Nghiên cứu chiết xuất cao chiết giàu hoạt chất từ lá nhàu (Morinda Citrifolia L.)

Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao lá Nhàu gồm thể tích dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu trực tâm quay (Rotatable Central Composite Design) và ma trận thí nghiệm được xây dựng bằng phần mềm Design–Expert 11.0. Tiêu chí đánh giá dựa trên hàm lượng flavonoid toàn phần, hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm. Xác đi ̣nh hàm lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp cân và UV-Vis theo chuẩn rutin; đánh giá khả năng kháng ba dòng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch; đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết cao đạt 21,218%. Hàm lượng flavonoid trong nguyên liệu đạt 0,715 mg /g và mẫu cao chiết đạt 2,227 mg /g bằng phương pháp UV-Vis. Cao chiết lá Nhàu có khả năng kháng đối với ba dòng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus ở các nồng độ khảo sát . Hoạt tính kháng viêm của cao chiết lá Nhàu là IC50 = 70,209 μg/mL .Như vậy, lá Nhàu có chứa hợp chất flavonoid và là nguồn dược liệu quý giá để tạo ra các sản phẩm thiên nhiên ứng dụng tốt trong đời sống sau này

Từ viết tắt Từ Tiếng Anh Từ Tiếng Việt

IC50

Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% gốc tự do

MIC Minimum Inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

EC50

Half maximal effective concentration Nồng độ ảnh hưởng 50% đối

tượng

HPLC-DAD

High Performance Liquid Chromatography-Diode Array Detecto

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò chuỗi diot quang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP Hồ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THÙY DIỄM THẢO

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT GIÀU HOẠT

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC

Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2019

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS LÊ VĂN MINH

Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS Hoàng Thị Kim Dung

Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS Hà cẩm Anh

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 11 tháng 01 năm 2019

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

1 CT: PGS.TS Lê Thị Hồng Nhan

2 PB1: TS Hoàng Thị Kim Dung

3 PB2: TS Hà cẩm Anh

4 UV: PGS.TS Trần Văn Hiếu

5 uv, TK: TS Lê Xuân Tiến

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HỘI ĐÒNG TRƯỞNG KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN cứu CHIẾT XUẤT CAO CHIẾT GIÀU HOẠT CHẤT CÓ TÁC DỤNG LÀM LÀNH VẾT THƯONG TỪ LÁ NHÀU (MORINDA CITRIFOLIA L.) • NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG - Khảo sát điều kiện chiết xuất dược liệu dựa trên hàm lượng hoạt chất và hoạt tính sinh học - Chiết xuất cao chiết tiềm năng từ lá Nhàu với các điều kiện tối ưu - Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao chiết tiềm năng từ lá Nhàu - Khảo sát các hoạt tính sinh học của cao chiết tiềm năng từ lá Nhàu II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: IV CÁN Bộ HƯỚNG DẪN: TS Lê Văn Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUÂN VĂN THẠC SĨ • • • • Họ tên học viên: Nguyễn Thùy Diễm Thảo Ngày, tháng, năm sinh: 12/07/1992 Chuyên ngành: Kỹ thuật hoá học MSHV: 1670202 Nơi sinh: Long An Mã số: 60520301 CÁN Bộ HƯỚNG DẪN TP.HCM, ngày tháng năm

CHỦ NHIỆM Bộ MÔN ĐÀO TẠO TRƯỞNG KHOA LỜI CẢM ƠN Trong 2 năm học tập vả rèn luyện tại Trường ĐH Bách Khoa TP.HCM, cùng vói sự giảng dạy nhiệt tình và tận tâm của quý Thầy Cô, đặc biệt lả quý thầy cô khoa Kĩ Thuật Hóa Học đã truyền đạt những kiến thức quý báu cùng vói sự tâm huyết, nhiệt tình vả tận tâm dành cho chúng em đó không chỉ lả những kiến thức mả còn lả kinh nghiệm vả lả hành trang cho tuông lai chúng em sau nảy Nếu không có những lòi hưởng dẫn, dạy bảo của các thầy cô em khó có thể hoàn thảnh tốt được luận văn nảy Luận văn thực hiện trong khoảng thòi gian 6 tháng vì vậy khó có thể tránh khỏi những sai sót, em mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Thầy Cô để em có thể hoàn thiện đưọc kiến thức cùng vói bải luận văn Em xin gửi lòi cảm on chân thảnh vả sự tri ân sâu sắc đến Thầy Lê Văn Minh, thầy đã tạo điều kiện cho em có được môi trường lảm việc tốt nhất cùng vói những kinh nghiệm quý giá vả sự hỗ trọ của thầy đã giúp em hoàn thảnh tốt bải luận văn tại Trung tâm Sâm vả Dược liệu TP.HCM Em xin gửi lòi cám on chân thảnh đến các anh chị nhân viên phòng Sinh học phân tử đã dành nhiều thòi gian giúp đõ, hướng dẫn vả củng cố thêm kiến thức cho em trong quá trình lảm luận văn tốt nghiệp của mình Cuối cùng em xin kính chúc quý Thầy Cô có được sức khỏe dồi dảo vả đạt được nhiều danh hiệu cao quý trong công việc, và kính chúc các Cô, Anh, Chị trong Trung Tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM luôn có sức khỏe dồi dào và thành công trong công việc Học viên Nguyễn Thùy Diễm Thảo 1 TÓM TẮT LUẬN VĂN Cây Nhàu (Morỉnda citrifolia L.) là loài cây có từ lâu đời được sử dụng để chữa một số bệnh trong dân gian và các bộ phận của cây Nhàu như rễ, thân, lá, quả còn được dùng như thực phẩm chức năng với nhiều hoạt chất sinh học, tính sinh dược học cao Trong nghiên cứu này, sử dụng phưong pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao lá Nhàu gồm thể tích dung môi, nhiệt độ và thời gian chiết Thí nghiệm được bố trí theo kiểu trực tâm quay (Rotatable Central Composite Design) và ma trận thí nghiệm được xây dựng bằng phần mềm Design-Expert 11.0 Tiêu chí đánh giá dựa trên hàm lượng flavonoid toàn phần, hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm, xác định hàm lượng flavonoid toàn phần bằng phưong pháp cân và UV-Vis theo chuẩn rutin; đánh giá khả năng kháng ba dòng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus bằng phưong pháp khuếch tán qua giếng thạch; đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro Kết quả cho thấy hiệu suất chiết cao đạt 21,218%. Hàm lượng flavonoid trong nguyên liệu đạt 0,715 mg /g và mẫu cao chiết đạt 2,227 mg /g bằng phưong pháp UV-Vis Cao chiết lá Nhàu có khả năng kháng đối với ba dòng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus ở các nồng độ khảo sát Hoạt tính kháng viêm của cao chiết lá Nhàu là IC50 = 70,209 pg/mL Như vậy, lá Nhàu có chứa họp chat flavonoid và là nguồn dược liệu quý giá đế tạo ra các sản phấm thiên nhiên ứng dụng tốt trong đời sống sau này Từkhoá: lá Nhàu, phần mềm Design-Expert 11.0, flavonoid, khảng khuân, kháng viêm, kháng oxy hóa. 11 ABSTRACT Morinda citrifolia L is a long-standing plant used to treat some diseases in folk medicine and parts of the tree, such as roots, stems, leaves and fruits, also used as a functional food Many biological active ingredients, high biopharmaceuticals In this study, Morinda citrifolia L leaf were extracted with 70% ethanol Response Surface Methodology was chosen to optimize the leaf extraction condition Rotatable Central Composite Design and Experimental matrix were constructed using Design-Expert 11.0 software to select the optimum high-extraction conditions from the leaf Determination of total flavonoid content by weight and UV-Vis Spectroscopy method based on rutin standard, evaluation of resistance to three strains of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococus aureus was by agar diffusion method ^valuation of anti-inflammation in vitro and antioxidant activity by DPPH method The results showed that the extraction efficiency was 21.218% The content of flavonoid in the raw material was 0.715 mg/g and the high extract was 2.227 mg/g by UV-Vis Spectroscopy method Extracts were resistant to three strains of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococus aureus at investigated concentrations The anti-inflammatory properties of the leaf extracts was IC50 = 70.209 pg/mL Thus, Morinda citrifolia L leaf contains flavonoid compounds and a valuable source of pharmaceuticals to create good natural products for later life Keywords' Morinda citrifolia L., Software Design-Expert 11.0, flavonoid, antibacterial, anti-inflammatory, antioxidan. iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác TP.HCM, ngày tháng năm

Ngưòi thực hiện Nguyễn Thùy Diễm Thảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT LUẬN VẢN ii

ABSTRACT iii

LỜI CAM ĐOAN iv

MỤC LỤC V MỤC LỤC BẢNG BIÊU viii

MỤC LỤC HÌNH ẢNH X MỤC LỤC Sơ ĐỒ xi

DANH MỤC VIẾT TẮT xii

LỜI MỞ ĐÀU xiii

CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN 1

1.1 TÔNG QUAN VỀ CÂY NHÀU 1

1.1.1 Phân loại khoa học

1

1.1.2 Đặc điểm thực vật [1]

1

1.1.3 Phân bố sinh thái [1]

2

1.1.4 Th ành phần hóa học của lá cây Nhàu 3

1.1.5 Công dụng và bộ phận dùng

5

1.1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 6

1.1.6.1 Tình hình nghiên cửu trong nước 6

1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thể giới 9

1.2 Cơ CHẾ LÀNH VẾT THƯƠNG 10

1.3TỔNG QUAN VỀ QUY TRÌNH TỒI Ưu HỎA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT 14

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu VÀ THựC NGHIỆM 17

2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN cứu 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN cứu 17

2.2.1 Nguyên vật liệu V 2.3.3 Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu và cao toàn phần 25

2.3.4 Định tính ílavonoid bằng phương pháp hóa học

28

2.3.5 Định tính flavonoid bằng phương pháp sắc ký lóp mỏng

29

2.3.6 Định lượng ílavonoid bằng phương pháp cân

32

2.3.7 Định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis

32

2.3.8 Định tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 36

2.3.9 Định lượng khả năng kháng khuẩn của mẫu thử bằng phương pháp MIC 37

2.3.10 Ph ương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 37

2.3.11 Ph ương pháp DPPH xác định hoạt tính kháng oxy hóa 38

2.3.12 Tối ưu hóa điều kiện phàn ứng 38

2.3.12.1 Giai đoạn 1: Khảo sát dung môi chiết xuất dược liệu 39

2.3.12.2 Giai đoạn 2: Khảo sát điều kiện chiết xuất dược liệu dựa trên phần mem Design-Expert 11.0 40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH sơ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THựC VẬT LÁ NHÀU 44

