây bệnh dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 59 Hình 3.7 Kết nhuộm gram hình thái khuẩn lạc môi trường NA chủng VT7 60 Hình 3.8 Khả kháng khuẩn cao chiết từ tô mộc 66 Hình 3.9 Kết MIC mẫu cao chiết từ tô mộc dung môi ethanol kháng khuẩn gây bệnh 67 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình thí nghiệm 24 Sơ đồ 2.2 Quy trình chuẩn bị chiết xuất cao dược liệu 32 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 So sánh khả kháng khuẩn dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 54 Biểu đồ 3.2 So sánh khả kháng nấm dịch lọc vi khuẩn nội sinh từ tô mộc 58 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng dung môi đến khối lượng cao chiết thu từ thân tô mộc 62 Biểu đồ 3.4 Kết kháng khuẩn loại cao chiết từ tô mộc 65 SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH ThS DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC PHỤ LỤC MÔI TRƯỜNG  Môi trường NA (Nutrient agar) Cao thịt 5g Peptone 10 g NaCl 5g Agar 15 g Nước cất 1000 mL  Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar) Trypticase pepton 15 g Thytone pepton 5g NaCl 5g Agar 18 g Nước cất 1000 mL pH = 7,3 HÓA CHẤT – THUỐC NHUỘM  Crystal violet Crystal violet Cồn 96o 0,4 g A Phenol Nước cất 10 mL 1g B SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 100 mL 79 ThS DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Lưu ý: trộn hai dung dịch A B lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng  Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 mL Lưu ý: hòa tan g KI vào mL nước cất, sau thêm g Iod Chờ cho Iod tan hết thêm nước vừa đủ 300 mL  Safranin O Safranin O (dung dịch % cồn 96o) 25 mL Nước cất 75 mL Lưu ý: bảo quản chai màu SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 80 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH PHỤ LỤC Kết định danh 2.1 Định danh Bacillus sp theo khóa phân loại Cowan and Steel SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 81 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH 2.2 Hình ảnh định danh chủng vi khuẩn nội sinh VT7 Thử nghiệm oxidase Thử nghiệm phân giải tinh bột Thử nghiệm phân giải casein SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH Thử nghiệm catalase Thử nghiệm kị khí Thử nghiệm citrate 82 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Thử nghiệm di động (+) Thử nghiệm NaCl 10 % SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH ThS DƯƠNG NHẬT LINH Thử nghiệm nitrate Thử nghiệm VP 83 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH MANNOSE Các thử nghiệm lên men đường SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 84 ThS DƯƠNG NHẬT LINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Kết xử lí thống kê Kết đường kính vòng kháng khuẩn gây bệnh vi khuẩn nội sinh từ tô mộc thử nghiệm  Kết đường kính vòng kháng S aureus (mm)  Kết đường kính vòng kháng S typhi (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 85 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính kháng khuẩn E coli (mm) Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khả kháng vi khuẩn gây bệnh chủng vi khuẩn nội sinh từ tô mộc phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đường kính kháng khuẩn S Aureus (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 86 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính kháng khuẩn S typhi (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 87 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính kháng khuẩn E coli (mm) Kết đường kính vòng kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh từ tô mộc thử nghiệm  Kết đường kính vòng kháng T rubrum (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 88 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính vòng kháng Microsporum gypseum (mm) Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khả kháng nấm gây bệnh chủng vi khuẩn nội sinh từ vỏ thân tô mộc phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đường kính vòng kháng T rubrum (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 89 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH  Kết đường kính vòng kháng Microsporum gypseum (mm)  Kết khối lượng cao chiết thu từ tô mộc dung môi chiết xuất SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 90 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khối lượng cao chiết thu dung môi chiết phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 Kết đường kính vòng kháng khuẩn gây bệnh cao chiết từ thân tô mộc thử nghiệm  Kết đường kính vòng kháng S aureus (mm) SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 91 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính vòng kháng S typhi (mm) Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khả kháng khuẩn gây bệnh cao chiết từ thân tô mộc phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đường kính kháng khuẩn S aureus SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 92 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  ThS DƯƠNG NHẬT LINH Kết đường kính kháng khuẩn S typhi SVTH: NGUYỄN THỜI THỊNH 93 ... cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh cao chiết từ tô mộc Caesalpinia sappan L  Nô ̣i dung nghiên cứu: - Phân lập khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội. .. nguyên liệu sẵn có nước, kết hợp y học cổ truyền y học đại, thực đề tài: “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƯỢC LIỆU TÔ MỘC (Caesalpinia sappan L.) ... làm vi sinh vật nội sinh 26 2.2.5 Khảo sát đại thể vi thể chủng vi khuẩn nội sinh phân lập 26 2.2.6 Định tính khả kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh từ tô mộc (Caesalpinia sappan L.)