Nghiên cứu chiết xuất cao chiết giàu hoạt chất từ lá nhàu (morinda citrifolia l )

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN THÙY DIỄM THẢO NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT GIÀU HOẠT CHẤT TỪ LÁ NHÀU (MORINDA CITRIFOLIA L.) Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số: 60520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN MINH Cán chấm nhận xét : TS Hoàng Thị Kim Dung Cán chấm nhận xét : TS Hà Cẩm Anh Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 01 năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) CT: PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan PB1: TS Hoàng Thị Kim Dung PB2: TS Hà Cẩm Anh UV: PGS.TS Trần Văn Hiếu UV, TK: TS Lê Xuân Tiến Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Thùy Diễm Thảo MSHV: 1670202 Ngày, tháng, năm sinh: 12/07/1992 Nơi sinh: Long An Chuyên ngành: Kỹ thuật hoá học Mã số: 60520301 TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT GIÀU HOẠT I CHẤT CÓ TÁC DỤNG LÀM LÀNH VẾT THƯƠNG TỪ LÁ NHÀU (MORINDA CITRIFOLIA L.) • NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG - Khảo sát điều kiện chiết xuất dược liệu dựa hàm lượng hoạt chất hoạt tính sinh học II - Chiết xuất cao chiết tiềm từ Nhàu với điều kiện tối ưu - Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cao chiết tiềm từ Nhàu - Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết tiềm từ Nhàu NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: IV CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Lê Văn Minh TP.HCM, ngày tháng năm CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA LỜI CẢM ƠN Trong năm ho ̣c tâ ̣p và rèn luyê ̣n ta ̣i Trường ĐH Bách Khoa TP.HCM, cùng với sự giảng da ̣y nhiê ̣t tı̀nh và tâ ̣n tâm của quý Thầ y Cô, đă ̣c biê ̣t là quý thầ y cô khoa Kĩ Thuật Hóa Học đã truyề n đa ̣t những kiế n thức quý báu cùng với sự tâm huyế t, nhiê ̣t tın ̀ h và tâ ̣n tâm dành cho chúng em đó không chı̉ là những kiế n thức mà còn là kinh nghiê ̣m và là hành trang cho tương lai chúng em sau này Nế u không có những lời hướng dẫn, da ̣y bảo của các thầ y cô em khó có thể hoàn thành tố t đươ ̣c luận văn này Luận văn thực hiê ̣n khoảng thời gian tháng vı̀ vâ ̣y khó có thể tránh khỏi những sai sót, em mong nhâ ̣n đươ ̣c những ý kiế n đóng góp quý báu của Thầ y Cô để em có thể hoàn thiê ̣n đươ ̣c kiế n thức cùng với bài luâ ̣n văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắ c đế n Thầ y Lê Văn Minh, thầ y đã ta ̣o điề u kiê ̣n cho em có đươ ̣c môi trường làm viê ̣c tố t nhấ t cùng với những kinh nghiê ̣m quý giá và sự hỗ trơ ̣ của thầ y đã giúp em hoàn thành tố t bài luâ ̣n văn ta ̣i Trung tâm Sâm và Dươ ̣c liê ̣u TP.HCM Em xin gửi lời cám ơn chân thành đế n các anh chi ̣ nhân viên phòng Sinh ho ̣c phân tử đã dành nhiề u thời gian giúp đỡ, hướng dẫn và củng cố thêm kiế n thức cho em quá trı̀nh làm luâ ̣n văn tố t nghiê ̣p của mı̀nh Cuố i cùng em xin kı́nh chúc quý Thầ y Cô có đươ ̣c sức khỏe dồ i dào và đa ̣t đươ ̣c nhiề u danh hiê ̣u cao quý công viê ̣c Và kın ́ h chúc các Cô, Anh, Chi ̣trong Trung Tâm Sâm và Dươ ̣c liê ̣u TP.HCM có sức khỏe dồ i dào và thành công công viê ̣c Học viên Nguyễn Thùy Diễm Thảo i TÓM TẮT LUẬN VĂN Cây Nhàu (Morinda citrifolia L.) là loài có từ lâu đời đươ ̣c sử du ̣ng để chữa mô ̣t số bê ̣nh dân gian và phận Nhàu rễ, thân, lá, dùng thực phẩm chức với nhiều hoạt chất sinh học, tính sinh dược học