3.2 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KỆN PHẢN ÚNG 45

3.2.1 Tối ưu dung môi chiết cao lá Nhàu 45

3.2.1.1 Đị nh lượng flavonoid bằng phương pháp UV- Vis 45

3.2.1.2 Đị nh tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đìa thạch 45

3.2.1.3 Đả nh giá hoạt tính kháng viêm in vitro 46

3.3 HỆU SUẤT CHẾT CAO CỒN 70% TỪ LÁ NHÀU 55

3.4 TIÊU CHUẨN HÓA NGUYÊN LIỆU VÀ CAO CHIET CồN 70% TỪ LÁ NHÀU 59

VI 4.2 ĐỀ NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

PHỤ LỤC 79

vii MỤC LỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Danh sách hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Danh sách thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 19

Bảng 2.3 Tóm tắt phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 23

Bảng 2.4 Các phản ứng hóa học định tính flavonoid 27

Bảng 2.5 Mã hóa các yếu tố và giá trị thực của yếu tố khảo sát 407

Bảng 2.6 Bố trí các điều kiện thí nghiệm theo phần mềm Design- Expert 11.0 42

Bảng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Nhàu 39

Bảng 3.2 Kết quả định lượng flavonoid bằng phương pháp UV-Vis 45

Bảng 3.3 Ket quả định tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch .46

Bảng 3.4 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro caochiết 46

Bảng 3.5 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro diclofenac sodium 46

Bảng 3.6 Bố trí các điều kiện thí nghiệm và kết quả thực nghiệm theo phần mềm Design- Expert 11.0 42

Bảng 3.7 Kết quả giá trị tối ưu hóa theo các yếu tố đáp ứng 49

Bảng 3.8 Kết quả hiệu suất chiết cao cồn 70% từ lá Nhàu 55

Bảng 3.9 Kiểm tra độ lặp lại của mô hình tối ưu hoá 55

Bảng 3.10 Phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng của các nhân tố chiết đến hàm mục tiêu hàm lượng flavonoid 51

Bảng 3.11 Ket quả phân tích phương sai cho mô hình đa thức bậc hai kháng viêm57 Bảng 3.12 Kết quả độ ẩm mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu 59

Bảng 3.13 Kết quả độ tro toàn phần mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu .54

Bảng 3.14 Ket quả độ tro không tan trong acid HC1 của mẫu nguyên liệu lá Nhàu60 Bảng 3.15 Nồng độ và mật độ quang chất chuẩn Rutin 58

Bảng 3.16 Ket quả định lượng flavonoid trong mẫu nguyên liệu và cao chiết cồn 70% từ lá Nhàu bằng phương pháp cân và UV-Vis 65

Bảng 3.17 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng khuấn cao toàn phần 66

viii Bảng 3.18 Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết toàn phần .67

Bảng 3.19 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro cao toàn phần 69

Bảng 3.20 Ket quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa cao toàn phần 69

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của acid ascorbic 70

IX MỤC LỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình thái tự nhiên của cây Nhàu [A], trái Nhàu[B] Chụp bởi tác giả tại vườn bảo tồn gen và giống cây thuốc các tỉnh phía Nam Ngày 20/03/2018 2

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Rutin 4

Hình 1.3 Các giai đoạn làm lành vết thưong 13

Hình 2.1 Hình thái tự nhiên lá Nhàu [A], bột lá Nhàu [B] 18

Hình 3.1 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố đến hàm lượng flavonoid: (A) Thời gian và nhiệt độ; (B) Thể tích và nhiệt độ; (C) Thời gian và thể tích 49

Hình 3.2 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố thời gian và nhiệt độ đến kháng khuẩn Hình 3.3 Đồ thị 3D ảnh hưởng 2 yếu tố thời gian và nhiệt độ đến kháng viêm

Hình 3.4 Dự đoán sự thay đổi hàm lượng flavonoid theo sự thay đổi các yếu tố Hình 3.5 Dự đoán sự thay đổi kháng khuẩn theo sự thay đổi của các yếu tố

Hình 3.6 Dự đoán sự thay đổi kháng viêm theo sự thay đổi của các yếu tố

450 450 51

52

53

Hình 3.7 So sánh hàm lượng flavonoid từ thực nghiệm và từ mô hình được xây dựng .57

Hình 3.8 So sánh kháng viêm từ thực nghiệm và từ mô hình được xây dựng 58

Hình 3.9 Ket quả định tính flavonoid lá Nhàu bằng phản ứng hóa học Flavonoid phản ứng vói thuốc thử: (A) trong nguyên liệu lá Nhàu; (B) trong cao chiết cồn 70% 61 Hình 3.10 Sắc ký đồ định tính flavonoid trong dịch chiết từ lá Nhàu Hệ khai triển: (TEA) Toluen - Ethyl acetat - Acid formic (8: 2: 1); (EMN) Ethyl acetat - Methanol -Nước (100: 17: 13) 62

Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính flavonoid trong dịch chiết từ lá Nhàu Hệ khai triển: (BAN) nbutanol Acid acetic Nước (7: 1: 2); (TEMA) Toluen Etyl acetat -Methanol - Acid formic (7: 5: 5: 1) 62

Hình 3.12 Đường chuẩn rutin 64

X MỤC LỤC Sơ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 17

Sơ đồ 2.2 Tóm tắt phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 22

Sơ đồ 2.3 Định tính flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 31

Sơ đồ 2.4 Định lượng flavonoid bằng phương pháp cân và UV-Vis 34

XI

DANH MỤC VIẾT TẮT

Kiểm nghiệm Hoạt tính sinh học

- HC1 đậm đặc, H2SO4 đậm đặc - DMSO (Trung quốc)

xii

LỜI MỞ ĐẦU

Bước sang thế kỷ 21, với sự phát triển không ngừng của xã hội kèm theo đó là sựxuất hiện những tai nạn tạo nên các vết thương không mong muốn ảnh hưởng đến chấtlượng cuộc sống của con người Những năm gần đây, các nghiên cứu cho thấy nhiều thảodược có vai trò rất quan trọng trong quá trình làm lành vết thương, giúp thúc đẩy các cơchế sửa chữa tự nhiên Dùng chiết xuất từ thảo dược trong điều trị các vết thương có lợi

vì tính an toàn được chấp nhận do các phản ứng quá mẫn hiếm khi xảy ra, nguồn nguyênliệu đa dạng, phong phú và rẻ tiền, đặc biệt là ở Việt Nam với vùng khí hậu thuận lợi chotrồng và phát triển các dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên

Mặc dù, chữa lành vết thương là một đáp ứng tự nhiên của cơ thể và có khả năng

tự phục hồi, nhưng để khôi phục lại tính toàn vẹn và tránh các tác động bất lợi từ bênngoài cần phải chữa lành vết thương nhanh

Cây Nhàu (Morỉnda citrifolia L.) thuộc họ Rubiacease còn dược gọi là cây Ngao,

Nhàu núi, Giầu, được nhân dân miền Nam dùng trong chữa một số bệnh như rễ chữahuyết áp, nhức mỏi, viêm khớp, sỏi thận; quả giúp tiêu hóa, nhuận tràng, lợi tiểu, lá dùngđắp lên vết thương, mụn nhọt, chữa cao huyết áp, quả giúp nhuận tràng, lợi tiểu, lá dùngchữa mụn nhọt, sốt rét, kiết lỵ Một số nước châu Á sử dụng rễ làm thuốc bổ, thuốc hạsốt, cao huyết áp, sung huyết, trĩ, xuất huyết não, lá chữa đầy hơi, đau bụng, quả chữa đáitháo đường, ho, sốt, kinh nguyệt không đều [1] Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy láNhàu có chứa flavonoid, saponin, alkaloids, iridoid glycosides, terpenoid và tannin có tácdụng chống viêm, chống vi khuẩn và chất chống oxy hóa để đẩy nhanh quá trình chữalành vết thương [2] Dịch chiết ethanol 45%,70% và 96% lá Nhàu đều thể hiện hoạt tính

kháng Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli trong đó dịch

chiết ethanol 70% có hoạt tính tốt nhất Bằng phần mem Design-Expert 11.0 cho điều kiện tối ưu chiết cao lá Nhàu với thể tích dung môi 500 mL, quá trình chiết thực hiện trong 95 phút tại nhiệt độ 60 °c cho hàm lượng flavonoid là 2,227 mg/g Nồng nộ ức chế

tối thiểu sau 24 giờ đối với Escherichia colỉ (MIC=3,125 mg/mL), đối với

Staphỵlococus aureus (MIC=12,5

mg/mL), đối với Pseudomonas aeruginosa (MIC=6,25 mg/mL) Nồng nộ ức chế tối thiểu sau 48 giờ đối vói Escherichia coli (MIC=6,25 mg/mL), đối với Staphylococus aureus (MIC=25 mg/mL), đối vói Pseudomonas aeruginosa (MIC=12,5 mg/mL) Kháng viêm

thể hiện qua chỉ số IC50 là 70,209 Ịig/mL

Dựa trên những nghiên cứu của thế giới và tính cấp thiết của vấn đề nghiên cứu,

đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất cao chiết giàu hoạt chất từ lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)”

được thực hiện nhằm để đảm bảo tính an toàn, hiệu quả và chất lượng của cao chiết gópphần tạo tiền đề cho các sự ra đời của chế phẩm từ cao chiết lá Nhàu

XIV

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY NHÀU

Tên khoa học: Morỉnda citrifolia L.