cao Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao Nhàu gồm thể tích dung mơi, nhiệt độ thời gian chiết Thí nghiệm bố trí theo kiểu trực tâm quay (Rotatable Central Composite Design) ma trận thí nghiệm xây dựng phần mềm Design–Expert 11.0 Tiêu chí đánh giá dựa hàm lượng flavonoid tồn phần, hoạt tính kháng khuẩn kháng viêm Xác đinh ̣ hàm lươ ̣ng flavonoid toàn phầ n bằ ng phương pháp cân và UV-Vis theo chuẩ n rutin; đánh giá khả kháng ba dòng vi khuẩ n Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Staphylococus aureus bằ ng phương pháp khuế ch tán qua giế ng tha ̣ch; đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro Kế t quả cho thấ y hiê ̣u suấ t chiế t cao đa ̣t 21,218% Hàm lươ ̣ng flavonoid nguyên liê ̣u đa ̣t 0,715 mg /g và mẫu cao chiế t đa ̣t 2,227 mg /g phương pháp UV-Vis Cao chiế t Nhàu có khả kháng đố i với ba dòng vi khuẩ n Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Staphylococus aureus ở các nờ ng ̣ khảo sát Hoạt tính kháng viêm cao chiết Nhàu IC50 = 70,209 μg/mL Như vâ ̣y, Nhàu có chứa hơ ̣p chấ t flavonoid và là nguồ n dươ ̣c liê ̣u quý giá để ta ̣o các sản phẩm thiên nhiên ứng dụng tốt đời sống sau Từ khoá: Nhàu, phần mềm Design–Expert 11.0, flavonoid, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa ii ABSTRACT Morinda citrifolia L is a long-standing plant used to treat some diseases in folk medicine and parts of the tree, such as roots, stems, leaves and fruits, also used as a functional food Many biological active ingredients, high biopharmaceuticals In this study, Morinda citrifolia L leaf were extracted with 70% ethanol Response Surface Methodology was chosen to optimize the leaf extraction condition Rotatable Central Composite Design and Experimental matrix were constructed using Design-Expert 11.0 software to select the optimum high-extraction conditions from the leaf Determination of total flavonoid content by weight and UV-Vis Spectroscopy method based on rutin standard, evaluation of resistance to three strains of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococus aureus was by agar diffusion method ,evaluation of anti- inflammation in vitro and antioxidant activity by DPPH method The results showed that the extraction efficiency was 21.218% The content of flavonoid in the raw material was 0.715 mg/g and the high extract was 2.227 mg/g by UV-Vis Spectroscopy method Extracts were resistant to three strains of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococus aureus at investigated concentrations The anti-inflammatory properties of the leaf extracts was IC50 = 70.209 μg/mL Thus, Morinda citrifolia L leaf contains flavonoid compounds and a valuable source of pharmaceuticals to create good natural products for later life Keywords: Morinda citrifolia L., Software Design-Expert 11.0, flavonoid, antibacterial, anti-inflammatory, antioxidan iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn hoàn thành dựa kết nghiên cứu chưa dùng cho luận văn cấp khác TP.HCM, ngày tháng năm Người thực Nguyễn Thùy Diễm Thảo iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v MỤC LỤC BẢNG BIỂU viii MỤC LỤC HÌNH ẢNH x MỤC LỤC SƠ ĐỒ xi DANH MỤC VIẾT TẮT xii LỜI MỞ ĐẦU xiii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHÀU 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật [1] 1.1.3 Phân bố sinh thái [1] 1.1.4 Thành phần hóa học Nhàu 1.1.5 Công dụng