Tên khác: cây Ngao, Nhàu núi, Giầu, M bracteata Roxb, M litoralis Blanco,Dâu tằm Ấn Độ, Bengkudu, Mengkudu (Mã Lai)

1.1.1 Phân loại khoa học

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Gentianales

Họ (familia): Rubiaceae

Chi (genus): Morỉnda

Loài (species): Morỉnda Citrifolia

-Hoa: Cụm hoa hĩnh tròn hay hơi bầu dục, ở ngoài nách lá Trục cụm hoa hình trụ,màu xanh, nhẵn, dài 1-2 cm Đáy cụm hoa có 3 phiến hẹp, dài 5-8 mm Hoa đều, lưỡngtính Đài hoa là một gờ tròn, ống tràng hình phễu, màu xanh nhạt, cao 7-12 mm; bêntrong có nhiều lông trắng; thùy dài khoảng 5-8 mm, màu trắng, hình bầu dục đầu nhọn,đỉnh có phụ bộ là một mấu nhỏ cong vào trong Khi hoa nở các thùy cong xuống phíadưới; tiền khai van Nhị bằng nhau, rời, gắn ở phần loe của ống tràng xen kẽ với cáccánh hoa, chỉ nhị rất ngắn Bao phấn hĩnh đầu tên, màu vàng nhạt, dài khoảng 4 mm; 2 ô

mở dọc, hướng trong, đính gốc Hạt phấn rời, hình hình cầu, màu vàng nhạt Lá noãn, ở

vị trí trước sau, bầu dưới, 2 ô, mỗi ô 1 noãn, đính trung trụ Vòi nhụy dạng sợi màu xanhnhạt, dài 5 mm; 2 đầu nhụy dạng phiến mỏng, dài 3 mm, màu xanh Đĩa mật dày, hìnhkhoen, màu vàng

-Hạt: Hạt nhiều, hình bầu dục, một đầu nhọn, màu nâu đen

Hình 1.1 Hình thái tự nhiên của cây Nhàu [A], trái Nhàu[B].

Chụp bởi tác giả tại vườn bảo tồn gen và giống cây thuốc các

tỉnh phía Nam Ngày 20/03/2018

1.1.3 Phân bố sinh thái [1]

Cây Nhàu có nguồn gốc vùng nhiệt đới thuộc Châu Á và Châu úc Loài cây này phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á,Trung Quốc và Ân Độ

Ở Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng khắp nơi, cây thường dựa vào mép nước Ở Việt Nam cây Nhàu có nhiều ở Miền Nam, ngoài ra còn có ở các tỉnh Miền Trung như Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế và vài nơi thuộc đồng bằng Bắc Bộ

2

Cây mọc hoang và được trồng nhiều ở các tỉnh phía Nam, lá được dùng làm rau phổ biến ở nông thôn

1.1.4 Thành phần hóa học của lá cây Nhàu

Các nghiên cứu hóa học của loài cho thấy gần 200 hợp chất đã được xác định và tách chiết từ những phần khác nhau của cây Nhàu Trong đó:

Lá có chứa glicosid tim, tannin, terpenoid, alkaloid, polysaccharid, quercetin 3,7- O-dimethylether ,quercetin 3-O-methylether, quercetin-3-O-rutinosid, saponin, alanin, phenyl alanin, tryptophan, threonin, cystein, lucin, acid (S)-2-amino-5-

guanidinopentanoic, acid 2-aminopentanedioic, serin, tyrosin, valin, histidin, acid 2- amino-4-(methylthio)butanoic, proline, acid 2-aminobutanedioic [2]

Thân, rễ chứa anthraquinon, glicosid tim, flavonoid, coumarin, acid

octadecadienoic, pentose, hexose

Quả chứa chủ yếu vitamin, flavonoid, alizarin, acid hexanoic, acid octanoic, acid hexanoic, acid (3R,4S,5R,6R)-6-(hydroxymethyl)oxan-2,3,4,5-tetrol, gluconic, ethyl caproat, ethyl caprylat, methyl octanoat, methyl decanoat

Các thành phần hoạt tính như flavonoid, saponin, alkaloids, iridoid glycosides,terpenoid và tannin có tác dụng chống viêm, chống vi khuẩn và chất chống oxy hóa đểđẩy nhanh quá trình chữa lành vết thương [2]

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các bộ phận của cây Nhàu thể hiện nhiều tácdụng như kháng khuấn, kháng viêm, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng ung thư, giảmđau, điều hòa miễn dịch, làm lành vết thương, các tác dụng trên xương, Các công bốtrước đây cho thấy flavonoid góp phần vào sự đa dạng các tác dụng của Nhàu[3] Tuynhiên, các nghiên cứu tập trung vào quả hơn là rễ, thân, lá và hiện nay một số chế phấmđược nghiên cứu sản xuất từ quả, rễ, thân hơn là lá

Rutin, còn được gọi là rutosid, quercetin-3-O-rutinosid và sophorin, là glycosid kếthọp quercetin flavonol và rutinose disaccharide (d-L-rhamnopyranosyl- (1 —> 6) - P-D-glucopyranose) Nó là một flavonoid cam quýt được tìm thấy trong nhiều loại thực vậtbao gồm cả trái cây họ cam quýt

3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Rutin

Hầu hết các polyphenol đều cố khả năng kháng khuẩn Các nghiên cứu về cơ chế tác dụng kháng sinh của flavonoid còn rát ít và có thể theo một số giả thiết sau:

Flavonoid ức chế transpeptidare làm cho mucopeptỉd - yếu tố đảm bảo cho thành

tế bào vi khuẩn vững chắc không tổng hợp được

Gắn lên màng nguyên sinh chất của vì khuẩn, làm thay đổi tính thẩm thấu chọnlọc của màng nguyên sinh chất Vì vậy làm cho một số chất cần thiết cho đời sổng vikhuẩn như nucleoid, pyrìmidin, purin lọt qua màng nguyên sinh chất ra ngoài

Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẳn theo hai kiểu: phong tỏa mạch peptit của vi khuẩn bằng cách phong tỏa transferare chuyển acid amin từ RNA vàomạch làm mạch không kéo dài thêm được hoặc tạo ra protein bất thường không có tác dụng đối với đời sống của vi khuẩn, làm chúng không sử dụng được, ức chế tổng hợp acid nucleic

Flavonoid có thể tác dụng vào DNA khuôn, ức chế tổng hợp RNA của vi khuẩn

4

1.1.5 Công dụng và bộ phận dùng

Giống cây này có rất nhiều ứng dụng trong đời sống con người và có thể được coi

là thực phẩm chức năng vói nhiều hoạt chất sinh học, tính sinh dược học cao cụ thể như

[1]:

- Hiệu quả trong việc chữa trị vết loét, ngừa phát ban

- Chữa tiêu chảy

- Chữa mất ngủ, suy nhược thần kinh, huyết áp cao, loại bỏ độc tố: Tăng khả nănghấp thụ, tiêu hóa, sử dụng vitamin, thảo dược và khoáng chất

- Có khả năng chống oxy hóa cao giúp ngăn chặn sự hủy hoại những gốc tự do

- Giảm đau: Chữa những cơn đau trong cơ thể như đau lưng, cổ, đau cơ, thần kinh

và những cơn đau như căng thẳng, đau nửa đầu

- Giảm sưng vết thương triệu chứng như vết thâm tím, căng da và bỏng

- Hỗ trợ hệ miễn dịch: Kích thích việc sản xuất những tế bào T - tế bào đóng vaitrò chống viêm: có tác dụng trong việc chữa các bệnh liên quan đến cơ và khớp như bệnhviêm khớp, hội chứng nhức xương cổ tay

Các bộ phận của cây nhàu có thể sử dụng để trị liệu các bệnh như sau:

- Quả nhàu ăn với muối dễ tiêu, nhuận tràng làm thuốc điều kinh, trị băng huyết,bạch đới, ho cảm, hen, đau gân, đái đường Nướng chín ăn để chữa lỵ Ăn ngày 1-3 quả

Vĩ mùi hăng, nồng và cay nên khó ăn được nhiều

- Lá nhàu: Giã nát đắp chữa mụn nhọt, mau lên da non sắc uống chữa đi lỵ, chữasốt và làm thuốc bổ, lá nhàu còn dùng nấu canh lươn ăn bổ

- Vỏ cây nhàu: Nấu nước cho phụ nữ sau khi sanh uống bổ máu

- Rễ nhàu: Ngoài công dụng nhuộm màu đỏ quần áo, vải lụa thì thái nhỏ, ngâmrượu uống sẽ chữa nhức mỏi, đau lưng (hoặc dùng quả nhàu non, thái mỏng thay rễ) Rễnhàu được dùng làm thuốc chữa cao huyết áp, một số hiệu thuốc chế thành cao rễ nhàu.Liều dùng mỗi ngày uống 30 - 40g, uống như nước chè, sau chừng 15 ngày sẽ có kết quả.Nhân dân miền Nam Việt Nam thường dùng nhàu làm thuốc điều kinh, hạ huyết áp, trịbăng huyết, khí hư, bạch đới, viêm phế quản, ho hen, cảm mạo

5

1.1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu vào năm 2005 của Nguyễn Trọng Thông và cộng sụ nghiên cứu ảnhhuởng của cách dùng thuốc đến tác dụng kích thích miễn dịch của cao quả Nhàu [4]’Kếtquả đạt đuợc là cao quả Nhàu làm tăng trọng luợng lách và trọng luợng tuyến ức, đồngthời làm tăng số luợng bạch cầu trong máu ngoại vi, tăng bạch cầu lympho, bạch cầu diệt

tụ nhiên, tăng khả năng đáp ứng miễn dịch dịch thể của các lympho bào B với khángnguyên đặc hiệu và tăng phản ứng bì với kháng nguyên OA, nhu vậy làm tăng đáp ứngmiễn dịch tế bào do các lympho bào T đảm nhiệm

Nghiên cứu vào năm 2005 của Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sụ nghiên cứu ảnhhuởng của dịch chiết bằng nuớc của quả Nhàu Việt Nam lên một số các enzym chốngoxy hóa và enzym P450 ở gan chuột nhắt trắng [5] Kết quả đạt đuợc là dịch chiết bằngnuớc của quả Nhàu Việt Nam có hoạt tính chống oxy hóa hữu hiệu Ở nhóm có sử dụngdịch chiết quả nhàu + ccu, hàm luợng MDA đã giảm 10%, hoạt độ SOD tăng 31% so vớinhóm chuột cho uống thuốc gây mô hĩnh đối chứng Bên cạnh đó cũng thay đổi hoạt tínhP450: khi chuột nhiễm độc đuợc bổ sung dịch chiết quả Nhàu hoạt tính đã tăng lên49,5% so với nhóm đuợc uống ccu những vẫn giảm so với nhóm đối chứng 30,3%.Nhóm đuợc uống dịch chiết quả nhàu, hoạt tính P450 tăng 24,8%

Nghiên cứu vào năm 2006 của Anh Kim T Bui và cộng sụ nghiên cứu thành phầnpolysaccharide của nuớc ép trái Nhàu (Noni) gồm các monosaccharide nhu acidglucuronic, galactos, arabinose và rhamnose với hoạt tính chống khối u trên ung thu phổiLewis ở chuột[6]

Nghiên cứu vào năm 2007 của Phạm Thị Vân Anh và cộng sụ nghiên cứu tác dụngchống oxy hóa của cao quả Nhàu trên hai mô hình gây tổn thuơng gan chuột nhắt trắngbang carbon tetraclorid (CCL) và paracetamol[7]

Ket quả nghiên cứu cho thấy:

- Hoạt độ AST và ALT tăng lên ở lô chuột tiêm CCL Cao quả Nhàu liều tuơng ứng6g và 12g duợc liệu/kg làm giảm mức tăng hoạt độ hai enzym Tác dụng của cao ở hailiều nhu nhau và tuơng đuơng với silymarin

6

- Ở lô chuột uống paracetamol 500 mg/kg, hoạt độ AST và ALT tăng lên so với lôchứng Cao quả Nhàu liều tương đương 6g và 12g dược liệu/kg làm giảm hoạt độ haienzym này so với lô mô hình Tác dụng của cao ở hai liều như nhau và tương đương vớisilymarin

- Paracetamol và CCL làm tăng hàm lượng MDA so với lô chứng Cao quả Nhàu ởliều tương đương 6g và 12g dược liệu/kg làm giảm hàm lượng MDA so với lô mô hĩnhkhông điều trị Tác dụng này của cao tương đương với silymarin

Nghiên cứu vào năm 2011 của Phạm Thị Vân Anh và cộng sự nghiên cứu ảnhhưởng của cao quả Nhàu lên số lượng lympho bào T CD4, T CD8 và sự chuyển dạnglympho bào trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng Cyclophosphamid(CY) [8] cho kết quả cao quả Nhàu liều 6g/kg uống liên tục trong 5 ngày trên chuột trắng

bị gây suy giảm miễn dịch bằng tiêm màng bụng CY liều 200mg/kg có tác dụng:

- Cải thiện khả năng chuyển dạng của các lympho bào trong máu ngoại vi

- Tăng số lượng các lympho bào T CD4 và T CD8 trong trong máu ngoại vi vàtrong lách

Nghiên cứu vào năm 2012 của Đái Thị Xuân Trang và các cộng sự Đại Học cần Thơ

[9] cho thấy cao ethanol của cây Nhàu có tác dụng hạ đường huyết trên chuột bệnh tiểuđường sau 21 ngày điều trị theo thứ tự rễ (58,01%), trái chín (51,62%), trái xanh(41,43% và lá (34,21%) Hiệu quả loại bỏ gốc tự do của cao chiết nhàu theo thứ tự tráichín (EC50 = 0,237 ± 0,002), lá (EC50 = 0,917 ± 0,006), trái xanh (EC50= 1,025 ± 0,001)

và rễ (EC50= 1,531 ± 0,003) Phần trăm lượng gốc tự do tạo ra ở thận của chuột bệnhtiểu đường kết hợp với các chất chống oxy hóa trong cao chiết cây Nhàu theo thứ tự lầnlượt trái chín (82,76%), rễ (82,88%) trái xanh (80,59%) và lá (79,55%) Hiệu quả loại

bỏ gốc tự do của các cao chiết nhàu tương đương vói glucofast (86,29%) và gần bằngvói chuột khỏe mạnh (88,33%)

Nghiên cứu vào năm 2012 của Hoàng Việt Dũng và cộng sự nghiên cứu định lượngscopoletin trong quả Nhàu bằng phương pháp HPLC [10] kết quả đạt được là l,0006g cóhàm lượng scopoletin là 0,0265%, độ lặp lại (RSD= 3,14% )và độ đúng

(Morinda citrifolia L.)[11] cho thấy:

- Quả Nhàu chín chứa 5,27g/100g đường khử; 0,033g/100g protein; 8,750g/100glipid; 19,33 (%) cellulose

- Hoạt độ một số enzyme và các chất chống oxy hoá trong quả Nhàu khá cao Hoạt

độ riêng của C-ase là 32,626 (U/mgprotein), hoạt độ riêng của P-ase là 68,818 (U/mgprotein), hàm lượng vitamin c là 0,121 (g/100g mẫu) Chỉ số LP: 79,39 (nM MDA/gmẫu)

- Hàm lượng cao toàn phần với dung môi ethanol (CT) chiếm 8,35%; flavonoidtổng số (FT): 4,125%; các chế phẩm chiết phân lóp với dung môi MeOH (CFm): 8,06%;n-Hexan: 2,15%; dung môi EtOAC (CFe): 1,76% và dung môi ra-BuOH (CF): 1,81%

Dự đoán sự có mặt của flavonoid trong tất cả các dịch chiết quả Nhàu thu được

- Các chế phẩm CFm, CFh, CFe, CFb, CT, FT (flavonoid tổng số) đều thể hiện hoạttính kháng khuẩn mạnh vói các loại vi sinh vật kiểm định Trong đó đáng chú ý là 2 loại

vsv kiểm định Staphylococcus aureus và Salmonella typhi là nhạy cảm nhất đối với tất

cả các chế phẩm nghiên cứu CFb, CFe và FT nói trên

Nghiên cứu vào năm 2015 của Nguyễn Trọng Điệp và cộng sự nghiên cứu ảnhhưởng của tá dược đến quy trình bào chế bột cao khô quả Nhàu bằng phương pháp phunsấy [12] cho thấy tá dược có ảnh hưởng rõ rệt đến hàm lượng hoạt chất, hiệu suất phunsấy và các thông số hóa lý của bột cao khô quả Nhàu bào chế bằng phương pháp phunsấy Khi tăng tỷ lệ AE và giảm tỷ lệ MD làm tăng hiệu suất phun sấy, hàm ấm, khả năngtrơn chảy nhưng lại làm giảm tính hút ấm, hàm lượng và hiệu suất thu hồi flavonoid,scopoletin của sản phẩm; Khi tăng tỷ lệ TD/CR trong cao quả Nhàu làm giảm hàm ấm,tính hút ấm, hàm lượng hoạt chất nhưng làm tăng tỷ trọng, khả năng trơn chảy, hiệu suấtphun sấy và hiệu suất thu hồi hoạt chất của bột cao khô quả

8

Nhàu Trong đó, hỗn hợp tá dược MD/AE (25/75) ở tỷ lệ TD/CR 20% là phù hợp nhất

để bào chế bột cao khô quả Nhàu bằng phương pháp phun sấy

Nghiên cứu vào năm 1990 của Mairim Russo Serafini và các cộng sự Khoa Sinh lý

và Hóa học, Đại học Liên bang Sergipe (UFS), SaCristovao, Sergipe, Brazil[13] cho thấyrằng dịch chiết nước lá Nhàu (400 mg / kg), tạo ra một sự giảm đáng kể (P <0,001)trong các cơn co thắt bụng gây ra bởi acid acetic ở chuột sau 60 phút

Vào năm 1992 tại cuộc họp thường niên lần thứ 83 của Hiệp hội nghiên cứu ung thư

Mỹ, Hirazumi, một nhà nghiên cứu tại Đại học Hawaii[14] , đã báo cáo rằng nước ép tráiNhàu có hoạt tính chống ung thư phổi ở chuột C57 B1 / 6

Nghiên cứu vào năm 2001 của Sang và cộng sự nghiên cứu flavonol glycoside xuấthiện chiếm ưu thế trong lá Nhàu, rutin và các flavonol glycoside khác đã được xác địnhtrước đây trong lá Nhàu [14] Tuy nhiên, sự hiện diện của flavonol aglycone trong láNhàu chưa được báo cáo trước đó

Nghiên cứu vào năm 2002 Wang và cộng sự nghiên cứu tác dụng giảm đau và an

thần của M citrifolia L trên chuột thông qua các thử nghiệm chiết xuất từ rễ M.

citrifolia L (1600 mg / kg) cho thấy hoạt tính giảm đau đáng kể ở động vật, tương tự

như tác dụng của morphin (75% và 81%) nhưng không gây nghiện và nó cũng đượcchứng minh là không độc hại[15]

Nghiên cứu vào năm 2007 Shivananda và cộng sự [16] nghiên cứu hoạt động chữalành vết thương cao chiết xuất ethanol của lá (150 mg / kg / ngày) được sử dụng để đánhgiá hoạt động chữa lành vết thương ở chuột Ket quả cho thấy rằng động vật được điềutrị chiếm 71% giảm diện tích vết thương Khối lượng và hàm lượng hydroxylprolinetrong các vết thương không gian chết của mô tạo hạt cũng tăng đáng kể ở động vậtkhông được xử lý khi so sánh vói các mẫu chứng

Nghiên cứu vào năm 2008 Vijaykumar Pandurang Rasal và cộng sự cho thấy chiếtxuất nước lá Nhàu liều 200 mg/kg có tác dụng kháng oxy hóa và làm lành vết thươngtrên chuột thông qua đánh giá kích thước vết thương, hàm lượng collagen,hydroxyprolin, hàm lượng MDA [17]

9

Nghiên cứu vào năm 2011 của Deng và cộng sự cho thấy 23 flavonol glycoside, chủyếu là rutin, là những hợp chất chính trong dịch chiết nuớc lá Nhàu qua phân tích HPLC-DAD [13]

Nghiên cứu vào năm 2013 của Sabirin cho biết việc chữa lành vết loét bị ảnh huởng

bởi hàm luợng flavonoid trong chiết xuất lá Nhàu Tác dụng của chiết xuất lá Morỉnda

citrifolia L chữa lành vết thuơng loét trong miệng của chuột Wistar (Rattus

norvegicus) Nghiên cứu đuợc thục hiện trong 10 ngày bằng cách đo đuờng kính loét.Flavonoid có thể kích thích sụ tổng hợp các yếu tố tăng truởng ảnh huởng đến sụ giatăng của nguyên bào sợi, nguyên bào sợi có vai trò quan trọng trong việc thiết lập cấutrúc mô mới để có thể đẩy nhanh quá trình chữa lành vết loét [16’18]

Nghiên cứu vào năm 2015 của Atkinson [19] đã báo cáo hoạt tính kháng khuẩn

Morinda citrifolia L đối với một số chủng vi khuẩn nhiễm khuẩn nhu p aeroginosa, p morgaii, s aureus, B subtilis, E coli, Salmonella và Shigella với chiết xuất methanol

vòng kháng khuẩn B subtilis, E coli và p fluroscence lần luợt là 9,0 mm, 10,0 mm, 16,0

mm Dịch Ethanol vòng kháng khuẩn B subtilis, E coli và p ýluroscence lần luợt là 7,0mm, 9,0 mm, 12,0 mm Penicillium vòng kháng khuẩn B subtilis, E coli và p.