phận dùng 1.1.6 Tình hình nghiên cứu nước giới 1.2 1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu giới CƠ CHẾ LÀNH VẾT THƯƠNG 10 1.3 TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH TỐI ƯU HÓA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT 14 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 17 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.2 Hóa chất dụng cụ 19 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1 Sơ bô ̣ thành phầ n hóa thực vâ ̣t 21 2.3.2 Phương pháp chiết xuất đun hồi lưu 23 v 2.3.3 Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu cao tồn phần 25 2.3.4 Định tính flavonoid phương pháp hóa học 28 2.3.5 Định tính flavonoid phương pháp sắ c ký lớp mỏng 29 2.3.6 Định lượng flavonoid phương pháp cân 32 2.3.7 Định lượng flavonoid phương pháp UV-Vis 32 2.3.8 Định tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch 36 2.3.9 Định lượng khả kháng khuẩn mẫu thử phương pháp MIC 37 2.3.10 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 37 2.3.11 Phương pháp DPPH xác định hoạt tính kháng oxy hóa 38 2.3.12 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng 38 2.3.12.1 Giai đoạn 1: Khảo sát dung môi chiết xuất dược liệu 39 2.3.12.2 Giai đoạn 2: Khảo sát điều kiện chiết xuất dược liệu dựa phần mềm Design– Expert 11.0 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA THỰC VẬT LÁ NHÀU 44 3.2 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 45 3.2.1 Tối ưu dung môi chiết cao Nhàu 45 3.2.1.1 Định lượng flavonoid phương pháp UV-Vis 45 3.2.1.2 Định tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán đĩa thạch 45 3.2.1.3 Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 46 3.3 HIỆU SUẤT CHIẾT CAO CỒN 70% TỪ LÁ NHÀU 55 3.4 TIÊU CHUẨN HÓA NGUYÊN LIỆU VÀ CAO CHIẾT CỒN 70% TỪ LÁ NHÀU 59 3.4.1 Xác đinh ̣ mấ t khố i lươ ̣ng làm khô 59 3.4.2 Xác đinh ̣ đô ̣ tro toàn phầ n 59 3.4.3 Xác đinh ̣ đô ̣ tro không tan acid 60 3.4.4 Đinh ̣ tính flavonoid bằ ng phương pháp hóa ho ̣c 60 3.4.5 Đinh ̣ tính flavonoid bằ ng phương pháp sắ c ký lớp mỏng theo chuẩ n rutin 62 3.4.6 Đinh ̣ lươ ̣ng flavonoid bằ ng phương pháp UV – Vis theo chuẩ n rutin 63 3.5 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CAO TỒN PHẦN 66 3.5.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao tồn phần 66 3.5.2 Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) cao chiết toàn phần 67 3.5.3 Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro cao toàn phần 69 3.5.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao toàn phần 69 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI 71 ̣ 4.1 KẾT LUẬN 71 vi 4.2 ĐỀ NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 79 vii ... TÀI: NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT GIÀU HOẠT I CHẤT CÓ TÁC DỤNG L? ?M L? ?NH VẾT THƯƠNG TỪ L? ? NHÀU (MORINDA CITRIFOLIA L. ) • NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG - Khảo sát điều kiện chiết xuất dược liệu dựa hàm l? ?ợng... l? ?ợng hoạt chất hoạt tính sinh học II - Chiết xuất cao chiết tiềm từ Nhàu với điều kiện tối ưu - Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cao chiết tiềm từ Nhàu - Khảo sát hoạt tính sinh học cao chiết tiềm từ Nhàu. .. chiế t cao cồn 70% từ Nhàu Độ ẩm Khối l? ?ợng nguyên liệu (g) nguyên liệu ( %) 700 Khối l? ?ợng Độ ẩm Hiệu suất cao chiết (g) cao chiết ( %) chiết cao ( %) 167 18,044 21,218 7,797 Như vậy, sau trình chiết