fluroscence lần luợt là 8,1 mm, 9,1 mm, 12,7 mm

Nghiên cứu vào năm 2017 của Takashima và cộng sụ [20] đã chứng minh việc sửdụng thuốc của các thành phần mới đuợc phân lập từ lá Nhàu có thể chữa vết mổ ở lungchuột Các chiết xuất lá Nhàu đã đuợc sử dụng để thúc đẩy chữa lành vết thuơng Nhữngcon chuột nhóm thử nghiệm uống chiết xuất với liều 150 mg/ kg lngày cho đến khi chữalành hoàn toàn

1.2 Cơ CHẾ LÀNH VẾT THƯƠNG

Da đuợc xem là một trong những cơ quan quan trọng nhất của cơ thể, có nhiệm vụbao bọc, che chở cơ thể khỏi những tác động bất lợi từ môi truờng bên ngoài, ngoài ra dacòn giúp điều hòa nhiệt độ cơ thể, cảm giác thông tin từ bên ngoài Các chấn thuơng cấptính, vết thuơng mãn tính hoặc can thiệp phẫu thuật ảnh huởng đến chức năng của da,làm tổn thuơng da, mất da và khuyết tật thẩm mỹ

10

Quá trình liền vết thương trải qua 4 giai đoạn cơ bản: giai đoạn cầm máu, giaiđoạn viêm, giai đoạn tăng sinh và giai đoạn tái tạo Tùy vào mức độ nghiêm trọng củavết thương và cơ địa ngưòi vị thương mà 4 giai đoạn này nhanh hoặc chậm hoặc có thể

để lại sẹo trên da

1 Giai đoạn cầm máu

Do tác động của ngoại vật, vết thương chảy máu và tác động lên collagen tại vếtthương, nó có tác dụng kích thích sự hoạt hóa của tiểu cầu và các yếu tố đông máu khác,

từ đó các yếu tố này tác động lên các mao mạch nhỏ hình thành lên các cục máu đông

có tác dụng ngăn chặn sự chảy máu của vết thương Khi vết thương quá sâu hoặc chạmvào các mạch máu lớn các yếu tố đông máu này không kịp hình thành các cục máu đôngngăn quá trình chảy máu vì máu chảy nhanh và nhiều vì vậy cần áp dụng các cách ngăn

sự cháy máu từ bên ngoài như băng gạc, ga rô

2 Giai đoạn viêmGiai đoạn này diễn ra do có sự can thiệp của bạch cầu đa nhân trung tính có nhiệm

vụ dọn dẹp những vật thể lạ xâm nhập vào vết thương bằng hiện tượng thực bào, quátrình diễn ra trong vòng 24- 48h Sau đó những đại thực bào do bạch cầu đơn nhân sẽthay thế cho bạch cầu đa nhân trung tính ở trên vừa có tác dụng loại bỏ những vật ngoạilai còn lại vừa có tác dụng thúc đẩy các yếu tố tăng trưởng (một trong những yếu tốquan trọng trong quá trình liền vết thương)

Khi cơ thể có dấu hiệu suy giảm hệ thống miễn dịch làm số lượng đại thực bào bịsuy giảm, từ đó suy yếu quá trình loại bỏ vật thể lạ cũng như làm chậm quá trình lànhvết thương

3 Giai đoạn tăng sinh

Sau giai đoạn cầm máu và loại bỏ tạp chất thì giai đoạn tăng sinh bắt đầu diễn ra(thường ở ngày thứ 2 sau khi bị thương)

Tăng sinh nguyên bào sợi: quá trình này diễn ra khi những nguyên bào sợi ở nhữngvùng xung quanh di chuyển tới vết thương, những nguyên bào sợi này tăng sinh, kết hợpvới collagen, proteoglycan, glycosamin sẽ hình thành lên chất nền mô liên kết của tếbào hạt Thời kỳ này đại thực bào giảm số lượng nhanh chóng và thay thế vào đó lànguyên bào sợi, thường diễn ra trong vòng 7-14 ngày sau khi bị thương

11

Hình thành mô liên kết: trong quá trình tăng sinh, nguyên bào sợi kết hợp vớicollagen hình thành lên chất nền mô liên kết, thúc đẩy quá trình hình thành cấu trúc môkhi bị tổn thuơng và tạo ra độ bền vững cho vết thuơng Bên cạnh đó collagen còn thúcđẩy quá trình hình thành chất nền mô liên kết trung bì giúp cho cytokin và các yếu tốtăng truởng hoạt động

Hình thành mao mạch: vết thuơng muốn lành nhanh cần có dinh duỡng từ máuthông qua hệ thống mao mạch Từ hoạt động của các đại thực bào và nguyên bào sợigiúp kích thích hình thành các tế bào nội mô và các mầm mao mạch, tạo ra hệ thốngmao mạch mới nuôi duỡng vết thuơng

Tăng sinh biểu mô: quá trình tăng sinh biểu mô đuợc xem là quá trình then chốt củaquá trình lành vết thuơng Với vết thuơng nhỏ, quá trình tăng sinh biểu mô diễn ranhanh hơn và vết thuơng sẽ lành nhanh hơn vết thuơng lớn, quá trình tăng sinh biểu

mô khó khăn đôi khi phải nhờ vào phẫu thuật cấy ghép để vết thuơng lành nhanh hơn.Liền vết thuơng: đặc trung của giai đoạn này là các nguyên bào sợi làm nhiệm vụkéo các mô về trung tâm, giúp vết thương liền miệng, hạn chế sẹo

4 Giai đoạn tái tạo

Giai đoạn này bắt đầu ngay khi quá trình liền vết thương diễn ra Đây là giai đoạngiúp khôi phục lại tính toàn vẹn và chức năng của mô Nó không những giúp vết thươngliền nhanh hơn, bền vững hon mà còn quyết định tới hình dạng vết thương sau quá trìnhlành hoàn thiện Neu giai đoạn này diễn ra nhanh và mạnh có thể làm vết thương hĩnhthành sẹo lồi và ngược lại

Trên đây là các giai đoạn của quá trình liền vết thương, như vậy cơ thể có cơ chế tựliền vết thương và không cần can thiệp từ bên ngoài Tuy nhiên có những tốn thươngnhiễm trùng có thể gây nguy hiểm cho người bệnh nếu không được chữa trị kịp thòi,hoặc một số tốn thương mãn tính ở người mắc bệnh tiểu đường, người bị loét do nằmlâu một chỗ, ở người già đều khó có thể tự lành nếu không được can thiệp

Muốn cho vết thương nhanh lành vẫn cần chú ý chăm sóc vết thương đáng cách vànên dùng băng vết thương dạng xịt Nacurgo để bảo vệ cũng như kích thích quá trìnhliền vết thương diễn ra nhanh hơn Vì thế băng vết thương dạng xịt Nacurgo với màng

12

sinh học Polyesteramide được coi là cứu tinh cho các vêt thương nói chung và các vêtthương khó lành nói riêng

Bị thương

Hình 1.3 Các giai đoạn làm lành vết thương

Viêm là một giai đoạn bĩnh thường của quá trĩnh điều trị vết thương, rất cần thiếttrong việc loại bỏ các vi sinh vật gây nhiễm Vi khuẩn và nội độc tố có thể dẫn đến sự giatăng các cytokin tiền viêm như TNF-a và IL-1, tuy nhiên, nếu giai đoạn này kéo dài, vếtthương có thể chuyển thành mãn tính và khó lành Trong mô da người, hàm lượngprotein chiếm khoảng 25-30%, trong đó hàm lượng collagen chiếm khoảng 72% protein.Hàm lượng hydroxyproline trong collagen là 13,5%, nên sản xuất collagen là rất cầnthiết trong quá trình làm lành vết thương Trong quá trĩnh chữa lành vết thương, các yếu

tố dinh dưỡng và hàng rào chống oxy hóa cũng giữ vai trò quan trọng do hoạt động của

tế bào tăng liên tục [21] Các nghiên cứu cho thấy NO và ROS là những yếu tố quan trọngtrong việc làm lành vết thương [22] Ở mức độ thấp, ROS có lọi cho việc bảo vệ khỏi sựxâm nhập của vi khuẩn; truyền dẫn tín hiệu nội bào; hydrogen peroxid ở mức thấp rấtcần thiết cho sự hình thành mạch máu Tuy nhiên, NO và ROS quá mức làm giảm tácdụng có lợi của nó do có tính phản ứng cao và có thể dẫn đến tốn thương mô, cản trở quátrình làm lành vết thương [23] Mặc dù, sự lành

13

vết thương là quá trình bao gồm nhiều giai đoạn trùng lắp nhau, theo các cơ chế khácnhau, nhưng nhiều nghiên cứu cho rằng sự co lại của vùng vết thương đóng vai trò quantrọng trong quá trình chữa lành vết thương liên quan đến sự di chuyển của nguyên bàosợi đến các mô bị thương [24’25]

Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang có nhiều nghiên cứu tạo ra các vật liệu sinhhọc, các chiến lược dùng tế bào gốc, chiết xuất từ thực vật trong chữa lành vết thương vàphục hồi các mô bị thương bằng các cơ chế khác nhau [26] Các nghiên cứu cho thấynhiều thảo dược có vai trò rất quan trọng trong quá trình làm lành vết thương, giúp thúcđẩy các cơ chế sửa chữa tự nhiên Dùng chiết xuất từ thảo dược trong điều trị các vếtthương có lợi vĩ tính an toàn được chấp nhận do các phản ứng quá mẫn hiếm khi xảy ra,nguồn nguyên liệu đa dạng, phong phú và rẻ tiền [27’28’29]

Quá trình tự chữa lành trải qua bốn giai đoạn mà trong đó các tế bào thực hiệnnhiều chức năng phức tạp:

Tiểu cầu bám vào các mô xung quanh vết thương khiến máu đông lại và bịt kínnhững mạch máu bị tổn hại

Việc sưng viêm xảy ra để ngăn chặn nhiễm trùng và loại bỏ bất cứ tác nhân lạ nào

14

cần trải qua các bước sau: (1) Lựa chọn các biến độc lập ảnh hưởng quan trọng tói hệnghiên cứu trong phạm vi giới hạn của nghiên cứu đó theo mục tiêu và kinh nghiệmcủa người nghiên cứu; (2) Thiết kế thí nghiệm và tiến hành thực hiện các thí nghiệm đótheo một ma trận đã vạch ra trước đó; (3) Xử lý về mặt thống kê toán học các dữ liệuthực nghiệm thu được thông qua sự tưcmg thích của hàm đa thức; (4) Đánh giá tínhtương thích của mô hình; (5) Xác minh tính khả thi và tính thiết yếu để tiến hànhchuyển hướng sang ranh giới tối ưu; (6) Tiến hành thí nghiệm dựa trên kết quả tối ưucho từng biến

Ma trận thiết kế phức hợp trung tâm được mô tả lần đầu tiên bởi hai nhà khoa học Box và Wilson bao gồm các phần sau: (1) Thiết kế thừa số phân đoạn trên các mức mã hóa: mức trung bình (0), mức thấp (-1) và mức cao (+1); 2) Thiết kế thêm các điểm nằm ngoài vùng phân đoạn, cách vị trí trung tâm (0) một khoảng ; (3) Biểu diễn các điểm trung tâm để đánh giá độ lặp lại của phương pháp

Ngoài ra, để đánh giá độ tương thích của mô hình, phân tích hồi quy ANOVA được

sử dụng và dựa trên các hệ số R2 và p để đưa ra mức ý nghĩa về mặt thống kê của mô hĩnh đạt được.Thông thường, khi tối ưu hóa các thông số cho quá nghiên cứu thực nghiệm, các nhà khoa học thường dùng phương pháp luân phiên từng biến để thay đổi các thông số khảo sát Tuy nhiên, phương pháp này có một số giới hạn, đó chính là không thể hiện rõ ràng sự tương tác/ảnh hưởng giữa các thông số với nhau và tổng số thí nghiệm thực hiện tăng nhiều khi số lượng thông số khảo sát tăng Đe khắc phục nhược điểm đó, phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology- RSM) đã được ứng dụng trong quá trình tối ưu hóa các thông số thực nghiệm Trong các nghiên cứu liênquan các quá trình hoá học, phương pháp RSM đã được ứng dụng rộng rãi trong hóa họcnhư để chiết xuất hoạt chất tự nhiên [35-40] , tống hợp hóa học [41] và tối ưu hóa các quá trình hóa học khác như khả năng hấp phụ Cu 2+, Ni 2+ và Pb 2+ từ than hoạt tính làm từ vỏ chuối[42] , loại bỏ Cu 2+trong nước [43], tối ưu hoá việc chế tạo cacbon hoạt tính ZnCh từ

bã mía để loại bỏ Cu 2+ [44],loại bỏ các ion Ni 2+ trong nước sử dụng các nguyên tử cacbonđược chế tạo từ rơm rạ [45] , tối ưu hóa điều kiện quá trình phản ứng xà phòng hóa từ dầu dừa tỉnh Ben Tre 1461 Điều này đã cho thấy

15

phương pháp bề mặt đáp ứng là rất quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu để thay thếcác phương pháp khác giúp nâng cao hiệu quả cho quá trình tối ưu hóa các thông số

16

- Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất cao chiết lá nhàu và hoạt chất lá nhàu

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và cao chiết bán thành phẩm lá nhàu

- Đánh giá hoạt tính sinh học cao chiết lá nhàu

Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cửu

17

2.2.1 Nguyên vật liệu

Lá Nhàu được thu hái từ vườn bảo tồn gen và giống cây thuốc các tỉnh phía Nam- Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh Lá Nhàu được phơi sấy khô ở điều kiện

thích hợp (nhiệt độ 40°c và trong 3 ngày) Bột dược liệu khô (được xay thành bột qua

ray có kích thước 2 mm) Cao chiết được lưu trữ lạnh trong cốc thủy tinh

Hình 2.1 Hình thái tự nhiên lá Nhàu [A], bột lá Nhàu [B]

18

2.2.2 Hóa chất và

dụng cụ Bảng 2.1 Danh sách hóa chất, thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu

- Ethanol 96%, Methanol - Sinh khối vi khuẩn:

- Diethyl ether, Ethyl acetat Escherichia coli,

- NaOH 10%, FeCb 5%, AlCb 2% Pseudomonas aeruginosa

- CH3COOH,Pb(CH3COO)2lO% và Staphylococus aureus

- KH2PO4, Na2C03 - Amoxicillin (Công ty cổ

- Chuẩn rutin (HPLC > 98%, Trung DOMESCO)

- Hệ dung môi khai triển sắc ký yeast extract 0,5%,NaCl 1%

- Thuốc thử hiện màu: FeCl3/EtOH

- Diclofenac sodium, acid ascorbic

Máy cô quay Buchi Switzeland, bếp đun

cách thủy Memmert và hệ thống máy sinh

Tủ sấy SANYO MOV -112

Lò nung LENTON FURNACES, Made in

England

Cân kỹ thuật Mettler Toledo AB204

Bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm

(Merck,Art 1,05554)

Bể siêu âm Sonorex RK-1028H (Bandelin)

Máy đo quang uv - Vis Beckman coulter

DU 730 Life Science UV/Vis, cuvette thạch

anh Spectrophotometer, cuvette thạch anh

Máy chụp ảnh CANON 16.0 mega pixels

Bể điều nhiệt Memmert WNB14, Đức

H2SO4 Xanh dương hay xanh lục ngả xanh

dương

Tri terpenoid tự do Liebermann-Burchard Đỏ nâu tím, lớp trên có màu xanh

lụcAlkaloid TT chung của Alkaloid Kết tủa

Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn

đỏFlavonoid Mg/HCl đậm đặc Dung dịch có màu hồng đến đỏ

Chiết dịch chiết cồn: bã dược liệu được chiết tiếp với cồn 96% trong bình nón với sinh hàn hồi lưu 20 - 30 phút trên bếp cách thủy, thực hiện 2-3 lần Gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 mL dịch chiết cồn Phần lớn các dịch chiết cồn đượcdùng để định tính trực tiếp các nhóm hợp chất

Chiết dịch chiết cồn thủy phân: một phần dịch chiết cồn được thủy phân để định tính các aglycon sau thủy phân Lấy 15 mL dịch chiết cồn cho vào bình nón 100 mL, thêm 10 mL acid hydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, cô còn 50%, thêm 20 mL nước Đe nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bằng diethyl ether (15mL X 3 lần) Dịch ether được dùng để định tính các aglycon

Chiết dịch chiết nước: bã dược liệu sau khi chiết bằng cồn được đem chiết nóngvới nước cất trong bình nón trên bếp cách thủy sôi Gộp các dịch chiết, đê nguội, lọc

và cô đế thu được khoảng 50 mL dịch chiết nước

Chiết dịch chiết nước thủy phân: một phần dịch chiết được thủy phân đế định tính các aglycon sau khi thủy phân Lấy 15 mL dịch chiết nước cho vào bình nón 100 mL, thêm 10 mL acid hydrocloric 10% và đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút Đe nguội, cho hỗn hợp vào bình lắng gạn và chiết bang diethyl ether (15mL X 3 lần) Dịch ether được dùng đế định tính các aglycon

21

vét mờ trên giấy lọc

> Chất béo Cắn cố mùi thơm

H2SO4 đậm đặc

► Tinh dầu ->■ Carotenoid Phản ứng Libermann-Burchard

Sơ đồ 2.2 Tóm tắt phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

22 Bảng 2.3 Tóm tắt phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Tannin DD FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen

(Polyphenol)

DD gelatin-muối Tủa bông trắng (Tanin)

Triterpenoid thủy phân Liebermann-Burchard Đỏ-nâu tím, lớp trên có màu xanh

lục

Lắc mạnh dung dịchnước

Có bọt bền

Chất khử TT Fehling Có kết tủa đỏ gạch

Hợp chất polyuronic Pha loãng với cồn 90% Tủa bông trắng vàng nâu

Phản ứng với NaOH 10%

Phản ứng với FeCl 3 5%

Phản ứng vói thuốc thử Cyanidin

Phản ứng vói Pb(CH 3 COO)2 10%

2.3.2 Phương pháp chiết xuất đun hồi lưu

• Nguyên tắc

Đun hồi lưu là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi mô thực vật dưới tác dụng của nhiệt, dung môi và các chất dễ bay hơi sẽ được chuyển trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ

23

Sản phẩm thu được sau quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, dung dịch này được gọi là dịch chiết

Ưu điểm:

- Tiết kiệm dung môi

- Thiết bị đon giản, dễ thực hiện

- Hiệu suất chiết xuất cao

- Hạn chết được ô nhiễm môi trường

Nhược điểm:

- Sau khi chiết xuất, phải tiến hành tách riêng phần các chất với nhau để thu được chất cần chiết xuất, đó là một quá trình phức tạp

- Tốn thời gian

- Không khuấy trộn được

- Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ

bị phân hủy

• Tiến hành

Cân 700 g khối lượng bột nguyên liệu khô lá Nhàu Dược liệu được ngâm cùng 17,5 lít dung môi ethanol 70% trong một bình cầu đáy tròn được nối với hệ thống ngưng tụ Đun nóng bĩnh cầu chứa dược liệu và dung môi đến nhiệt độ sôi 60°c, dung môi bốc hơi sẽ ngưng tụ và quay trở lại bình chiết Đun dược liệu trong 95 phút ở nhiệt độ 60°c để cho

dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên rồi tiến hành rút dịch chiết Dịch chiết được cô quay chân không dưới áp suất giảm thu cao

loãng và thu hồi dung môi, tiếp tục cô cao loãng đến dạng cao đặc bếp cách thủy ở 80 °c thu được cao cồn 70% lá Nhàu.

Công thức tính hiệu suất chiết cao

2.3.3 Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu và cao toàn phần

Nguyên liệu và cao chiết được kiểm định độ tinh khiết trên các chỉ tiêu “mất khối lượng do làm khô”, “độ tro toàn phần”, “độ tro không tan trong acid” dựa theo Dược điển Việt Nam V Định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học đặc trưng và sắc ký lớp mỏng; định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis dựa vào bước sóng hấp thu cực đại

Các phương pháp tiêu chuẩn hóa dược liệu

■S Xác đinh mất khối lương do làm khô

• Nguyên tắc

Sấy một khối lượng chính xác mẫu dược liệu ở nhiệt độ 105 °c cho đến khối lượng

không đổi Cân mẫu thử sau khi sấy Từ độ chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy, xác định được lượng nước, một phần hoặc toàn bộ lượng nước kết tinh và lượngchất dễ bay hơi trong mẫu dược liệu Xác định mất khối lượng do làm khô được tiến hành theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.6 trang 203), đối với mẫu nguyên liệu khô khối lượng mất do làm khô không quá 13%, đối vói mẫu cao chiết khối lượng mất do làm khô không quá 20%

• Tiến hành

Sấy chén sứ ở nhiệt độ 105 °c cho đến khi cân khối lượng 3 lần liên tiếp không đổi.

Đe nguội trong bình hút ẩm trong 15 phút

Cân chính xác khoảng 1 g mẫu dược liệu vào chén sứ, trải đều mẫu ở đáy chén sứ và sấy

ở nhiệt độ 105 °c, áp suất thường, trong 4 giờ Đe nguội trong bình hút ẩm 15 phút, cân

và ghi nhận khối lượng

25

Tiếp tục sấy mẫu ở 105 °c, áp suất thường trong 1 giờ, để vào bình hút ẩm đến nguội và

cân lại khối lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần cho đến khi cân 3 lần liên tiếp khối

lượng không đổi, độ chênh lệch không quá 5 mg.

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu

Công thức tính độ ẩm

a — b

A = -X 100 (%)

aTrong đó, A: Khối lượng mất do làm khô (%) a: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g) b:

Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

s Xác đinh đô tro toàn phần

• Nguyên tắc

Nung một khối lượng xác định mẫu dược liệu ở nhiệt độ 550 °c cho đến khi khối lượng

không đổi Cân lượng tro đến khối lượng không đổi Tro chính là phần cắn vô cơ còn lại sau khi ta đốt cháy hoàn toàn mẫu dược liệu Xác định độ tro toàn phần theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.8 trang 204), đối với phần lớn nguyên liệu, độ tro toàn phần thường trong khoảng 4 - 12%, một vài trường hợp có thể cao tới 15 - 18%, đối vói mẫu cao chiết độ tro toàn phần không quá 35%

• Tiến hành

Nung chén sứ cho đến khi khối lượng không đổi sau ba lần cân liên tiếp

Cân chính xác khoảng 1 g mẫu dược liệu khô cho vào chén sứ Trải đều mẫu ở đáy chén

và sấy ở nhiệt độ 105 °c trong 30 phút.

Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 550 °c (tránh đứng trực tiếp trước cửa lò

nung) và nung cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Đe nguộitrong bình hút ẩm khoảng 30 phút Cân và ghi lại kết quả

Thực hiện 3 lần trên 1 mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu

Công thức tính độ tro toàn phần

a — b

A = -7 — X 100 (%)

c - (c X A) v 'Trong đó, X: Độ tro toàn phần của mẫu dược liệu (%)

a: Khối lượng chén có tro (g)b: Khối lượng chén không tro (g)c: Khối lượng dược liệu dùng (g)A: Độ ẩm mẫu dược liệu (%)

s Xác đinh đô tro khôns tan trons HCl

Xác định độ tro không tan trong acid được tiến hành theo Dược điển Việt Nam V (Phụ lục 9.7 trang 203 - 204) Theo Dược điển Việt Nam V, đối với mẫu nguyên liệu khô độ tro không tan trong acid thường không quá 2,4%

Thêm vào tro toàn phần 25 mL dung dịch HC1 2M Đậy chén nung và đun sôi cách thủytrong 15 phút Lọc dung dịch qua giấy lọc không tro, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất nóng cho đến khi dịch lọc là trung tính Chuyển giấy lọc có cắn vào chén nung ở trên,

sấy khô, đốt rồi nung ở nhiệt độ 550 °c trong 4 giờ cho đến khi khối lượng không đổi

Đe nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân và ghi nhận kết quả

Đặt chén nung vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ, để nguội trong bình hút ấm và cân, ghi nhận kết quả Tiếp tục tiến hành lặp lại như trên cho đến khi

A: độ ẩm của mẫu (%)

2.3.4 Định tính ỉlavonoid bằng phương pháp hóa học

Chuẩn bị mẫu nguyên liệu: cân 5 g mẫu dược liệu khô lá Nhàu cho vào bình

erlen, thêm 50 mL dung dịch ethanol 70%, đun ở 80 °c trong 2 giờ Tập trung toàn bộ

dịch chiết được, tiến hành thực hiện phản ứng hóa học

Chuẩn bị mẫu cao chiết: cân 0,2 g cao cho vào bình erlen, thêm 50 mL dung dịch ethanol 70%, đun ở 80 °c trong 2 giờ Tập trung toàn bộ dịch chiết được, tiến hành thực

hiện phản ứng hóa học

28

Bảng 2.4 Các phản ứng hóa học định tính flavonoid

Chứng âm 2 mL EtOH

70% 2 mL EtOH 70% 2 mL EtOH 70% 2 mL EtOH 70%

Mầu thử 2 mL dịch

chiết+2 giọtNaOH 10%

2 mL dịch chiết +

2 giọt FeCb1Ò%

2 mL dịch chiết +bột Mg kim loại+ 0,5 mL HC1 đậm đặc

2 mL dịchchiết+2 giọtPb(CH3COO)210%

Kết quả

dương tính

Dung dịchchuyển màuđậm hơn dịch

chiết ban đầu

Dung dịch chuyểnsang màu xanh lụchoặc xanh đen

Dung dịch có màu

từ hồng đến đỏ

Dung dịch có tủamàu trắng

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxit) tráng trên nền phang (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh Một hệ dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc đồ gồm nhiều vết có Rf giống hoặc khác nhau Các chất hấp phụ thường dùng phân tích

flavonoid là polyamid, silica gel, cellulose

Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất cần phân tích, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách dịch chuyển của chất thử và khoảng cách dịch chuyển của dung môi

a

Rf“b29

Với a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (cm), b là khoảng cách

từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đuờng đi của vết (cm)

Chuẩn bị dung dịch mẫu thử : cân 5 g (đối với mẫu duợc liệu), 0,2 g (đối với mẫu cao chiết cồn 70% từ lá nhàu), chiết siêu âm ethanol 70% trong 15 phút cho đến hết màu Tập trung toàn bộ dịch chiết đuợc và cô đến cắn cắn hòa với 30 mL nuớc cất, siêu âm cho tan hết cắn Dịch chiết nuớc đuợc lắc với diethyl ether cho đến hết màu Dịch chiết ethyl acetat đuợc cô đến cắn còn 2 mL, tiến hành chấm sắc ký

30

Sơ đồ 2.3 Định tính flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

31

2.3.6 Định lượng ỉlavonoid bằng phương pháp cân

Thu cắn ethyl acetat từ 1 g bột dược liệu và 0,2 g cao chiết theo sơ đồ 2.4 Cânchính xác khối lượng cắn, tính lượng flavonoid có trong mẫu Lặp lại 3 lần để lấy kết quảtrung bĩnh

2.3.7 Định lượng Havonoid bằng phương pháp UV-Vis

• Nguyên tắc

Dựa vào sự tương quan giữa độ hấp thu của rutin chuẩn ở bước sóng hấp thu với nồng độ(pg/mL) tương ứng trong các điều kiện xác định, ứng dụng các phản ứng tạo màu như phản ứng cyanidin, phản ứng kết hợp với muối diazoni, tạo phức màu vói AlCb, muối Titan, Có rất nhiều phương pháp so màu khác nhau như Prusian Blue, Diazotized, phảnứng tạo phức màu với AICI3 Hàm lượng flavonoid toàn phần được tính bằng mg đương

lượng chất chuẩn có trong lg mẫu thử (mg cc/lg).

• Chuẩn bị

Mau rutin chuẩn: Cân chính xác 1 mg chất chuẩn rutin, hòa tan trong khoảng 5 mL

MeOH, sau đó cho vào bĩnh định mức 10 mL, bổ sung MeOH vừa đủ 10 mL, được dung dịch chuẩn có nồng độ 100 pg/mL Sau đó pha loãng thành các nồng độ: 60; 70; 80; 90;

100 (pg/mL)

Mầu thuốc thử AICI3 2% trong MeOH: Cân chính xác 2 g, hòa tan trong khoảng 85

mL MeOH, để trong vòng 24 giờ, sau đó cho vào bĩnh định mức 100 mL, bổ sungMeOH vừa đủ 100 mL

Chuấn bị các mẫu phản ứng

Mầu chuấn: Lấy chính xác 1 mL dung dịch mẫu chuấn đã pha ở trên cho vào ống nghiệm

có nắp vặn, thêm chính xác 8 mL MeOH và 1 mL dung dịch AICI3 2% trong MeOH, lắc đều

Mầu trắng chuấn: Lấy chính xác 1 mL dung dịch mẫu chuấn đã pha ở trên cho vào ốngnghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 10 mL MeOH, lắc đều.Mầu trắng thử: Lấy chính

■S Xác định đỉnh hấp thu cực đại của dung dịch chuẩn rutin

Khi cho dung dịch chuẩn rutin phản ứng với thuốc thử A1CỈ3 2% cho màu vàng Tiến hành xác định bước sóng hấp thu cực đại của dung dịch này trên máy quang phổ tử ngoạikhả kiến

s Xây dựng đường chuẩn rutin

Tiến hành đo độ hấp thu của chuẩn ở bước sóng hấp thu cực đại qua từng nồng độ khác nhau với mẫu trắng là MeOH Ghi nhận kết quả và xây dựng đường chuẩn định lượng flavonoid theo chất chuẩn rutin

Tiến hành xét ý nghĩa của phương trình hồi quy tuyến tính: y = ax + b

• Nghiên cứu vào năm 2001 của Sang và cộng sự nghiên cứu flavonol glycosidexuất hiện chiếm ưu thế trong lá nhàu, rutin và các flavonol glycosides khác đãđược xác định trước đây trong lá nhàu [48] Tuy nhiên, sự hiện diện củaflavonol aglycone trong lá nhàu chưa được báo cáo trước đó

• Nghiên cứu vào năm 2011 của Deng và cộng sự cho thấy 23 flavonol glycoside, chủ yếu là rutin, là những hợp chất chính trong dịch chiết nước lá nhàu qua phân tích HPLC-DAD [13]

• Nghiên cứu vào năm 2014 của Vijayapandi Pandy và cộng sự đã định lượng được rutin trong lá Nhàu bằng phương pháp LCMS/MS với hàm lượng 1.66 //g/mg

[47]

■S Xác định mật độ quang của mẫu thử

Tiến hành đo mật độ quang của các mẫu thử theo bước sóng đã xác định với mẫu trắng tương tự Thực hiện 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán.Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng lạnh, đậy kín, lắc đều ống nghiệm, sau 10 phút tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng xác định, thỉnh thoảng lắc nhẹ để phản ứng xảy

Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế do sự khuếch tán của chất kháng khuẩn từ một

lỗ đục trên mặt thạch vào môi trường xung quanh Tính kháng khuẩn của dung dịch thửnghiệm được thể hiện thông qua đường kính vòng kháng khuẩn Ba chủng vi khuẩn thử

nghiệm {Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococus aureus) được cấy

lên môi trường Mueller - Hinton

Đĩa petri hấp tiệt trùng và sấy khô

Cho 0,1 mL huyền trọc đã được hoạt hóa, trải đều trên mặt thạch, ủ khô mặt thạch

ở 37°c trong 15 phút Đục theo tỉ lệ 4 lỗ/đĩa và các lỗ cách đều nhau Dùng dụng cụ đục

lỗ thạch có đường kính 0,6 cm

Dùng Micropipette hút 100 pL dịch thử ở các nồng độ khác nhau cho vào các lỗ

đã đục

Ú các đĩa thạch ở 37 °c trong 24 giờ Đo đường kính vòng vô khuấn và mỗi khảo

sát lập lại 3 lần Sử dụng chứng dương là amoxicillin Chứng âm sử dụng nước cất vôtrùng hoặc DMSO

Đường kính vòng vô khuẩn (ĐKVK) được tính theo công thức:

ĐKVK = ĐKVKmâu thử - ĐKVK chứng âm

Đọc kết quả: Đặt thước kẻ ở đáy hộp để đo đường kính vòng vô khuẩn Ranh giớivòng vô khuẩn là nơi ức chế hoàn toàn sự tăng trưởng của vi khuẩn, được xác định bằngmắt trần

36

2.3.9 Định lượng khả năng kháng khuẩn của mẫu thử bằng phương pháp MIC

Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm

Vi khuẩn thử nghiệm được phân lập trên môi trường Mueller Hinton Agar (MHA) ở

37 °c trong 24 giờ Chuyển 3-4 khóm vi khuẩn trên vào ống nghiệm chứa 10 mL môi

trường Mueller Hinton Broth (MHB), ủ trong 4-6 giờ tại 37°c đến khi độ hấp thu ở bước

sóng 625 nm đo bằng cuvet lcm đạt từ 0,08 - 0,1; tương ứng với khoảng 108 CFU/mL.Huyền trọc vi khuẩn này được pha loãng về mật độ 107 CFU/mL bằng dung dịch đệm vôtrùng Vi khuẩn sau khi chuẩn bị xong phải đưa vào thử nghiệm trong vòng 15 phút

Thử nghiệm MIC của mẫu caoCân chính xác 500 mg cao thử nghiệm cho vào ống nghiệm vô trùng số 1 Thêm vàoống 10 mL môi trường MHA (đã được đun chảy và để nguội đến khoảng 50 °C), vortexmạnh để phân tán đều, để thu được nồng độ cao thử nghiệm là 50 mg/mL

Pha loãng 1/2 bằng cách hút lấy 5 mL trong ống số 1 cho sang ống nghiệm số 2chứa sẵn 5 mL môi trường MHA

Tiếp tục pha loãng 1/2 như trên liên tục đến ống nghiệm số 10 để thu được mộtdãy môi trường chứa cao thử nghiệm pha loãng 1/2 giảm dần

Đổ các ống nghiệm chứa cao đã pha loãng với môi trường MHA ra các đĩa petri,

để nguội cho đông rắn lại Khi thạch đông, dùng micropipet hút 1 |iL huyền trọc vi khuấn

đã chuấn bị ở trên cấy lên trên bề mặt tất cả các hộp thạch

ủ các hộp thạch ở 37 °C/24 giờ Quan sát bằng mắt thường vết vi khuẩn mọc lêntại vết cấy và ghi nhận giá trị MIC

2.3.10 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro

Hoạt tính kháng viêm của mẫu thử được đánh giá bằng phương pháp biến tính proteintheo mô tả của Alhakmani và cộng sự (2013) [32] Hỗn họp phản ứng bao gồm 2 mL mẫuthử hoặc thuốc đối chiếu ở các nồng độ khác nhau và 2,9 mL dung dịch đệm PBS (pH

6,4) được trộn với 0,1 mL albumin trứng, ủ hỗn họp ở 37 ± 1 °c trong 15 phút Sự biến tính được tạo ra bằng cách giữ hỗn họp phản ứng ở 70 °c trong nước

37

trong 10 phút Làm mát và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 660 nm Sử dụng nướccất 2 lần làm mẫu trắng Diclofenac sodium, thuốc chống viêm không steroid được sửdụng làm thuốc đối chiếu Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần và lấy trung bình Tỷ

lệ ức chế sự biến tính protein được tính bằng công thức sau:

(l,l-3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán Hoạt tính kháng oxy hóa(HTKO%) được tính theo công thức:

r -V ODc ODị HTKO (%) =

2.3.12 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng

• Nguyên tắcPhương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối

ưu hóa điều kiện chiết xuất lá Nhàu Thí nghiệm được bố trí theo kiểu trực tâm quay(Rotatable Central Composite Design) và ma trận thí nghiệm được xây dựng bằng phầnmem Design-Expert 11.0

38

Phân tích thống kê mô hình biểu diễn sự phụ thuộc của hàm mục tiêu vào các nhân

tố được mã hóa là một phương trình đa thức bậc hai có dạng:

Trong đó:

Y : hiệu suất dự đoán hàm mục tiêu, bo: hệ số hồi quy bậc 0

Xi: nhân tố độc lập thứ i ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y

bi: hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố X i vói Y

bii : hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng của yếu tố X i với Y

bij : hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời Xi và X j với Y

Bài toán tối ưu được lập dựa trên phương trình hồi quy xác định bằng phương phápquy hoạch thực nghiệm là hàm mô tả sự phụ thuộc của các hàm mục tiêu vào các nhân tốnhiệt độ, thời gian chiết và thể tích dung môi.Điều kiện ràng buộc là giói hạn của vùngnghiên cứu

• Tiến hànhKhảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tối ưu

2.3.12.1 Giai đoạn 1: Khảo sát dung môi chiết xuất dược liệu Đe giảm số thí

nghiệm trong nghiêm cứu tối ưu hóa điều kiện chiết, hướng tới xây dụng quy trình chiết phù hợp điều kiện kinh tế Nghiên cứu này, tiến hành tối ưu hóa loại dung môi chiết trước khi tiến hành khảo sát các yếu tốt khác

Điều kiện chiết xuất:

• Khối lượng nguyên liệu khô: 5g

• Nhiệt độ: 80°c

• Thòi gian chiết: 120 phút

• Tỷ lệ khối lượng nguyên liệu/ thể tích dung môi: 1:20

• Nồng độ dung môi ethanol được khảo sát: 45%, 70 %, 96%

39

Tiêu chí đánh giá để chọn nồng độ dung môi dựa trên hàm luợng flavonoid bằng phuơngpháp UV-Vis, kháng khuẩn bằng phuơng pháp đục lỗ trên bảng thạch, kháng viêm

invitro Đây là ba yếu tố tác động nhiều đến hiệu quả làm lành vết thuơng [13’15]

mềm Design-Expert 11.0

Trong đề tài này, lựa chọn ba yếu tố ảnh huởng đến quá trình chiết cao lá Nhàu lànhiệt độ (Xi), thòi gian chiết (X2) và thể tích dung môi (X3) số thí nghiệm N= 2k+ 2k +

6 (N = 20 với k =3) Trong đó, k là số biến số độc lập và 2k số thực nghiệm bổ sung tại

điểm sao Khoảng cách từ tâm đến điểm sao a = 2 m (a = 1,68 với k =3) Tất cả các nghiêncứu đuợc thực hiện ở năm mức (-a, -1,0, +1, +a) Nhu vậy, trong nghiên cứu này 20 thínghiệm sẽ đuợc thực hiện với 23 số thí nghiệm của quy hoạch toàn phần, 6 thí nghiệm lặplại tại tâm để đánh giá sai số và 6 thí nghiệm bổ sung tại điểm sao nằm cách vị trí tâmthực nghiệm một khoảng ± a

Miền khảo sát các yếu tố nhu sau: nhiệt độ ( 50 °C- 100 °C) do nhiệt độ sôi của ethanol

là 78°c nên ta chọn từ 50 °c để khảo sát sự hòa tan của các hợp chất flavonoidglycosid, đến 100 °c thì dừng vì nhiệt độ càng cao họp chất polyphenol có trong láNhàu bị phân hủy nhiệt, có khả năng bị thủy phân cắt mạnh do nhiệt độ cao Thời gianchiết ( 60 phút- 240 phút) để khảo sát sự hòa tan các hoạt chất trong lá Nhàu vào dungmôi chiết đến 240 phút thì dừng do thời gian chiết càng lâu thì các họp chất bị phân hủyđặc biệt là các họp chất thuộc họ phenol.Tỷ lệ khối luợng nguyên liệu/ thể tích dung môidung môi ( 1:10 — 1:30 ) do từ tỉ lệ 1:10 dung môi mới đủ thấm ngập nguyên liệu, hoạtchất đuợc hòa tan và đến tỉ lệ 1:30 thì phù họp với điều kiện kinh tế giúp cho việc thu hồidung môi thuận tiện

Bảng 2.5 Mã hóa các yếu tố và giá trị thực của yếu tố khảo sát

40

Điều kiện chiết xuất:

• Khối lượng nguyên liệu khô: 20g

• Nồng độ dung môi ethanol: nồng độ dung môi đã chọn tối ưu ở trên

• Nhiệt độ: bố trí theo phần mềm Design- Expert 11.0

• Thòi gian chiết: bố trí theo phần mem Design- Expert 11.0

• Tỷ lệ khối lượng nguyên liệu/ thể tích dung môi: bố trí theo phần mềmDesign- Expert 11.0

41

Bảng 2.6 Bố trí các điều kiện thí nghiệm theo phần mềm Design- Expert 11.0

Mầu Lần OD Hàm lượng

flavonoid đã trừ

độ ẩm (mg/g)

Hàm lượngflavonoid trungbĩnh đã trừ độ

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH sơ Bộ THÀNH PHẦN HÓA THựC VẬT LÁ NHÀU

Bảng 3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Nhàu

Khôngthủyjhân+++

+++

Kết quả địnhtính chung *

Ghi chú: có thể có phản ứng nhưng không thực hiện

I 1 Không có mặt của nhóm hợp chất trong dịch chiết

Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy trong lá Nhàu có nhiều các hợp chat: carotenoid, triterpenoid tự do, coumarin, antraglycosid, flavonoid, triterpenoid thủy phân, saponin, acid hữu cơ, chất khử Có các hợp chat: alkaloid, tannin Không có các hợp chất: chất béo, tinh dầu, anthocyanosid, proanthocyanidin, hợp chất polyuronic

44

3.2 TÓI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG

3.2.1 Tối ưu dung môi chiết cao lá Nhàu

Bảng 3.2 Kết quả định lượng Havonoid bằng phương pháp UV-Vis

Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị a