Nghiên Cứu Sản Xuất Vắc-Xin Bất Hoạt Phòng Bệnh Hoại Tử Thần Kinh Cho Cá Mú (Epinephelus Spp.) Ở Việt Nam.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp ) LUẬN ÁN T[.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM MẪN HỒNG PHƯỚC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN BẤT HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp.) Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 942 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Đồng Văn Quyền Hà Nội, năm 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Tồn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để công bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án ẫn HMMaanx ồng Phước Mẫn Hồng Phước ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án nhận nhiều giúp đỡ từ tổ chức cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS TS Đồng Văn Quyền (Viện Công nghệ sinh học) định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn anh, chị đồng nghiệp phòng Vi sinh vật học phân tử Viện Công nghệ sinh học hỗ trợ, giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận án Để hồn thành luận án này, tơi cịn nhận động viên, khuyến khích giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp đặc biệt gia đình tơi Tất giúp đỡ tình cảm q báu nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Mẫn Hồng Phước Mẫn Hồng Phước iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng x Danh mục hình xii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài: Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Phạm vi nghiên cứu: Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Đóng góp luận án: Địa điểm thời gian nghiên cứu: Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú 1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.4 Đặc điểm sinh sản 1.2 Tình hình bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới 1.2.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 10 1.3 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 12 1.4 Một số hiểu biết hệ miễn dịch cá xương vắc-xin 18 iv 1.4.1 Đáp ứng miễn dịch cá xương 18 1.4.2 Tổng quan vắc-xin thủy sản 22 1.4.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá 28 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Vật liệu nghiên cứu 34 2.1.1 Cá bệnh 34 2.1.2 Cá thí nghiệm 34 2.1.3 Tế bào 34 2.1.4 Hóa chất 34 2.1.5 Thiết bị 35 2.2 Phương pháp nghiên cứu 36 2.2.1 Sơ đồ bước thực 36 2.2.2 Phương pháp thu xử lý mẫu 36 2.2.3 Kỹ thuật phân lập vi rút tế bào mẫn cảm GS01 37 2.2.4 Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số 38 2.2.5 Kỹ thuật RT - PCR 38 2.2.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 39 2.2.7 Phương pháp điện di gel agarose 39 2.2.8 Phương pháp giải trình tự AND 40 2.2.9 Phương pháp xác định TCID50 NNV 40 2.2.10 Phương pháp xác định LD50 NNV 41 2.2.11 Xác định điều kiện nhân giống vi rút 42 2.2.12 Phương pháp bất hoạt vi rút 42 2.2.13 Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn 43 2.2.14 Phương pháp trung hòa tế bào 44 2.2.15 Phương pháp gây miễn dịch 44 v 2.2.16 Phản ứng ELISSA gián tiếp 45 2.2.17 Phương pháp thử thách cường độc 46 2.2.18 Đánh giá độ an toàn vắc-xin 46 2.2.19 Đánh giá hiệu vắc-xin điều kiện thực nghiệm 47 2.2.20 Kiểm tra độ khiết vắc-xin bất hoạt 48 2.2.21 Phương pháp xử lý số liệu 49 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 Kết phân lập lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắcxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú 50 3.1.1 Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh miền Bắc 50 3.1.2 Xác định độc lực vi rút ( TCID50 LD50) 55 3.1.3 Kết lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú 60 3.2 Kết chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh 70 3.2.1 Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào 70 3.2.2 Kết xác định điều kiện gây nhiễm vi rút 73 3.2.3 Kết xác định điều kiện bất hoạt vi rút 78 3.2.4 Xác định điều kiện tạo vắc xin bán thành phẩm 85 3.3 Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin 91 3.3.1 Đánh giá tiêu vật lý 92 3.3.2 Đánh giá tiêu vô trùng 93 3.3.3 Đánh giá tiêu an toàn vắc-xin 94 3.3.4 Đánh giá độ dài miễn dịch vắc-xin bán thành phẩm 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103 Kết luận 103 Kiến nghị 103 vi DANH MỤC CƠNG TRÌNH 104 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 105 Tài liệu tiếng Việt 105 Tài liệu tiếng Anh 106 PHỤ LỤC 134 Phụ lục 1: Kết sàng lọc mẫu cá nghi nhiễm NNV 134 Phụ lục 2: Trình tự gen T4 mẫu TB05 HP02 136 Phụ lục 3: Trình tự gen T4 chủng NNV TB05 qua 10 đời cấy chuyển 137 Phụ lục 4: Ảnh tiêm cá thí nghiệm 142 Phụ lục 5: Thử nghiệm vắc-xin cho cá giống 142 Phụ lục 6: TCVN 8684:2011 143 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ nghĩa Việt Chữ viết tắt Aa Amino acid (axit amin) AH Aluminum hydroxide AP Aluminum phosphate ARN Ribonucleic acid (axit ribonucleic) BEI Benary ethylenimine BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh cá bơn) Bp Base pair (cặp bazơ) BSA Bovine serum albumin (huyết bò) cDNA Complementary deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic bổ sung) CPE Cytopathogenic effect (hiệu ứng hủy hoại tế bào) CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) CNS Central nervous system (hệ thống thần kinh trung ương) cs Cộng Da Dalton DAB Diamino bezidine DNA Deoxyribonucleic acid (axit deoxyribonucleic) EDTA Ethyllene diamine tetra acetic acid ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EPC Epithelioma papulosum cyprinid EtBr Ethidium bromide FBS fetal bovine serum (huyết bào thai bò) FCA Freun´d complete adjuvant (chất bổ trợ hoàn chỉnh Freund) viii HRP Horseradish peroxidase (Enzyme Horseradish Peroxidase) kb Kilobase kDa Kilodalton GS Grouper spleen (lá lách cá mú) Ig Immunoglobulin (kháng thể) L-15 Leibovitz’s-15 LD50 Lethal Dose 50% (liều gây chết 50%) MHC Major Histocompatibility Complex (tổ hợp tương hợp mơ chính) MMC Melanomacrophage (tế bào hắc tố) MOI Multiplicity of infection (Tỷ lệ lây nhiễm trùng) NCR Non coding region (vùng không mã hóa) ND Not done (khơng thực hiện) Nt Nucleotide NNV Nervous Necrosis Virus (vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh) OIE Office International des Epizooties (Tổ chức Thú y giới) ORF Open Reading Frame (khung đọc mở) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi Polymerase) PFU Plaque Forming Units (đơn vị hình thành vết tan) RGNNV Red - spotted grouper nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh cá mú đốm đỏ) RPS Relative percent survival (tỉ lệ bảo hộ) RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulphate SJNNV Striped jack nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh cá bơn sọc) ix TAE Tris acetate EDTA TBS Tris Buffered Saline (đệm muối Tris) TBST TBS - Tween TCID50 Tissue culture infectious dose 50% (liều gây nhiễm 50% tế bào) TPNNV Tiger puffer nervous necrosis virus (vi rút hoại tử thần kinh cá hổ) UV Ultraviolet light (tia cực tím) VER Viral encephalopathy and retinopathy (vi rút gây bệnh não võng mạc) VLPs Virus-like particles (các phần tử giống vi rút) VNN Viral Nervous Necrosis (bệnh hoại tử thần kinh) x DANH MỤC BẢNG TT Nội dung bảng Bảng 1.1 Một số vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh Trang 30 cá mú Bảng 3.1 Kết sàng lọc gen T4 mẫu cá nghi 51 nhiễm NNV Bảng 3.2 Kết nuôi cấy mẫu bệnh phẩm tế bào GS01 53 Bảng 3.3 Kết xác định TCID50 tế bào GS01 56 Bảng 3.4 Kết xác định LD50 cá mú giống 58 Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn 59 gen T4 Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên 60 mẫu Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ khiết giống gốc 62 Bảng 3.8 Kết xác định hiệu giá vi rút chủng giống gốc 63 10 Bảng 3.9 Kết kiểm tra độ ổn định chủng NNV TB05 64 11 Bảng 3.10 Xác định pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế 71 bào GS01 12 Bảng 3.11 Xác định mật độ tế bào ban đầu, thời điểm thu 71 hoạch vi rút 13 Bảng 3.12 Hiệu giá vi rút gây nhiễm với liều khác 74 14 Bảng 3.13 Kết tinh vi rút hệ thống lọc 76 GLASSCO 15 Bảng 3.14 Hiệu suất thu hồi vi rút lọc tiếp tuyến 77 siêu ly tâm 16 Bảng 3.15 Kết đánh giá mức độ bất hoạt NNV 79 17 Bảng 3.16 Xác định nồng độ hóa chất β-propiolactone 82 xi 18 Bảng 3.17 Kết xác định vi rút sống tồn dư sau bất hoạt 84 19 Bảng 3.18 Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vắc-xin 92 20 Bảng 3.19 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vật lý vắc-xin 92 21 Bảng 3.20 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng vắc-xin 93 22 Bảng 3.21 Xác định mức độ an toàn vắc-xin 95 23 Bảng 3.22 Kết theo dõi tế bào có chức miễn dịch 98 xii DANH MỤC HÌNH TT 10 11 12 13 14 15 16 17 Nội dung hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc không gian vi rút hoại tử thần kinh 13 Hình 1.2 Cấu trúc genome vi rút hoại tử thần kinh 14 Hình 2.1 Sơ đồ bước thực 36 Hình 3.1 Mẫu cá mú ghi nhiễm vi rút NNV 50 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR số mẫu 52 nghi nhiễm Hình 3.3 Hình ảnh tế bào GS01 53 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra gen 65 Hình 3.5 So sánh trình tự gen T4 10 đời vi rút 68 Hình 3.6 Đơng khơ giống gốc vi rút NNV TB05 69 Hình 3.7 Ảnh hưởng mơi trường đến mật độ tế bào 70 Hình 3.8 Tế bào trước sau nuôi cấy vi rút hoại tử thần kinh 72 Hình 3.9 Kết xác định liều gây nhiễm MOI 74 Hình 3.10 Kết phát kháng thể đặc hiệu kháng 80 nguyên Hình 3.11 Biến động kháng thể cá với kháng nguyên bất hoạt 82 Hình 3.12 Biến động kháng thể đặc hiệu cá với kháng 84 nguyên sau bất hoạt (OD450) Hình 3.13 Tỷ lệ sống cá gây miễn dịch với liều 86 kháng nguyên Hình 3.14 Tỷ lệ sống cá gây miễn dịch mức 87 thời gian 18 Hình 3.15 So sánh mức độ bảo hộ cá với vắc-xin bất hoạt có chất bổ trợ khác 89 19 Hình 3.16 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng vắc-xin 94 20 Hình 3.17 Mơ não võng mạc cá nhuộm hematoxylin eosin 96 21 Hình 3.18 Tỷ lệ sống cá lô thử nghiệm vắc-xin 100 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam có điều kiện địa lý khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có bờ biển dài 3.260 km, 12 đầm phá eo vịnh, 112 cửa lạch có 600.000 vùng triều [244] Đó điều kiện thuận lợi cho việc phát triển nghề biển nói chung nghề ni trồng thuỷ sản nói riêng Ngành ni trồng thủy sản xem ngành kinh tế mũi nhọn Việt Nam liên tục tăng trưởng năm gần diện tích sản lượng Tổng sản lượng thủy sản năm 2022 ước đạt 9.026,3 nghìn tấn, tăng 2,7% so với năm 2021, sản lượng thủy sản ni trồng ước đạt 5.163,7 nghìn tấn, tăng 6,3% so với năm 2021 [243] Một số lồi cá có giá trị kinh tế nuôi trồng cá chẽm (Lates calcarifer), cá hồng (Latjanus spp.), cá giò (Rachycentron canadum), cá mú (Epinephelus spp.)… Sản lượng ni trồng cá biển đạt 58 nghìn diện tích ni 6.000 [243] Tuy nhiên, nghành nuôi trồng thủy sản giới Việt Nam ln phải đối mặt với khó khăn thách thức, đặc biệt năm gần đây, bệnh vi rút động vật thủy sản bệnh xuất huyết cá trắm cỏ, bệnh vi rút mùa xuân cá chép, bệnh Iridovirus cá mú, bệnh hoại tử tụy truyền nhiễm, hoại tử lách thận truyền nhiễm, hoại tử quan tạo máu truyền nhiễm, tụ huyết trùng vi rút gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế cho nuôi trồng thủy sản Theo báo cáo của Sneeringer cộng sự, 2019, hàng năm 10% sản lượng động vật thuỷ sinh thất thoát bệnh truyền nhiễm, thiệt hại 10 tỷ USD toàn cầu [198] Ở Việt Nam, thiệt hại gây dịch bệnh ngành thủy sản gần tỷ USD năm [17] Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) phát hầu giới, gây ảnh hưởng đến 120 lồi cá biển [211], có nhiều lồi cá biển có giá trị kinh tế cao Bệnh xác định vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây [17, 29] Cá mắc bệnh hoại tử thần kinh xuất triệu chứng đặc trưng: bơi lội không định hướng, thân sẫm màu, bỏ ăn, cá bị bệnh chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết từ 80-100% [29, 154, 155] Ở Việt Nam, bệnh hoại tử thần kinh xuất hầu hết vùng nuôi cá nước Mùa vụ phát bệnh từ tháng đến tháng 10, nhiệt độ nước dao động từ 24 đến 300C Tỷ lệ chết vi rút hoại tử thần kinh gây dao động từ 50-100% tùy thuộc theo loài giai đoạn xuất bệnh [3] Số liệu từ nghiên cứu trường Đại học Nha Trang, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II cho thấy, tỷ lệ cá mú nhiễm vi rút hoại tử thần kinh lên tới 82% mẫu cá bệnh thu thập [1, 4] Dịch bệnh nuôi trồng thủy sản ngày có xu hướng gia tăng qua năm, phạm vi lây nhiễm rộng, tỷ lệ mắc cao, chủng loại đa dạng, thời gian khởi phát kéo dài, thế, việc kiểm sốt dịch bệnh ni trồng thủy sản vấn đề cấp thiết [50, 199] Kiểm soát dịch bệnh chế phẩm vi sinh, chất kích thích miễn dịch, vắc-xin ngày ứng dụng nhiều mô hình canh tác sinh thái Trong đó, sử dụng vắc-xin biện pháp phòng bệnh hiệu an toàn để ngăn ngừa dịch bệnh gây nên vi rút, vi khuẩn [139, 199] Vắc-xin phòng bệnh cho động vật thuỷ sản gồm nhiều loại khác nhau: vắc-xin bất hoạt, vắc-xin nhược độc, vắc-xin tái tổ hợp, vắc-xin tiểu phần, vắc-xin DNA [209] Hiện tại, hầu hết loại vắc-xin thủy sản thương mại loại vắc-xin bất hoạt tính an tồn Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng giai đoạn ấu trùng, cá bột, cá hương, cá giống với tỷ lệ chết lên tới 100%, vậy, vắc-xin phịng bệnh hoại tử thần kinh thường dùng cho cá đường ngâm [130] Xuất phát từ sở lý luận nhu cầu thực tiễn trên, luận án: “Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú (Epinephelus spp.) tiến hành nhằm tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoạt tử thần kinh cho cá mú 3 Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu chung Nghiên cứu vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú từ chủng vi rút phân lập miền Bắc, Việt Nam 2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập lựa chọn chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh làm giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng vắc-xin Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1 Ý nghĩa khoa học Luận án sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú với bước: phân lập, tuyển chọn chủng giống làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin, đánh giá chủng giống gốc, nhân nuôi vi rút tế bào, bất hoạt vi rút, xác định điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm đánh giá chất lượng vắc-xin bán thành phẩm Kết nghiên cứu liệu khoa học, cung cấp thêm tư liệu tham khảo cho nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh cho đối tượng cá biển có giá trị kinh tế cao 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Luận án nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt keo phèn đạt tiêu an tồn hiệu phịng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Đối tượng phạm vi nghiên cứu 4.1 Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ số lồi cá mú ni số tỉnh khu vực miền Bắc 4.2 Phạm vi nghiên cứu: Các chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phân lập từ cá biển nuôi vùng biển quanh đảo Cát Bà, vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) Đóng góp luận án Luận án nghiên cứu cách toàn diện đặc điểm chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú, bao gồm tính khiết, tính sinh miễn dịch bảo hộ, tính ổn định mặt di truyền suất sau nhân nuôi tế bào GS01 Luận án sản xuất vắc-xin bất hoạt keo phèn chủng vi rút TB05 phân lập tỉnh Thái Bình, vắc-xin bất hoạt keo phèn sử dụng cho cá phương pháp ngâm, tỷ lệ an toàn 100%, tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% sau tháng 5 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá mú 1.1.1 Hệ thống phân loại cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, họ phụ cá mú (Epinephelinae), giống Epinephelus, tên tiếng Anh: groupers Có tất 87 lồi liệt kê chi Epinephelus (E.), riêng khu vực Ấn Độ, Thái Bình Dương phát 63 loài thuộc giống Epinephelus [73] Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 lồi cá mú [10] Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Chordata Lớp (class) Actinoptergii Bộ (ordo) Perciformes Họ (familia) Serranidae Phân họ (subfamilia) Epinephelinae Chi (genus) Epinephelus 1.1.2 Đặc điểm phân bố Cá mú loài cá sống đáy rạn san hô, đá cứng, vùng nước ấm, phân bố chủ yếu vùng biển nhiệt đới, nhiệt đới thấy vùng biển ơn đới Nhiệt độ thích hợp cho lồi cá mú phát triển từ 22320C, thích hợp 25-300C Cá chịu độ mặn từ 11- 41‰ [89, 182] Môi trường sống cá mú thay đổi tuỳ theo loài, phần lớn loài sống độ sâu 100 m, E flavolimbatus tìm thấy đáy cát bùn [108], đó, lồi E nigritus, E niveatus tìm thấy độ sâu lên tới 200 m 400-500 m Con non nhiều loài cá mú phân bố vùng nước nông ven biển [184, 208], cá mú khổng lồ (E itajara) quan sát thấy rừng ngập mặn [38] Nhiều loài cá bắt gặp chủ yếu vùng rạn cá mú kẻ mờ (Cephalopholis boenak), cá mú (E trimaculatus), cá mú lưng dày (E fasciatomaculosus), số loài phân bố rộng nhiều sinh cảnh khác nhau, cá mú mè (E coioides) cá mú nâu (E bruneus) giai đoạn cá thường bắt gặp thấy vùng cửa sông, ven bờ vũng vịnh [74, 89], cá mú điểm gai (E malabaricus) bắt gặt đầm phá, rạn san hô, rừng ngập mặn, vùng đáy cát bùn; giai đoạn non bắt gặp vùng cửa sông ven bờ [89] 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng Sự tăng trưởng cá mú khác loài Thời gian ni để đạt kích thước thương mại cá mú nghệ (E lanceolatus) tháng, cá mú điểm gai 12 tháng cá mú mè từ 12 đến 15 tháng [200] Cá mú khổng lồ (E itajara) lồi cá mú có kích thước lớn nhất, chúng sinh sống đầm phá rạn san hơ sâu khắp khu vực Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương, kích thước trưởng thành lồi với tổng chiều dài 2,3 m khối lượng thể 400 kg [89] Nhìn chung, cá mú bột sau ngày tuổi có chiều dài trung bình 2,18 mm, miệng đóng, chưa có sắc tố, khối nỗn hồng cịn Sau ngày tuổi, miệng mở, cá bắt đầu ăn thức ăn ngồi, lúc ống tiêu hố chưa hồn chỉnh Khi cá đạt 12 ngày tuổi, dài 3,57 mm, miệng, mắt, ống tiêu hố hồn chỉnh, bắt đầu phát triển sắc tố thân Sau 18 ngày tuổi, chiều dài cá từ 5-8 mm, gai lưng thứ dài, giai đoạn cá nhạy cảm với yếu tố bên ngồi, vậy, tỷ lệ hao hụt lớn Cá 32 ngày tuổi, chiều dài 8-10 mm, vây phát triển hồn thiện có sắc tố đen tất tia vây, gai lưng thứ thể ngắn lại Cá 39 ngày tuổi dài 10-12 mm, vây hoàn chỉnh, tỷ lệ gai lưng thứ giảm đáng kể Cá 54 ngày tuổi dài 16,5 mm, gai lưng ngắn, hình dáng sắc tố giống cá trưởng thành 7 1.1.4 Đặc điểm sinh sản Hầu hết tất lồi cá mú lồi lưỡng tính nguyên sinh [158] Tuyến sinh dục ban đầu chưa biệt hóa sau chúng biệt hóa thành buồng trứng tất cá thể [156] Sau trưởng thành thành cái, chúng trải qua trình thay đổi giới tính thành đực, biến đổi buồng trứng thành tinh hồn [157] Sự thay đổi giới tính tự nhiên loài cá mú xảy từ đến 11 tháng tuổi, tùy theo loài [44, 203] Ví dụ cá mú dài thay đổi giới tính từ sang đực 10 tháng tuổi trở lên [122] Dựa quan sát mô học tuyến sinh dục cá mú tổ ong, thay đổi giới tính tự nhiên biết xảy mùa khơng sinh sản cá thể có kích thước thể lớn, tổng chiều dài >20 cm Mặt khác, thay đổi môi trường dẫn tới thay đổi giới tính hầu hết lồi cá lưỡng tính [46, 132] Các yếu tố mơi trường nhiệt độ nước thời gian chênh lệch chiếu sáng ban ngày ban đêm kiểm soát khởi đầu tiến trình trưởng thành tuyến sinh dục cá [138] Dựa đặc điểm nêu trên, số nhà khoa học thực kích thích cá mú trưởng thành mùa khơng sinh sản cách điều chỉnh môi trường nuôi điều trị hormone, Kanemaru cộng sự, 2012 kích thích sinh sản cá mú tổ ong (E merra) điều kiện có kiểm sốt nhiệt độ nước thời gian dài, với sử dụng GnRH [113] Tương tự vậy, cá mú đốm đỏ (E akkara) trưởng thành rụng trứng tạo cách điều chỉnh môi trường nuôi mùa khơng sinh sản [127] Cá mú có xu hướng đẻ trứng vào đầu mùa xuân mùa hè Mặc dù số loài cá mú (E cruentatus) sinh sản quanh năm, cịn lại hầu hết lồi cá mú sinh sản khoảng thời gian từ tháng đến tháng [192] Hoạt động sinh sản cá mú thường tương quan với chu kỳ mặt trăng [183, 193], cá mú Nassau báo cáo sinh sản mạnh vào thời điểm trăng non Bahamas [197] vào khoảng trăng tròn Belize [105] Ngoài ra, cá mú giống nhiều loài cá sinh sản rạn san hô, đẻ trứng chủ yếu vào lúc hồng [51], Colin, 1992 quan sát thấy trình sinh sản cá mú Nassau diễn khoảng 20 phút trước mặt trời lặn, với đỉnh điểm 10 phút trước đến 10 phút sau mặt trời lặn [51] 1.2 Tình hình bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú giới Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) vi rút hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus-NNV) gây ra, vi rút biết đến tác nhân gây bệnh não võng mạc (Viral encephalopathy and retinopathy-VER) viêm não 120 loài cá biển, nước lợ nước [29, 52, 168, 229] Vi rút hoại tử thần kinh phá hủy hệ thần kinh trung ương cá bị nhiễm bệnh, gây tỷ lệ tử vong cao, đặc biệt giai đoạn ấu trùng cá bột, tỷ lệ tử vong lên đến 80-100% [29, 154, 155] Bệnh hoại tử thần kinh báo cáo thức tồn giới, ngoại trừ Nam Mỹ [62] Báo cáo Tổ chức Thú y giới (Office International des Epizooties-OIE) 2019 cho biết, VNN xuất quốc gia khu vực châu Á Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Philippines, Thái Lan, Việt Nam; Châu Đại Dương Úc, Tahiti; vùng Địa Trung Hải Pháp, Hy Lạp, Ý, Malta, Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Tunisia quốc gia khác như, Vương quốc Anh, Na Uy, Quần đảo Caribe Bắc Mỹ [168] Mặc dù nay, vi rút hoại tử thần kinh chưa phân lập từ Nam Mỹ phát từ cá nhập khỏe mạnh Amazon [144] Bệnh hoại tử thần kinh báo cáo hầu hết quốc gia Địa Trung Hải liên quan đến sản xuất cá chẽm (Lates calcarifer) cá tráp vây vàng (Sparus latus) châu Âu như: Tây Ban Nha, Pháp, Ý Hy Lạp, nước Bắc Phi [29] Lần dịch bệnh bệnh hoại tử thần kinh phát nhiều trang trại nuôi cá chẽm Địa Trung Hải vào mùa hè năm 1995, với tỷ lệ tử vong ngày tăng giai đoạn 1995–1998 Kể từ đó, bệnh hoại tử thần kinh coi mối đe dọa thực nuôi trồng thủy sản Địa Trung Hải [182], coi yếu tố hạn chế sản xuất cá chẽm nước Địa Trung Hải thách thức nghề nuôi cá tráp biển [70, 155, 169, 242] Gần đây, đợt bùng phát bệnh hoại tử thần kinh nghiêm trọng ấu trùng cá giống ghi nhận nhiều nơi, tỷ lệ tử vong hàng loạt liên quan đến bệnh hoại tử thần kinh mô tả cá mú sẫm màu (E marginatus) cá chình (Muraena helena) [37, 114, 212, 214, 215, 220, 225] Ở châu Á, tỷ lệ tử vong hàng loạt ghi nhận giai đoạn ương giống cá mú Singapore, cá mú chấm đỏ (E akaara) cá háo sọc (Pseudocaranx dentex) Nhật Bản, cá đối đầu dẹt (Mugil cephalus) Trung Quốc, cá hồng mỹ (Sciaenops ocellatus) Israel [90, 131, 150, 151, 213] Ở Bắc Mỹ, bệnh VNN phát cá chẽm trắng (Atractoscion nobilisthe) cá tuyết Đại Tây Dương [55, 106] Ngoài ra, bệnh hoại tử thần kinh khơng lây nhiễm cá biển mà cịn nhiều loại động vật thủy sinh nước Kể từ năm 2002, 60 loài nước xác minh vật chủ Betanodavirus Bệnh hoại tử thần kinh gây tỷ lệ tử vong cao quần thể bị nhiễm bệnh, bao gồm cá da trơn Úc (Tandanus tandanus) [154], cá tầm (Acipenser gueldenstaedtii) [21], cá rô phi (Oreochromis niloticus) [30], cá vàng (Carassius auratus) cá ngựa vằn (Danio rerio) 2013 [31], cá muỗi (Gambusia affinis) [175] 1.2.2 Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam Nghề nuôi cá mú Việt Nam năm 1990 Cho đến năm 2003 số khu vực nuôi cá mú tập trung phát triển vùng biển Quảng Ninh, 10 Hải Phịng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu Kiên Giang [5, 10] Trong năm qua nước ta có 500 vùng biển ven bờ xây dựng thành ao đìa ni cá mú Sản lượng cá mú hàng năm đạt 3000 sản phẩm Cá mú chấm đỏ, cá mú chấm nâu đối tượng nuôi lựa chọn nhiều người dân vùng ven biển Ở Việt Nam phát số loài cá mú nhiễm bệnh hoại tử thần kinh, bao gồm loài: E coioides, E fuscogutatus, E tauvina, E lanceolatus, E malabaricus Khánh Hòa, E coioides Cát Bà (Hải Phòng) Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam phát lần vào năm 2002 lồng nuôi Vân Đồn, Quảng Ninh Theo Phan Thị Vân công sự, 2004, bệnh xuất từ tháng đến tháng 10 hàng năm nhiệt độ từ 25 đến 300C, nhiệt độ 280C độc lực vi rút mạnh nhiều so với nhiệt độ 160C [11] Cá mú ương từ 40 đến 45 ngày Cửa Hội, Nghệ An bị bệnh hoại tử thần kinh có dấu hiệu bỏ ăn, bơi xoay tròn, tỷ lệ chết lên tới 70 - 80% vòng ngày Bằng phương pháp chẩn đốn mơ bệnh học tìm thấy khơng bào có kích cỡ 5-7 µm, màu trắng đục não cá Cá nuôi từ 45 ngày đến tháng tuổi nhiễm bệnh nhận biết qua dấu hiệu như: bơi khơng định hướng, bơi quay trịn, cá ăn hay bỏ ăn, bóng phồng, thân đen xám, đuôi vây chuyển màu đen, mắt đục, cá bệnh hoạt động yếu, đầu treo mặt nước đáy bể, lồng Cá chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết từ 80-100% [11] Theo Trần Vĩ Hích cộng sự, 2008, Khánh Hịa, có gần 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại VNN Giai đoạn cá nhỏ (5-20 cm) thường chịu tác hại nặng giai đoạn cá lớn, tỷ lệ chết từ 50 đến 100% Vào tháng năm 2008, VNN xuất cá mú cỡ 5-6 cm nuôi bè trại thực nghiệm trường Đại học Nha Trang, bệnh lây lan nhanh gây chết 100% cá vịng tuần Khi cá ni lồng bị bệnh người ta cịn quan sát 11 số lồi cá khác sống xung quanh lồng có dấu hiệu bệnh tương tự [4] Quan sát mô bệnh học cá mú chấm nâu, cá mú cọp, cá mú mỡ, cá mú nghệ, cá chẽm, cá bớp (cá giò) chết với dấu hiệu bệnh hoại tử thần kinh nuôi Khánh Hoà cho thấy, vi rút phá huỷ tế bào thần kinh võng mạc mắt, tạo khơng bào có hình trịn hình elip với kích thước từ 430 µm [4] Kết điều tra khoa Nuôi trồng thủy sản, Đại học Nha Trang cho thấy, cá mú ni vùng biển Khánh Hịa thường xuất dấu hiệu tương tự bệnh hoại tử thần kinh bơi khơng định hướng, bơi thành vịng tròn mặt nước, cá bỏ ăn, thân màu sậm [11] Theo Nguyễn Ngọc Du cộng sự, 2005, bệnh hoại tử thần kinh thường xảy cá mú giống nuôi Vũng Tàu Khi tiến hành xét nghiệm 64 mẫu cá có 53 mẫu cá nhiễm bệnh với tỷ lệ nhiễm 82,8% bệnh gây chết tồn cá ni [1] Đầu năm 2013, dịch bệnh cá mú lại xuất vùng nuôi xã Xn Thịnh Xn Hịa thuộc thị xã Sơng Cầu (tỉnh Phú Yên) Số lồng bị bệnh 370 tổng số 527 lồng nuôi khu vực Tỷ lệ cá mắc bệnh từ 50-70%, kích cỡ cá bị bệnh từ 0,4-0,7 kg/con Cá mú bị chết vào thời điểm đầu tháng đến tháng [4] 1.3 Tổng quan vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh cá xác định Betanodavirus [29, 52, 168] Betanodavirus có hệ thống phân loại: Ngành: Vi rút Họ: Nodaviridae Giống: Alphanodavirus (nhiễm côn trùng) Betanodavirus (nhiễm cá) [168] 12 Vi rút khơng có vỏ bọc, hình cầu, đường kính từ 25-30 nm, có đối xứng hình tứ diện, vỏ protein bao gồm 180 protein với khối lượng 42 kDa Hình 1.1 [188] Hệ gen Betanodavirus có cấu trúc ARN mạch đơn, sợi dương, tuyến tính hai đầu [62] gồm có hai tiểu phần: Tiểu phần lớn hệ gen chứa ARN1 (3.1 kb) mã hóa cho protein 1a có kích thước 110 kDa với chức ARN polymerase (hay gọi protein A) Một khung đọc mở (ORF) ORF1b (khung đọc mở có trình tự phần đầu 3' ORF1a), ORF1b mã hóa cho protein B1 (11 kDa) B2 (8,5 kDa) (Nguồn: L Tang and J.E Johnson (1998)) Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian vi rút hoại tử thần kinh A: Mô cấu tạo hạt vi rút; B: Cấu trúc 20 mặt đối xứng với T=3 vi rút; C: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử vi rút (50nm) Tiểu phần nhỏ hệ gen chứa gen ARN2 (1.4 kb) mã hóa cho phân tử protein 2a có kích thước 42 kDa Trên ARN2 chứa khung đọc mở (ORF) cho protein vỏ đồng thời chứa hai vùng bảo thủ cao T2 (870 bp) T4 (420 bp) [164] Gen ARN3 mã hóa protein B2 có hoạt động ức chế ARN mạnh mẽ, Alphanodavirus [115, 116, 168, 201, 241] 13 (Nguồn: L.A Ball and K.L Johnson (1998)) Hình 1.2 Cấu trúc hệ gen vi rút hoại tử thần kinh Đặc tính kháng nguyên Betanodavirus Các nghiên cứu huyết học chứng minh bốn kiểu gen vi rút hoại tử thần kinh mã hố thành ba kiểu kháng ngun riêng biệt [151, 172] Theo Mori kiểu kháng nguyên A tương ứng với kiểu gen SJNNV, nhóm B với TPNNV nhóm C với RGNNV BFNNV [151], cịn Panzarin cho kiểu kháng nguyên B bao gồm chủng mang kiểu gen BFNNV TPNNV thuộc kiểu kháng nguyên C [172] Đặc tính sinh học Betanodavirus Giống Betanodavirus phân thành kiểu gen chính, bao gồm: vi rút hoại tử thần kinh cá bơn sọc (SJNNV), vi rút hoại tử thần kinh cá hổ (TPNNV), vi rút hoại tử thần kinh cá mú đốm đỏ (RGNNV) vi rút hoại tử thần kinh cá bơn (BFNNV) [52, 168, 188, 212], nhóm kiểu gen thứ năm có nguồn gốc từ cá bơn, gọi vi rút hoại tử thần kinh cá bơn (TNV), đề xuất Kim cộng sự, 2019 vi rút hoại tử thần kinh động vật có vỏ (KSNNV) Hàn Quốc [117] Những phát cho thấy khả có nhiều chủng khác dựa loài cá khác chưa biết đến 14 Mỗi kiểu gen có phân bố theo vùng miền địa lý đặc tính gây bệnh khác [32, 48, 124, 162, 210] Kiểu gen RGNNV BFNNV có phạm vi ký chủ rộng, ảnh hưởng đến lồi cá nhiệt đới ơn đới, RGNNV phân bố rộng rãi không gây bệnh cá ni mà cịn lồi cá hoang dã lưu vực Địa Trung Hải, dọc theo bờ biển Châu Á Châu Úc [48, 162, 210] cá chẽm trắng nuôi (Atractoscion nobilis) California [55] Ngược lại, kiểu gen vi rút nhóm SJNNV vi rút nhóm TPNNV có phạm vi ký chủ hẹp, kiểu gen vi rút nhóm TPNNV mơ tả lồi Nhật Bản [164], kiểu gen vi rút nhóm SJNNV thời gian dài phát cá nuôi vùng biển Nhật Bản, cá tráp biển Senegal cá vằn nuôi bán đảo Iberia [56] Điều kiện nhiệt độ giúp cá chống lại lây nhiễm vi rút có khả giúp vi rút lây nhiễm vào cá [43] Điều đặc biệt rõ ràng Betanodavirus, kiểu gen vi rút gây bệnh nhiệt độ khác (ở nhiệt độ 15-200C gây bệnh vi rút nhóm BFNNV, nhiệt độ 200C gây bệnh vi rút nhóm TPNNV, cịn với vi rút nhóm SJNNV nhiệt độ gây bệnh từ 20-250C nhiệt độ 25-300C gây bệnh vi rút nhóm RGNNV) [168] Trong vi rút nhóm BFNNV báo cáo gây bệnh nhiệt độ thấp từ đến 150C [166], đợt bùng phát vi rút hoại tử thần kinh liên quan đến kiểu gen vi rút nhóm RGNNV báo cáo vùng có nhiệt độ nước từ 23 đến 300C (ở cá vược) từ 28 đến 300C (ở loài cá mú khác nhau) [62, 210] Các báo cáo thực nghiệm chứng minh ảnh hưởng nhiệt độ đến khả gây bệnh vi rút hoại tử thần kinh [81, 210, 220] Đặc điểm dịch tễ Betanodavirus Vi rút hoại tử thần kinh lây truyền theo chiều ngang chiều dọc [88] Trong môi trường nước biển, Betanodavirus tồn nhiệt độ thấp thời gian dài; lây truyền vi rút từ khu vực bị nhiễm bệnh 15 sang khu vực khác dịng thủy triều phương tiện vận tải di chuyển từ khu vực có mầm bệnh mang sang [167] Phương thức truyền bệnh theo chiều ngang: vi rút từ cá bị bệnh lây lan sang cá khoẻ mạnh qua tiếp xúc trực tiếp vi rút lan truyền gián tiếp thơng qua thức ăn, dịng chảy bị nhiễm Vi rút theo dịch tiết cá bị bệnh ô nhiễm vào môi trường nước chúng xâm nhập vào cá khỏe mạnh qua mang, da, miệng cá lây lan qua dụng cụ chuyên dùng ni cá lưới, vợt, dây sục khí Theo nghiên cứu Chi cộng sự, 2003, cá tạp nhỏ thu từ trại nuôi cá bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh dùng làm thức ăn cá ni bị lây nhiễm bệnh Betanodavirus phát động vật khơng xương sống biển lồi nhuyễn thể hai mảnh loài chân đốt [107, 171, 224] Việc phát Betanodavirus sinh vật sống nước khác lồi thân mềm vai trị chúng vật trung gian truyền bệnh mơ tả [219] Ngồi ra, cá ni bể ăn thịt lẫn xem đường lây nhiễm vi rút hoại tử thần kinh Có vài nhân tố ảnh hưởng đến phương thức lan truyền theo chiều ngang mật độ cá nuôi, nhiệt độ nước độc lực chủng vi rút điều kiện nuôi dưỡng Phương thức truyền bệnh theo chiều dọc: Vi rút gây bệnh truyền từ bố mẹ sang qua trứng tinh trùng, điều báo cáo cá mú vạch, cá măng sọc, cá bơn, cá chim sử dụng phương pháp ELISA để phát có mặt vi rút trứng tinh trùng cá bố mẹ [39] Sự lây nhiễm vi rút vào buồng trứng cơng bố lồi Dicentrarchus labrax [22, 39] Vi rút hoại tử thần kinh lây lan từ cá bố mẹ sang ấu trùng qua đường lây truyền dọc nhiều loài cá khác nhau, bao gồm cá vược sọc, cá vược châu Âu cá vược châu Á [26, 58] 16 Cơ chế gây bệnh Betanodavirus Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ tạo lây nhiễm thức cách xâm nhập vào tế bào nhạy cảm hệ thống thần kinh trung ương bao gồm não, tủy sống võng mạc [76] Một số tác giả cho rằng, trình xâm nhập NNV vào vật chủ xảy liên kết vi rút với axit sialic bề mặt tế bào vật chủ [100] Gần đây, có phát khác cho thấy tham gia protein sốc nhiệt (Hsc70) trình xâm nhập vi rút với tế bào vật chủ, đóng vai trò thụ thể đồng thụ thể để phản ứng với vỏ vi rút đóng vai trị giai đoạn đầu q trình lây nhiễm [52, 137] Một giả thuyết khác vi rút xâm nhập trực tiếp vào tế bào thần kinh thông qua vận chuyển trục đến thân não qua dây thần kinh sọ [82] Mặc dù vi rút có tính hướng thần kinh, phát thấy chúng mô khác, bao gồm: gan, thận, đường tiêu hóa, tim, lách, ruột trước ruột sau, dịch sinh dục, vây mang cách sử dụng phương pháp lai chỗ/hóa mơ miễn dịch kỹ thuật sinh học phân tử [124] Phương pháp kiểm soát bệnh hoại tử thần kinh cá mú thường loại trừ có mặt vi rút trại sản xuất giống khu vực nuôi cách khử trùng nước đồng thời loại trừ vi rút cá bố mẹ trại giống vùng nuôi Một hóa chất ức chế vi rút dùng nhiều iodphors có hiệu nồng độ thấp từ 25-100 ppm [75] Các nghiên cứu thực nghiệm Betanodavirus (vi rút nhóm SJNNV) bị bất hoạt với hóa chất nhóm hypochlorite (natri hypochlorite, canxi hypochlorite, benzalkonium chloride) nồng độ 50 mg/L 10 phút 200C; nồng độ etanol 60%; pH 12 10 phút 200C; đun nóng 600C 30 phút Liều tia cực tím hiệu để vơ hiệu hóa BFNNV nghiên cứu thực nghiệm 1,0 x 105 µWsec/cm2 cường độ tia cực tím 440 µW/cm2; liều tia cực tím 1,5–2,5 x 105 µWsec/cm2 vơ hiệu hóa SJNNV; ozone nồng độ 0,1 µg/mL vơ hiệu hóa vi rút (SJNNV) sau 2,5 phút [23] 17 Theo Munday, 2002, nước vào bể ương nên xử lý với ozone không tái sử dụng, nhiên, điều kiện khơng cho phép nên tái sử dụng tối đa 1/2 lượng nước bể Nhiều tác giả khuyến cáo nên xử lý nước với tia cực tím trước đưa vào bể nuôi [154] Cá bố mẹ sàng lọc để kiểm tra diện vi rút cách sử dụng kháng thể đặc hiệu RT-PCR [39, 226] Ngoài ra, tác giả khuyến cáo trứng cá nên rửa nước biển với ozon hàm lượng 0,2 µg/mL cá măng sọc, µg/mL cá chim, ngâm trứng cá măng sọc với PVP iodine 50 µg/mL 10 phút để hạn chế lây nhiễm vi rút [23] Phương pháp kiểm sốt khác ni tách ấu trùng cá măng sọc giống với nguồn nước diệt khuẩn tia cực tím 1,0 x 105 µW/s.cm2 ozon 0,1 µg/mL từ đến phút xử lý dụng cụ với chlorine nồng độ 50 µg/mL 10 phút Việc thực chế độ vệ sinh nghiêm ngặt trại giống không tái sử dụng nước, dùng hóa chất sát trùng nước biển khử trùng bể suốt chu kỳ ấp nở trứng đem lại thành công trang trại sản xuất giống cá chẽm 1.4 Một số hiểu biết hệ miễn dịch cá xương vắc-xin phòng bệnh cho cá 1.4.1 Đáp ứng miễn dịch cá xương Đặc điểm hệ miễn dịch cá xương Hệ thống miễn dịch cá xương gồm miễn dịch không đặc hiệu miễn dịch đặc hiệu, hai hệ thống hoạt động để kích hoạt q trình phịng vệ loại bỏ kháng ngun [190] Hệ thống miễn dịch khơng đặc hiệu (hay cịn gọi miễn dịch tự nhiên, miễn dịch bẩm sinh) khả thể chống lại tác nhân gây bệnh phản ứng khơng đặc hiệu, mang tính bẩm sinh, di truyền cá thể 18 lồi Đây tuyến phịng thủ bảo vệ thể lúc phản ứng miễn dịch đặc hiệu chưa đáp ứng kịp trước xâm nhập tác nhân gây bệnh Các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu bao gồm hàng rào vật lý, hệ thống bổ thể, enzym, interleukin, interferon tế bào bảo vệ, chẳng hạn bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào tế bào tiêu diệt tự nhiên [142] Hệ thống miễn dịch đặc hiệu (hay gọi miễn dịch mắc phải, miễn dịch thích nghi) đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tạo sau thể tiếp xúc với kháng nguyên Kháng nguyên tiếp xúc với thể cách ngẫu nhiên môi trường chủ động cách tiêm vắc-xin phòng bệnh Ở cá, tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch đặc hiệu bao gồm: tế bào lympho T, tế bào lympho B [35, 65, 94] Cá xương thiếu tủy xương hạch bạch huyết, đó, hoạt động phịng vệ cá phải dựa vào quan bạch huyết, bao gồm tuyến thượng thận, tuyến ức, lách mô lympho liên kết với niêm mạc để bảo vệ chống lại vi rút, ký sinh trùng, vi khuẩn gây bệnh nấm [125, 202] Các quan tế bào có thẩm quyền miễn dịch cá nghiên cứu số loài cá da trơn, cá chép, cá hồi vân, cá tráp biển cá giị, theo đó, hình thành quan lympho phụ thuộc vào tuổi cá, theo thứ tự định, cá hồi cá chép, hình thành quan lympho diễn theo thứ tự sau: tuyến ức, thận lách [120, 202], cá tráp cá giò, thận quan lympho hình thành, tiếp đến lách cuối tuyến ức [120] Cá xương có hai quan lympho bao gồm tuyến ức tuyến thượng thận chịu trách nhiệm sản xuất biệt hố tế bào miễn dịch, bên cạnh đó, thận, gan trung tâm đại thực bào đóng vai trò quan trọng việc bảo vệ cá xương chống lại tác nhân gây bệnh [202] 19 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả đáp ứng miễn dịch cá Hệ thống miễn dịch phản ứng miễn dịch cá bị ảnh hưởng nhiều yếu tố như: tuổi cá, giới tính, yếu tố di truyền, chất lượng nước, nhiệt độ yếu tố stress khác [195] Tuổi giới tính cá yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến hệ miễn dịch phản ứng miễn dịch cá [232], hoạt động miễn dịch cá tăng dần theo độ tuổi khác cá đực cá Nồng độ immunoglobulin huyết tăng lên theo tuổi cá, số loài, cá tuyết, gia tăng tiếp diễn suốt đời, loài khác, hàm lượng kháng thể đạt tối đa cá thành thục sinh dục [121, 141, 159] Sự tương tác hệ thống miễn dịch hệ thống nội tiết cá liên quan chủ yếu đến hóc mơn Hóc mơn sinh dục cá đực cá testosterone estradiol-17β, chứng minh ảnh hưởng trực tiếp đến thơng số miễn dịch q trình trưởng thành [53, 146], báo cáo Hou cộng sự, 1994 cho thấy, suy giảm nồng độ IgM huyết tương quan sát thấy cá hồi vân sau sử dụng hóc mơn sinh dục [96], cá vằn, cá tráp hóc mơn sinh dục cá đực cá có tác động khác không ức chế hoạt động thực bào bổ thể nồng độ IgM [54] Kháng thể đặc hiệu cá truyền từ cá mẹ sang cá con, giúp bảo vệ ấu trùng thời gian sau nở [85, 153] Báo cáo Breuil cộng cá hồi Đại Tây Dương, cá chim (Pleuronectes platessa), cá vược (Dicentrarchus labrax) cá rô phi (Oreochromis mossambicus) chứng minh khả truyền IgM từ mẹ sang cá [39], cá tuyết (Melanogrammus aeglefinus) khơng nhận thấy có di truyền IgM từ mẹ sang cá [191] Ở cá tráp biển, khả bảo vệ thụ động chống lại bệnh cụ thể phát thấy cá sau nhận kháng thể từ 20 cá bố mẹ tiêm phòng bệnh [86], trường hợp khác cá hồi Đại Tây Dương khơng có bảo vệ [129] Mặc dù hàm lượng kháng thể mà cá nhận từ cá mẹ không cao tồn thời gian ngắn thể vai trò bảo vệ cá chống lại tác nhân lây truyền theo chiều dọc [202] Ở cá, thay đổi mơi trường có ảnh hưởng đáng kể đến hệ thống miễn dịch [87] Điều chứng minh PérezCasanova nghiên cứu phản ứng miễn dịch cá tuyết nuôi nhiệt độ từ 100C đến 190C, thông số miễn dịch biểu β2-microglobulin, MHC I hàm lượng IgM đạt mức cao 160C, biểu cytokine IL-1β đạt tối đa 190C [173] Nhiệt độ nhân tố ngoại cảnh tác động đến đáp ứng miễn dịch cá [72] Miễn dịch không đặc hiệu hoạt động mạnh nhiệt độ thấp thơng số miễn dịch đặc hiệu có xu hướng bị triệt tiêu nhiệt độ thấp [33], vậy, nhiệt độ phù hợp để sử dụng vắc-xin lồi cá khác [174] Với cá hồi Đại Tây Dương, nhiệt độ phù hợp để tạo kháng thể sau tiêm vắc-xin từ - tuần nhiệt độ 10-120C; cá chẽm, kháng thể tạo sau tuần tiêm chủng nuôi nhiệt độ 220C Các nghiên cứu khác chứng minh nhiệt độ thấp ngăn chặn hoạt động tế bào T làm chậm phản ứng hình thành kháng thể [92] Yếu tố stress gây ức chế phản ứng đáp ứng miễn dịch giảm khả kháng bệnh Nhiều thí nghiệm tiến hành loài cá khác để xem xét tác động stress hệ thống miễn dịch Trong thí nghiệm này, hóc mơn gây căng thẳng cortisol adrenaline protein liên quan đến stress khác protein sốc nhiệt nồng độ đường máu theo dõi, thông số miễn dịch không đặc hiệu miễn dịch đặc hiệu tác động lên khả kháng bệnh [77, 83] Phân tích thơng 21 số miễn dịch yếu tố stress nghiên cứu protein thực [125] Kết tương tác chặt chẽ yếu tố thần kinh với hệ thống miễn dịch cá điều hòa tương tác cytokine neuropeptide [84, 226] 1.4.2 Tổng quan vắc-xin thủy sản Vắc-xin xem biện pháp hiệu để phịng kiểm sốt bệnh vi rút, vi khuẩn gây [139] Vắc-xin thủy sản bắt đầu nghiên cứu từ năm 1940, báo cáo việc sử dụng vắc-xin cá vắc-xin chết phòng vi khuẩn gây bệnh Aeromonas salmonicida Duff báo cáo vào năm 1942 [64] Kể từ năm 1980 có tiến đáng kể việc phát triển vắc-xin thủy sản Theo thống kê chưa đầy đủ, tính đến năm 2020, 140 loại vắc-xin thủy sản phê duyệt toàn giới [103], bao gồm vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin tái tổ hợp, vắcxin axit nucleic vắc-xin sống giảm độc lực Trong đó, 26 loại vắc-xin cá cấp phép sử dụng cho nhiều loại cá bán thị trường toàn cầu như: vắc-xin ADN cấp phép Canada; vắc-xin bất hoạt Na Uy, Chile, Ireland, Phần Lan, Canada, Cộng hòa Séc, Singapore, Châu Âu, Nhật Bản, Úc, Việt Nam, Vương quốc Anh, Đài Loan, Tây Ban Nha, Indonesia, Brazil; vắc-xin tiểu đơn vị Canada, Hoa Kỳ, Chile, Bỉ Na Uy; vắc xin nhược độc Israel Hoa Kỳ [139] Việc tiêm phòng bệnh thường sử dụng số loài cá quan trọng mặt kinh tế cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi vân, cá rô phi sông Nile, cá cam Nhật Bản cá tra [13, 24] Mặc dù vậy, số loại vắc-xin thương mại khơng phải lúc có tác dụng hiệu phòng bệnh bệnh thủy sản tiếp tục diễn biến nghiêm trọng [71, 143] Trong năm gần đây, nghiên cứu hệ thống biểu kháng nguyên hiểu biết hệ thống miễn dịch cá giúp cho vắc-xin thủy sản phát triển nhanh chóng, góp phần vào phát triển bền vững ngành ni trồng thủy sản tồn cầu [109] 22 1.4.2.1 Vắc-xin phân loại vắc-xin cho cá Vắc-xin chế phẩm sinh học kích thích hệ thống miễn dịch dịch thể và/hoặc miễn dịch qua trung gian tế bào để tạo phản ứng miễn dịch giúp thể chống lại kháng nguyên cụ thể [16] Vắc-xin nuôi trồng thủy sản xem biện pháp phòng ngừa hiệu nhiều bệnh gần trở nên phổ biến Theo tác nhân gây bệnh, vắc-xin thủy sản phân loại thành vắc-xin vi khuẩn, vắc-xin vi rút vắc-xin ký sinh trùng Chúng phân loại theo thành phần bao gồm vắc-xin đơn giá, vắc-xin đa giá vắc-xin hỗn hợp, phân loại theo chất chẳng hạn vắc-xin sống giảm độc lực, vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tiểu đơn vị, vắc-xin axit nucleic vắc-xin tái tổ hợp [57] Cần lưu ý loại vắc-xin có ưu điểm nhược điểm, loại vắc-xin khác cần phát triển sử dụng cho tác nhân gây bệnh động vật khác Phần lớn vắc-xin cấp phép sử dụng nuôi trồng thủy sản sản xuất phương pháp nguyên tắc tương tự vắc-xin Jenner Pasteur phát triển từ nhiều kỷ trước [209] Vắc-xin sống giảm độc lực điều chế từ nhiều loại vi rút vi khuẩn làm giảm độc lực độc lực thấp loài cá mục tiêu Tác nhân gây bệnh bị giảm độc lực cách sử dụng q trình vật lý hóa học, cấy truyền nhiều đời q trình ni cấy tế bào điều kiện bất lợi, kỹ thuật di truyền [60] Hiện này, vắc-xin thủy sản sống giảm độc lực sử dụng phổ biến nuôi cá, chẳng hạn vắc-xin phòng bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết vi rút (VHSV) chế tạo từ chủng nhược độc F25 [61], vắc-xin phòng bệnh hoại tử thận lách truyền nhiễm (ISKNV), vắc-xin Furunculosis giảm độc lực, vắc-xin vi rút hoại tử quan tạo máu giảm độc lực (IHNV) [18, 115, 189, 218, 233] 23 Trong năm gần đây, có tiến quan trọng việc nghiên cứu vắc-xin sống giảm độc lực cho thủy sản Liu cộng sự, 2019 tạo chủng Streptococcus lactis TFJ0901 giảm độc lực (ký hiệu FJ-ery) từ chủng tự nhiên Streptococcus lactis cách sử dụng kháng sinh erythromycin, kết nghiên cứu cho thấy TFJ-ery chủng nhược độc có tiềm để sản xuất vắc-xin phịng bệnh hiệu cho cá rơ phi khỏi nhiễm trùng Streptococcus lactis [134] Một loại vắc-xin sống giảm độc lực khác tạo Liu cộng sự, 2018 để bảo vệ chống lại bệnh Vibrio spp cá hổ (Takifugu rubripes) cho thấy rằng, vắc-xin khơng có tác động tiêu cực đến phát triển cá hổ, đồng thời, đáp ứng miễn dịch bảo vệ hiệu cho cá sau tiêm vắc-xin [133] Zhang cộng sự, 2020 phát triển loại vắc-xin sống giảm độc lực hiệu chống lại Streptococcus lactis, vắc-xin có khả tạo miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào cá rô phi, làm tăng đáng kể mức độ bảo hộ cá [235] Cũng báo cáo tác giả cho thấy, vắc-xin sống giảm độc lực có chủng kháng nguyên Aeromonas hydrophila TH0426 kích thích tăng cường hoạt động enzyme huyết chất nhầy da chạch làm tăng biểu gen liên quan đến miễn dịch, bao gồm IL1β, TNF-α, IL-10 pIgR [235] Zhou cộng sự, (2020) phát triển loại vắc-xin sống giảm độc lực chống nhiễm trùng Vibrio alginolyticus làm tăng biểu IgM, IL-1β, IL-6 TNF-α tạo phản ứng miễn dịch bảo vệ cá ngựa vằn [240] Vắc-xin sống có ưu điểm sinh đáp ứng miễn dịch mạnh, thời gian dài, nhiên nhược điểm vắc-xin khả tái độc chủng kháng nguyên [132] Trong nuôi trồng thủy sản, vắc-xin sống có tiềm lớn sử dụng qua đường uống ngâm [14, 119, 135, 140] Vắc-xin chết (bất hoạt): vắc-xin sử dụng phương pháp vật lý 24 hóa học để làm bất hoạt vi sinh vật gây bệnh có độc lực cao, giữ tính sinh miễn dịch tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ cho động vật thủy sản sau tiêm phòng Các phương pháp khử hoạt tính vật lý bao gồm ánh sáng tia cực tím [237], gia nhiệt nhiệt độ cao [15, 98], siêu âm [128] tia γ [36] Bất hoạt hóa học q trình làm cho vi khuẩn vi rút gây bệnh không hoạt động cách phá hủy axit nucleic protein chúng hóa chất Bất hoạt vật lý phức tạp tốn kém, hạn chế khơng ổn định, ngược lại, bất hoạt hóa học đơn giản chi phí thấp, đáng tin cậy phương pháp bất hoạt sử dụng phổ biến [102, 236] Vắc-xin bất hoạt thường an toàn, giá thành rẻ nhiên, phản ứng miễn dịch thời gian miễn dịch hạn chế [152, 176] Vắc-xin bất hoạt thường bị hạn chế khả sinh miễn dịch đặc hiệu bị ảnh hưởng trình bất hoạt làm tính tồn vẹn kháng ngun [187] Vắc-xin vi rút hoại tử thần kinh bất hoạt hóa chất binary ethylenimine mmol/l khơng thúc đẩy đáng kể biểu gen chức miễn dịch cá mú, mà cịn kích thích tạo miễn dịch dịch thể miễn dịch tế bào [112] Vắc-xin tiểu đơn vị điều chế cách đưa gen mã hóa kháng nguyên mầm bệnh vào vec tơ biểu Shin, 2013 thực cho cá tráp ăn mơ lúa biến đổi gen có chứa gen mã hoá protein vỏ Iridovirus, kết làm tăng đáng kể khả kháng bệnh cá [196] VLPs vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh cá tuyết Đại Tây Dương biểu thuốc (Nicotiana benthamiana) có hiệu việc bảo vệ cá vược khỏi công vi rút [145] Protein tái tổ hợp GroEL IglC trùng dưa (Francisella directionalis) giúp tăng cường phản ứng miễn dịch cá rô phi sông Nile cải thiện khả miễn dịch cá [194] Ưu điểm vắc-xin tiểu đơn vị sử dụng thành phần kháng ngun để tiêm phịng khơng có nguy gây bệnh cho vật chủ Điều đáng 25 lo ngại vắc-xin tiểu đơn vị thường chứa kháng nguyên nhất, dẫn đến khả kích thích phản ứng miễn dịch chúng yếu so với vắc-xin bất hoạt vắc-xin sống giảm độc lực, vậy, vắc-xin cần phải tiêm nhiều lần bổ sung chất bổ trợ để cải thiện hiệu tiêm chủng [19, 123, 126, 140, 149] Vắc-xin axit nucleic bao gồm vắc-xin ADN ARN Vắc-xin axit nucleic thường hiệu việc ngăn ngừa nhiễm vi rút, chẳng hạn vi rút gây bệnh cho cá (rhabdovirus) chúng sử dụng chế tế bào mà vi rút sử dụng chúng xâm nhập vào tế bào chủ [59, 95] Huo cộng sự, 2020 phát triển plasmid tái tổ hợp pcORF25 pcCCL35.2 để chế tạo vắc-xin chống lại CyHV-2, kết thu pcORF25/pcCCL35.2 làm tăng hiệu biểu gen miễn dịch quan trọng IL-1, IL-2, IFN-γ2 viperin, đồng thời ức chế đáng kể chép CyHV-2 đầu mô thận lách [96] So với vắc-xin thông thường, vắc-xin axit nucleic ổn định hơn, an tồn khơng bị trở lại tính độc Tuy nhiên, vắc-xin axit nucleic chưa nghiên cứu đầy đủ xác định liệu gen vật chủ có tích hợp với ADN ngoại sinh để phá vỡ cân di truyền nội môi vật chủ hay không Hơn nữa, vắc-xin axit nucleic có tác dụng phụ tiềm ẩn, bao gồm khả dung nạp miễn dịch sinh vật kháng nguyên biểu hiện, tích hợp nhiễm sắc thể viêm nhiễm chỗ tiêm [59] 1.4.2.2 Phương pháp sử dụng vắc-xin cho cá Trong nuôi trồng thủy sản, ba phương pháp sử dụng vắc-xin thường sử dụng bao gồm: vắc-xin dùng đường tiêm, vắc-xin dùng đường ngâm vắc-xin dùng đường ăn [217] Vắc-xin đường tiêm: Kháng nguyên đưa trực tiếp vào cá phương pháp tiêm phúc mạc tiêm bắp [174] Với phương 26 pháp này, thời gian bảo vệ kéo dài so với phương pháp ngâm [223] Tiêm phúc mạc cách tạo miễn dịch hiệu cho cá, vậy, hầu hết loại vắc-xin gần chủ yếu cung cấp qua đường Vắc-xin dùng đường tiêm cần vắc-xin đặc biệt thích hợp vắc-xin bất hoạt, vắc-xin tiểu đơn vị vắc-xin axit nucleic Nhược điểm vắc-xin đường tiêm gây stress cho cá, tạo vết thương chỗ tiêm gây bệnh nhiễm trùng thứ cấp Hơn nữa, cá có khối lượng 5g, phương pháp khơng thực tế [223] Hạn chế vắc-xin tiêm sử dụng nhiều lần q trình ni cá [61] Vắc-xin dùng đường ngâm thực hai phương pháp nhúng tắm Ở cá giai đoạn cá bột, cá hương cá giống có khối lượng từ 0,5 đến 5g, vắc-xin đường ngâm sử dụng rộng rãi đặc biệt khuyến khích hiệu quả, nhanh chóng, thuận tiện, stress kinh tế Đối với phương pháp nhúng, cá thường nhúng dung dịch vắc-xin có nồng độ cao, thời gian 30 giây, phương pháp tắm, cá phơi nhiễm thời gian dài hơn, thường từ đến vài giờ, với nồng độ vắc-xin thấp [148] Vắc-xin sử dụng phương pháp nhúng ưa thích số lượng lớn cá gây miễn dịch nhanh chóng [125] Nhược điểm việc sử dụng vắc-xin phương pháp ngâm thời gian miễn dịch ngắn hơn, hàm lượng kháng thể tạo thành khơng đủ bảo hộ cho số lồi cá [148] Vắc-xin cho ăn sử dụng cách kết hợp với thức ăn cách tạo lớp áo thức ăn [66, 186] Để ngăn chặn việc rửa trôi kháng nguyên khỏi viên thức ăn, vắc-xin phải phủ lên thức ăn với chất kết dính (dầu) Plant cộng sự, 2011 cho trộn kháng nguyên vào thức ăn cho cá mang lại số lợi ích chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản, an toàn tất giai đoạn tuổi cá giảm stress cá [174] Vắc-xin đường ăn khuyến cáo sử dụng biện pháp tăng khả 27 bảo vệ chống lại số bệnh mãn tính lưu hành [161] 1.4.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vắc-xin phịng bệnh hoại tử thần kinh cho cá 1.4.3.1 Tình hình nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá giới Betanodavirus nguyên nhân gây bệnh hoại tử thần kinh nhiều loài cá biển, gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi cá biển Nhiều nghiên cứu cấp độ khác thực để phát triển vắc-xin phòng bệnh [29, 52, 62, 95] Nghiên cứu Tanaka cộng sự, 2001 sử dụng protein tái tổ hợp vi rút hoại tử thần kinh (được biểu E coli) với liều tiêm 60µg vào cá mú bảy dải (E septemphasciatus) nồng độ kháng thể máu cá tăng lên Kết tương tự đạt tiêm lặp lại liều cá mú chuột (Cromileptes altivelis), liều chứa 70 µg hỗn hợp protein tái tổ hợp vỏ vi rút hoại tử thần kinh, lần cách 10 ngày [204] Ở cá mú nghệ (E lanceolatus), sau gây miễn dịch với hạt giả vi rút VLPs (virus like particles) GNNV liều, liều 100 µg cho thấy tuần đạt hiệu giá kháng thể cao, tỷ lệ sống cá đạt từ 29% đến 38% [136] Các nghiên cứu Pakingking cộng sự, 2009 báo cáo tiềm phòng bệnh vắc-xin sử dụng chủng vi rút thuộc nhóm RGNNV gây bất hoạt formalin cá vược châu Á, theo đó, vắc-xin tạo kháng thể trung hịa cá vược từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 116, mức kháng thể cao ghi nhận ngày thứ 60 sau tiêm chủng [170] Một nghiên cứu tương tự thực cách sử dụng chủng vi rút thuộc nhóm RGNNV Philippine bất hoạt formalin để tạo phản ứng miễn dịch mạnh chống bệnh hoại tử thần kinh cá mú hoa nâu (E fuscoguttatus), hiệu giá kháng thể trung hòa ngày thứ 15 ngày 190 1:800 1:400 hiệu giá cao ghi nhận ngày thứ 60 sau tiêm chủng (1:5120) [170] Cá tiêm chủng cho thấy tỷ lệ tử vong thấp 28 đáng kể so với nhóm khơng tiêm chủng, tỉ lệ sống cá tiêm vắcxin đạt từ 86 đến 100% Nishizawa cộng sự, 2012 chứng minh tiềm vắc-xin sống giảm độc lực nhiệt độ nuôi thấp (170C) cá mú bảy sắc, theo đó, tỷ lệ bảo hộ cá thử thách công cường độc đạt 93,3% [165] Vắc-xin ADN mã hóa protein vỏ vi rút hoại tử thần kinh nghiên cứu để phòng bệnh hoại tử thần kinh cá bơn, cá vược Đại Tây Dương [207] Tuy nhiên, kết thu cho thấy, plasmid mang gen mã hoá protein vỏ vi rút hoại tử thần kinh không tạo miễn dịch bảo hộ chống lại bệnh hoại tử thần kinh Trong nghiên cứu Kim cộng sự, 2015, protein vỏ tái tổ hợp vi rút hoại tử thần kinh biểu cách sử dụng hệ thống tổng hợp protein không tế bào (CFPS) Protein vỏ vi rút hoại tử thần kinh tái tổ hợp sử dụng để gây miễn dịch cho cá mú bảy dải với liều lượng khác Kết cho thấy cá bảo vệ với tỷ lệ chết tích lũy thấp 10% so với nhóm khơng gây miễn dịch sau ngày thứ thử thách cường độc Mặc dù hiệu phương pháp phụ thuộc vào liều lượng sử dụng, nghiên cứu mở cách tiếp cận để phát triển loại vắcxin tái tổ hợp chống lại lây nhiễm Betanodavirus cho cá mú bảy dải [118] Gần đây, nghiên cứu Huang cộng sự, 2017 thực để đánh giá hiệu vắc-xin bất hoạt nhị giá để phòng bệnh VNN Iridovirus cá mú Cá mú đốm cam thí nghiệm tiêm vắc-xin qua màng bụng, đối chứng tiêm giả dược dung dịch đệm phosphate (phosphate buffered saline-PBS), lô cá sử dụng vắc-xin hiệu giá kháng thể chống lại bệnh hoại tử thần kinh đạt 1:1810 đến 1:5120, hiệu giá kháng thể chống lại Iridovirus đạt 1:57 đến 1:320 [97] Hiện nay, hai loại vắc-xin bất hoạt formalin phòng bệnh hoại tử thần kinh chủng mang kiểu gen RGNNV Alpha ject micro® 1Noda 29 (Pharmaq) Icthiovac® VNN (Hipra) thương mại để tiêm phòng cá vược thị trường Địa Trung Hải Một nghiên cứu khác gần vắc-xin tái tổ hợp sử dụng đoạn ADN protein vỏ vi rút biểu dạng protein 6-histidine E coli BL21 Cá vược châu Á chủng ngừa kháng nguyên tinh khiết r-FNCP42 sau thử thách cường độc với Betanodavirus cách tiêm, kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sống đạt 76% [221] Trên giới sử dụng số loại vắc-xin phòng bệnh cho cá mú thống kê Bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Liều dùng Thời gian bảo hộ Nguồn tham khảo In vitro 0,1 mL tuần [130] TTT Tiêm TCID50 = 10-7 ngày [136] E lanceolatus TTT Tiêm TCID50 = 10-7 ngày [136] Hạt giả vi rút E lanceolatus Cá giống Tiêm 10-100 µg tuần [136] Tái tổ hợp E coioides ấu trùng Cho ăn TCID50 = 10-7 35 ngày [136] E coioides ấu trùng Tắm TCID50 = 10-7 30 ngày [111] E fuscogutatus TTT Tiêm 0,1 mL 75 ngày [170] E septemfasciatus TTT Ngâm TCID50 = 10-7 Giai đoạn Cách dùng E akaara TTT E lanceolatus Vắc-xin ADN Loại vắc-xin Protein vỏ GNNV Bất hoạt formaldehyde Bất hoạt formaldehyde Bất hoạt formaldehyde Sống Ký chủ [165] (TTT: Tiền trưởng thành) 1.4.3.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá Việt Nam Kim ngạch xuất thủy sản Việt Nam tăng trưởng cao năm gần Nghề nuôi trồng thủy sản quan tâm, đầu tư lớn Tuy nhiên, dịch bệnh ngày gia tăng nghề ni cá gặp nhiều khó khăn dịch bệnh gây Để kiểm soát dịch bệnh cá nhiều biện pháp áp dụng như: cải tạo ao đầm, kiểm soát chất lượng 30 nước nuôi, chọn lọc cá bố mẹ cá giống bệnh, áp dụng tiến khoa học… hiệu nuôi cá chưa cao dịch bệnh thường xảy Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin để phịng dịch bệnh cho cá có ý nghĩa lớn Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu sử dụng vắc-xin nuôi trồng thủy sản Vũ Dũng Tiến cộng sự, 2003 chế tạo vắc-xin kết hợp kháng nguyên ngoại bào nội bào vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có hiệu bảo hộ đạt 100% [8] Bùi Quang Tề công sự, 2006 chế tạo thành công vắc-xin từ vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ từ 90 đến 100% [7] Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II triển khai đề tài nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh đốm trắng gan thận lách cá (bệnh gan thận mủ) vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra (Pangasianodon hypothalmus) nuôi công nghiệp đồng Sông Cửu Long Kết bước đầu cho thấy vắc-xin có hiệu tốt, với liều kháng nguyên 3x109 CFU/cá, phương pháp tiêm vắc-xin lần cách 14 ngày, thời gian phịng bệnh cho đàn cá kéo dài đến tháng [2] Tiếp nối kết từ nghiên cứu Viện Nghiên cứu nuôi trông Thủy sản II Công ty Pharmaq Việt Nam sản xuất đăng ký lưu hành thành công vắc-xin ALPHA JECT Panga 1, vắc-xin thương mại cho cá tra Việt Nam châu Á Tỷ lệ chết bệnh gan thận mủ vi khuẩn Edwardsilla iculuri ao sử dụng vắc-xin - 4,7% ao không tiêm vắc-xin tỷ lệ cá chết bệnh lên tới 3,8 - 23% [246] Nguyễn Thị Thanh Thùy cộng sự, 2012 thực nghiên cứu chế tạo vắc-xin bất hoạt phòng chống bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây cá mú chấm cam (E coioides) Vắc-xin tạo từ chủng vi khuẩn 31 V parahaemolyticus V3 (phân lập từ thận cá mú bị bệnh) bất hoạt formalin 0,5%, 24 40C Đánh giá khả bảo hộ vắcxin bất hoạt cá mú chấm cam cho thấy, sau 30 ngày sử dụng vắc-xin bất hoạt có kết hợp với chất bổ trợ (FIA với tỷ lệ 1:1) chất bổ trợ, tỷ lệ bảo hộ (RPS) tương ứng đạt 87,5% 50%; sau 60 ngày tiêm chủng, tỷ lệ bảo hộ đạt tương ứng 41,1% 10,9% Kết nghiên cứu rằng, vắc-xin bất hoạt tạo hiệu bảo hộ, nhiên thời gian bảo hộ chưa dài [9] Phan Thị Vân cộng sự, 2013 phát triển thành công vắc-xin bất hoạt phịng bệnh Vibriosis cho cá giị ni Vắc-xin (AquaVib) tạo từ chủng vi khuẩn V alginolyticus, V parahaemolyticus V harveyi bất hoạt formalin kết hợp với nhũ dầu Montanide TMISA 760 (Seppic) Ở quy mơ phịng thí nghiệm, vắc-xin có độ an tồn 100%, tỷ lệ bảo hộ 70 - 100% sau đến 30 ngày tiêm vắc-xin Trong mơ hình thực nghiệm, vắc-xin có độ dài miễn dịch từ đến 12 tháng, tỷ lệ bảo hộ 70% Vắc-xin có thời gian bảo quản nhiệt độ 40C tháng [12] Phạm Thị Tâm cộng sự, 2015 tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phương pháp phát vi rút gây bệnh sản xuất vắc-xin phịng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú ni công nghiệp” Kết đề tài chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn có hiệu lực bảo vệ 83% cá giống, an tồn 100%, có độ vơ trùng tuyệt đối [6] Nguyễn Hữu Vũ cộng sự, 2019 tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu phương pháp chẩn đốn chế tạo vắc xin phịng bệnh Streptococcosis cá rô phi Việt Nam” Kết sản xuất vắc xin phòng Streptococcosis cá rô phi đường ăn đường tiêm quy mô công nghiệp, vắc-xin đạt tiêu chuẩn vô trùng 100%, an toàn 100% tỉ lệ bảo hộ đạt 70% 32 Trần Vĩ Hích cộng sự, 2020 đánh giá hiệu bảo vệ cá bớp khỏi bệnh mù mắt vi khuẩn Streptococcus iniae gây cá bớp vắc-xin bất hoạt Kết thí nghiệm cho thấy vắc-xin hoàn toàn an toàn với cá bớp (khơng có khác biệt chiều dài khối lượng cá thí nghiệm cá đối chứng, khơng có dấu hiệu bất thường quan sát xoang bụng cá tiêm vắc-xin) Trong thí nghiệm công cường độc, vắc-xin bảo vệ cho cá khỏi bệnh S iniae gây với tỉ lệ bảo hộ (RPS) 85,19% tương ứng với liều tiêm 104 CFU/cá Hiệu giá kháng thể trung bình huyết cá tiêm vắc-xin 19,7 cá đối chứng [249] Trần Vĩ Hích cộng sự, 2021 đánh giá hiệu bảo vệ cá mú lai khỏi bệnh cá mú ngủ iridovirus gây vắc-xin Piscivac Irido Si (chứa chủng iridovirus bất hoạt ≥ 106,6 TCID50/mL) Kết thí nghiệm cho thấy vắc-xin hoàn toàn an toàn với cá mú (khơng có khác biệt chiều dài khối lượng cá thí nghiệm cá đối chứng, khơng có dấu hiệu bất thường quan sát xoang bụng cá tiêm vắc-xin) Trong thí nghiệm công cường độc, vắc-xin Piscivac Irido Si bảo vệ cho cá khỏi bệnh cá mú ngủ iridovirus gây với tỉ lệ bảo hộ (RPS) 72,9% [250] 33 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Cá bệnh Mẫu cá mú thu thập vùng nuôi trồng thủy sản ven biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) Các mẫu cá nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh thu vào tháng 5, 6, năm 2016 lưu giữ dụng cụ vô trùng 8-120C suốt q trình vận chuyển phịng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội để phân lập vi rút Mẫu cá bệnh dùng để phân lập vi rút vòng 24 sau thời điểm thu mẫu 2.1.2 Cá thí nghiệm Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) dài 2-2,5 cm, cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) dài 2-2,5 cm mú chuột (Cromileptes altivelis) dài 5,5-6 cm cung cấp Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phịng Cá kiểm tra khơng nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phản ứng RT-PCR trước thí nghiệm 2.1.3 Tế bào Tế bào GS01 (tế bào lách cá mú) trường Đại học Wageningen, Hà Lan cung cấp 2.1.4 Hóa chất Hóa chất cho ni cấy tế bào Mơi trường Leibovitz´s L-15 medium (Gibco, Mỹ), fetal bovine serum -FBS (Gibco, Mỹ), penicillin-streptomycin (Gibco, Mỹ) Hóa chất dùng nghiên cứu sinh học phân tử Kit RNeasy Qiagen (Qiagen, Mỹ), dH2O, 2xPCR Master mix solution 34 (Qiagen, Mỹ), mồi PCR, 50X TAE Buffer (Thermo Scientific, Mỹ), agarose (Bio Basic, Canada), DNA Ladder 1kb (Invitrogen, Thermo Scientific, Mỹ), ethidium bromide (Thermo Scientific, Mỹ) Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đánh giá độc lực vi rút: dung dịch NaCl 0,9% (Việt Nam); phosphate buffered saline (PBS) pha với thành phần 4,3 mM Na2HPO4.7H2O (Merck, Đức); 1,4 mM KH2PO4 (Merck, Đức); 2,7 mM KCl (Merck, Đức); 137 mM NaCl (Merck, Đức) với pH 7; huyết ngựa, cao nấm men (Himedia, Ấn Độ) Hóa chất cho ELISA: Sữa tách bơ (skim milk), Tween 80 (Merck, Đức), dung dịch H2SO4 (Merck, Đức), dung dịch chất ABTS (Thermo Scientific, Mỹ) Môi trường đánh giá chất lượng vắc-xin: - Môi trường canh thịt: Cao thịt 5g; peptone 10g; NaCl 5g, nước cất 1000mL, pH 6,8-7,0 - Môi trường thạch máu: peptone 5g; cao nấm men 3g; NaCl 5g; agar 15g; máu bò 50 mL; nước cất 1000 mL, pH 7,2-7,4 - Môi trường thạch saboroud: peptone 10g; đường dextrose 40g; agar 15g; nước cất 1000 mL; pH 5,4-5,6 - Môi trường thạch XLD: cao nấm men 3g; L-lysine 5g; xylose 3,75g; lactose 7,5g; sucrose 7,5g; sodium desoxycholate 2,5g; ferric ammonium citrate 0,8g; sodium thiosulfate 6,8g; NaCl 5g; agar 15g; phenol red 0,08g; nước cất 1000 mL, pH 7,2-7,4 2.1.5 Thiết bị Một số thiết bị sử dụng nghiên cứu như: Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật Bản), máy PCR (Eppendorf AG 22331, Đức), nồi hấp vô trùng (Nhật), tủ ấm CO2 nuôi tế bào (Memmert, Đức), tủ lạnh -200C, -800C (Sanyo, Nhật Bản), điện di ngang (Advance Tech, Nhật Bản), máy vortex (IKA, Đức), máy li tâm (Sorvall, Mỹ), máy đơng khơ (Eppendorf, Đức), kính 35 hiển vi soi ngược (Sony, Nhật), chai nuôi cấy T25, T75 (Corning, Mỹ), đĩa ELISA 96 giếng (NUNC, Thermo Scientific, Mỹ), đĩa nuôi cấy 24 giếng, 48 giếng 96 giếng (Corning, Mỹ), màng lọc 0.22 μm (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), máy đông khô (Ependoft, Đức) Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, đầu pipette, ống eppendorf, que cấy, đèn cồn, lamen, lam kính, thùng ni cá, máy sục khí cho bể cá 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh miền Bắc Xác định độc lực chủng vi rút hoại tử thần kinh phân lập; Lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú: xác định chủng đại diện kháng nguyên; đánh giá tính khiết, khả kích thích sinh kháng thể bảo hộ cá mú; xác định hiệu xuất nhân giống tế bào mẫn cảm; đánh giá ổn định khả kích thích sinh kháng thể bảo hộ, ổn định gen mã hoá kháng nguyên 2.2.2 Nghiên cứu sản xuất vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú quy mơ phịng thí nghiệm Xác định liều gây nhiễm thời gian thu hoạch vi rút từ tế bào nuôi cấy; Xác định hoá chất điều kiện gây bất hoạt vi rút; Xác định điều kiện tạo vắc-xin bán thành phẩm: liều kháng nguyên, chất bổ trợ, điều kiện tạo vắc-xin keo phèn; Đánh giá độ dài miễn dịch vắc-xin bán thành phẩm 2.2.3 Xây dựng quy trình kiểm tra tiêu chuẩn chất lượng vắc-xin Đánh giá tiêu chuẩn vật lý vắc-xin Đánh giá tiêu chuẩn vô trùng vắc-xin Đánh giá tiêu chuẩn an toàn vắc-xin 36 Đánh giá độ dài miễn dịch vắc-xin 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Đề tài thực phịng thí nghiệm Vi sinh vật - Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 04/2016 đến tháng 04/2020 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Sơ đồ bước thực Hình 2.1 Sơ đồ bước thực 2.4.2 Phương pháp thu xử lý mẫu Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo OIE (2019) [168] Tổng cộng thu 60 mẫu cá mú gồm loài: 37 - Cá mú chấm cam (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) cá mú chuột (Cromileptes altivelis) có kích cỡ từ đến 12 cm Địa điểm: vùng nuôi cá ven biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định Thái Bình, thời gian tháng 5, 6,8 năm 2016 Mẫu cá bệnh ký hiệu sau: - Mẫu thu thập Quảng Ninh: từ QN01-QN16 - Mẫu thu thập Hải Phòng: từ HP01-HP15 - Mẫu thu thập Nam Định: từ NĐ01-NĐ14 - Mẫu thu thập Thái Bình: từ TB01-TB15 Xử lý mẫu Theo phương pháp Hedge cộng sự,2002, cá nghi mắc bệnh thu não mắt Nghiền mô dung dịch muối cân Hanks (Hank's Balanced Salt Solution - HBSS) với tỷ lệ 1:10 (w/v) Sau đem ly tâm 10.000 vòng/phút 15 phút, 40C Dịch hút lọc qua màng lọc 0,22 µm, dịch bệnh phẩm bảo quản 40C [90] 2.4.3 Kỹ thuật phân lập vi rút tế bào mẫn cảm GS01 Theo phương pháp Qin cộng sự, (2006) [177] Trước sử dụng, tế bào hoạt hóa đĩa ni cấy với mơi trường Leibovitz’s L-15 (L-15) có bổ sung 10% huyết bào thai bê (fetal bovine serum - FBS) nhiệt độ 250C, 5% CO2 tế bào mọc thành lớp đáy đĩa nuôi cấy với độ bao phủ khoảng 90% Loại bỏ môi trường đĩa nuôi cấy rửa lần cách tráng tế bào với L-15 khơng có FBS Bổ sung môi trường Leibovitz’s L-15, ủ từ 1-2 tiếng loại bỏ hồn tồn mơi trường L-15 trước lây nhiễm dịch bệnh phẩm Hút 0,05 mL dịch mẫu bệnh phẩm để láng hết toàn bề mặt tế bào đĩa 24 giếng nuôi, lắc để vi rút tiếp xúc với toàn bề mặt đĩa nhằm trải dịch bệnh phẩm bề mặt tế bào giếng Bổ sung thêm môi trường L-15 chứa 10% FBS 1% penicillin-streptomycin 38 Mẫu đối chứng có tế bào GS01 mơi trường L-15, 10% FBS 1% penicillin-streptomycin Đĩa tế bào gây nhiễm nuôi tủ ấm nhiệt độ 250C, 5% CO2 Hằng ngày dõi xuất hiệu ứng huỷ hoại tế bào (cytopathic effect CPE) kính hiển vi soi ngược Khi CPE đạt khoảng 90-95% thu dịch vi rút, ly tâm dịch 8.000 vòng/phút 15 phút 40C thu dịch Dịch vi rút bảo quản -800C 2.4.4 Kỹ thuật tách chiết ARN tổng số Tách chiết ARN tổng số từ mẫu tế bào nhiễm VNN Kit RNeasy Qiagen hãng Qiagen, Mỹ Cho 250 µL dịch tế bào + 100 µL ARNse-free water + 350 µL RLT buffer (chứa guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5 mL, vortex phút Bổ sung 250 µL ethanol (96-100%), đảo trộn nhẹ pipet Hút 700 µL sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phút 15 giây 40C, thu cột Bổ sung 500 µL dung dịch RPE pha loãng với ethanol (tỷ lệ 1:4) vào cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút 15 giây 40C (rửa cột để loại bỏ tạp chất), thu cột Bổ sung 500 µL RPE buffer pha loãng với ethanol (tỷ lệ 1:4) vào cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút phút 40C, thu cột Chuyển cột sang tube mới, ly tâm 12.000 vòng/phút phút, thu cột Chuyển cột sang eppendorf 1,5mL có nắp Bổ sung 30µL ARNase-free water, đóng nắp ly tâm 10.000 vịng/phút phút, thu dịch lọc có chứa ARN tổng số 39 2.4.5 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) (Thực theo hướng dẫn kit RT-PCR one step hãng Qiagen, Mỹ) Cặp mồi để khuếch đại đoạn gen T4 NNV có kích thước 420 bp có trình tự sau: F2 (5’- CGTGTCAGTCATGTGTCGCT -3’) R3 (3’- CGAGTCAACACGGGTGAAGA -5’) [163] Thành phần phản ứng RT-PCR: Thành phần Thể tích (µL) RT-PCR buffer Q- solution dNTP Enzyme ADN-polymerase Mồi: F2-R3 0,2 ARN temperlate ARNse- free water 7,6 Tổng 25 Chu trình nhiệt RT: 500C / 30 phút PCR: biến tính 950C / phút 940C / 30 giây 600C / 30 giây 30 chu kỳ 720C / phút 720C / phút 2.4.6 Phương pháp tinh sản phẩm PCR Sản phẩm PCR tinh sử dụng sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (ThermoScientific) Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 40 2.4.7 Phương pháp điện di gel agarose Theo phương pháp Sambrook Russel, 2001 [185] Cân 0,2 gam agarose cho vào 20mL dung dịch đệm TAE 1X, đun sơi dung dịch lị vi sóng agarose tan hết (từ 1-2 phút) Để nguội gel đến khoảng 500C bổ sung Ethidium bromide (EtBr) đổ vào khuôn gel gắn lược, khoảng 20-30 phút sau gel nguội hồn tồn rút lược đặt vào bể điện di chứa sẵn đệm TAE 1X, cho dung dịch đệm ngập hoàn toàn gel Tra mẫu (sản phẩm RT-PCR): lấy thể tích mẫu thích hợp (chứa khoảng 1-2μg ADN), trộn với loading buffer sau tra vào giếng gel Điện di mẫu hiệu điện 110V, thời gian 20-30 phút Lấy gel khỏi bể điện di, quan sát chụp ảnh ánh sáng tia tử ngoại có bước sóng λ= 260nm 2.4.8 Phương pháp giải trình tự ADN Trình tự ADN xác định theo phương pháp Sanger máy xác định trình tự ADN tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với Kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems 2.4.9 Phương pháp xác định TCID50 NNV TCID50 vi rút xác định phương pháp chuẩn độ đĩa nhựa 96 giếng Trước thực chuẩn độ, tế bào GS01 cấy đĩa nhựa 96 giếng để tế bào mục phủ kín bề mặt đáy đĩa Dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-8 với L15 bổ sung 10% huyết bào thai bê cấy vào đĩa tế bào GS01, giếng cấy 0,1 mL Mỗi độ pha loãng cấy vào giếng Các giếng đối chứng bổ sung 0,1mL L15 bổ 41 sung 10% huyết bào thai bê Giữ đĩa cấy vi rút nhiệt độ 250C để vi rút hấp phụ lên tế bào Hút bỏ dịch vi rút đĩa nuôi cấy, bổ sung vào giếng 0,2 mL L15 bổ sung 10% huyết bào thai bê Nuôi đĩa nuôi cấy tủ ấm CO2 0,5%, 280C Hằng ngày quan sát CPE TCID50 tính theo công thức Reed – Muench sau [181]: PD= (A1- 50)/(A1- A2) Log TCID50= 10 + (A+PD) dx10A TCID50= Log TCID50/f Trong đó: f hệ số pha lỗng A1: tỷ lệ cận 50% bệnh tích B1: tỷ lệ cận 50% có bệnh tích A: độ pha lỗng với tỷ lệ cận có bệnh tích 2.4.10 Phương pháp xác định LD50 NNV Cá mú chuột có kích thước 5,5-6 cm, cá kiểm tra không nhiễm vi rút hoại tử thần kinh phương pháp RT-PCR Chia cá thành nhóm, nhóm 30 Dịch vi rút nuôi cấy tế bào GS01 gây nhiễm cho cá mú phương pháp tiêm, liều tiêm 0,1mL/con Nhóm đối chứng tiêm nước muối sinh lý với lượng 0,1mL/con Sau tiêm truyền, theo dõi cá sau đến 15 ngày để quan sát biểu lâm sàng, tỷ lệ chết Độc lực vi rút hoại tử thần kinh cá mú đánh giá liều gây chết 50% cá thí nghiệm (Lethal Dose - LD50) LD50 tính dựa theo phương pháp Reed Muench (1938) [181] lgLD50 = αlgb + lgc Trong đó: 42 b = Độ pha lỗng vi rút, thí nghiệm b = 1/10 (10-1) c = Độ pha loãng vi rút gây tỷ lệ chết cận 50% 2.4.11 Xác định điều kiện nhân giống vi rút Xác định liều gây nhiễm (multiplicity of infection-MOI) vi rút vào tế bào GS01 MOI = số PFU gây nhiễm/tổng số tế bào gây nhiễm Hệ số tương quan TCID50 PFU tính theo công thức (Cell Biology Protocol): PFU/mL = 0,69 x TCID50 Tế bào GS01 nuôi cấy đĩa 48 giếng (3,5x104 tế bào/mL) mơi trường L-15 có bổ sung 10% huyết bào thai bê, nhiệt độ 250C, 5% CO2 Trước gây nhiễm vi rút, tế bào rửa lần với môi trường L-15 Sau tế bào gây nhiễm vi rút với liều MOI khác 0,1; 0,01 0,001 Bổ sung thêm 0,5 mL môi trường L-15 chứa 10% FBS, tế bào gây nhiễm NNV nuôi 250C, CO2 0,05% Hằng ngày quan sát CPE, sau 3-6 ngày bắt đầu thực chuẩn độ virus (TCID50) [20, 101] + Xác định thời điểm thu hoạch vi rút Tế bào GS01 nuôi cấy đĩa 48 giếng (3,5x104 tế bào/mL) môi trường L-15 bổ sung 10% huyết bào thai bê, nuôi tế bào nhiệt độ 250C, 5% CO2 Gây nhiễm vi rút vào tế bào, liều gây nhiễm MOI 0,01 Bổ sung thêm 0,5 mL môi trường L-15 chứa 10% FBS, tế bào gây nhiễm NNV nuôi 250C, CO2 0,05% Hằng ngày quan sát CPE, sau 3-6 ngày bắt đầu thực chuẩn độ vi rút (TCID50) để xác định thời điểm thu hoạch vi rút 43 2.4.12 Phương pháp bất hoạt vi rút Đối với vắc-xin bất hoạt, việc lựa chọn hóa chất gây vơ hoạt vi rút địi hỏi đáp ứng điều kiện: i) làm chết mầm bệnh trì tính tồn vẹn kháng ngun, ii) đảm bảo độ an toàn vắc-xin Trong nghiên cứu này, NNV bất hoạt hóa chất: + Bất hoạt formaldehyde: formaldehyde bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0,1 0,2% Hỗn hợp ủ 370C /24 Formaldehyde loại khỏi dịch bất hoạt cách trung hòa với PBS 12 + Bất hoạt Binary ethylenimine (BEI): BEI 0,1M bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0,001M 0,002M Hỗn hợp ủ 370C/36 BEI loại khỏi dịch bất hoạt cách trung hòa với 1M Na-thiosulfate (Merck) 12 + Bất hoạt β-propiolactone: chỉnh pH dịch vi rút 7,3, bổ sung β-propiolactone theo tỷ lệ 1:2000 (v/v) Khuấy hỗn hợp máy khuấy từ 24 giờ/40C Beta-propiolactone loại bỏ cách chỉnh pH 7,0, 370C/24 Dịch vi rút NNV TB05 sau bất hoạt formaldehyde, BEI, betapropiolactone gây miễn dịch cho thỏ lần, lần cách lần thứ 15 ngày với với liều TCID50= 106,8, định kỳ ngày lần sau lần gây miễn dịch đầu tiên, lấy huyết thỏ để thực phải ứng ELISA nhằm xác định khả tạo đáp ứng miễn dịch vi rút bất hoạt lựa chọn hóa chất gây bất hoạt phù hợp để sản xuất vắc-xin 2.4.13 Phương pháp tạo vắc-xin keo phèn Dịch vi rút sau bất hoạt tạo dạng keo phèn với chất bổ trợ aluminum hydroxide (AH) aluminum phosphate (AP) với nồng độ 2%, pH 44 6.0 Hỗn hợp ủ 370C giờ, sau ủ 2-80C qua đêm Trong trình ủ, khuấy hỗn hợp máy khuấy từ, tốc độ 100 vòng/phút Ly tâm kết tủa 10.000 vòng/phút 40C rửa kết tủa hai lần nước muối sinh lý 0,9% Cho kết tủa nước muối sinh lý trở lại thể tích kháng nguyên ban đầu Thêm 1% thimerosal đến nồng độ cuối 0,01% làm chất bảo quản 2.4.14 Phương pháp trung hòa tế bào Phản ứng trung hòa NNV thực tế bào GS01 theo hướng dẫn Virology methods manual [40] gồm bước sau: Mẫu huyết dương tính mẫu huyết cá mú gây miễn dịch với vi rút NNV TB05 Mẫu huyết âm tính mẫu huyết cá bệnh Mẫu thí nghiệm mẫu huyết cá gây miễn dịch với chủng vi rút hoại tử thần kinh bất hoạt Bước 1: Nuôi cấy tế bào GS01 đĩa 96 giếng tế bào mọc kín đáy đĩa Bước 2: Các mẫu vi rút nuôi cấy tế bào GS01, chuẩn độ 1x TCID50 Bước 3: Trung hòa vi rút TB05 với huyết cá gây miễn dịch với chủng NNV 12 280C Bước 4: Gây nhiễm trở lại dịch trung hòa vào tế bào GS01 đánh giá kết quả: - Âm tính: Nếu tồn giếng phản ứng có bệnh tích tế bào tất độ pha loãng huyết - Dương tính: Nếu giếng phản ứng khơng có biểu bệnh tích tế bào - Đối với mẫu thí nghiệm: giếng có độ pha lỗng huyết cao, tế bào phát triển tốt, khơng hình thành đám hủy hoại, khơng có tế bào chết, bong khỏi bề mặt đĩa ni cấy Ở giếng có độ pha lỗng huyết thấp, có hình thành hiệu ứng hủy hoại tế bào đến hiệu ứng tan bào 45 2.4.15 Phương pháp gây miễn dịch Phương gây miễn dịch cho cá thực theo phương pháp Yoshihito Chuẩn bị chất gây miễn dịch (immunogen) sau: Vi rút bất hoạt nhũ với dung dịch dầu Freun’d dạng hoàn chỉnh (FCA- Freun’d Complete Adjuvant) Miễn dịch sở: cá trưởng thành có kích thước 20-25cm gây miễn dịch với lượng 0,5mL/con, nồng độ vi rút 106,8PFU/mL, thực tiêm mũi, mũi tiêm thứ cách mũi tiêm đầu 15 ngày, tiêm vào xoang phúc mạc Hàng tuần lấy máu cá để kiểm tra biến động hiệu giá kháng thể 2.4.16 Phản ứng ELISA gián tiếp Phản ứng ELISA xác định kháng thể đặc hiệu thực theo mô tả Gye công sự, 2018; Valero cộng sự, 2021 [83, 216] Kháng nguyên (pha lỗng nồng độ 2,5 µg/mL) gắn vào đĩa nhiệt độ 40C qua đêm Sau kháng nguyên ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch có đĩa phản ứng Rồi dùng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, rửa đĩa lần đập khô Block đĩa: đĩa phủ dung dịch PBS chứa 5% sữa tách bơ (skim milk), dùng pipet nhỏ 200µl giếng, ủ nhiệt độ phịng giờ, sau đổ bỏ dung dịch sữa giếng Rửa đĩa lần với PBS Tween 0,05% đập khô đĩa Kháng thể (là huyết thỏ) pha loãng theo tỷ lệ 1/200 dung dịch PBS chứa 5% sữa tách bơ, nhỏ 100µl giếng Kháng thể ủ đĩa nhiệt độ 370C, lắc sau 60 phút Sau ủ, đổ bỏ dung dịch giếng, rửa đĩa lần với PBS - Tween đập khô đĩa 46 Chất cộng hợp (conjugate) pha loãng dung dịch PBS với độ pha lỗng 10.000 lần, nhỏ 100µL giếng ủ 370C 45 phút Sau lại đổ bỏ dung dịch giếng rửa đĩa lần với PBS - Tween 0,05% đập khô đĩa Cơ chất sinh màu (substrate): Cơ chất sinh màu nhỏ 100µL giếng, để nhiệt độ phịng 15 phút, phản ứng chuyển sang màu xanh lục dương tính Dừng phản ứng dung dịch H2SO4 2M, lúc phản ứng có màu vàng Đĩa phản ứng đọc máy đọc đĩa ELISA bước sóng 450 nm 2.4.17 Phương pháp thử thách cường độc 180 cá mú cọp thí nghiệm (kích thước 2-2,5 cm), cá ngâm lần với vắc-xin bất hoạt (TCID50=106,8PFU/mL), liều sử dụng 1mL/10 cá thí nghiệm thùng 80 lít, thời gian 60 phút, có sục khí, lần cách lần thứ 15 ngày Lô đối chứng gồm 50 cá mú cọp (kích thước 2-2,5 cm) cá ngâm với giả dược Tại ngày thứ 30 sau gây miễn dịch, cá chia thành nhóm, nhóm 30 cá thử thách cường độc với chủng NNV HP02 (TCID50=106,8PFU/mL), liều thử thách 0,2xTCID50, 0,5xTCID50, 1xTCID50, 2xTCID50, 3xTCID50, 4xTCID50 Tiếp tục theo dõi cá 15 ngày để đánh giá mức độ bảo hộ Tỷ lệ bảo hộ tính cơng thức: 2.4.18 Đánh giá độ an tồn vắc-xin Thí nghiệm đánh giá độ an tồn vắc-xin thí nghiệm 240 cá mú cọp (kích thước 2-2,5 cm) Cá chia thành nhóm, nhóm thí nghiệm gây miễn dịch phương pháp ngâm với vắc-xin keo phèn 47 với aluminum hydroxide (AH) aluminum phosphate (AP) theo liều kháng nguyên 1xTCID50, 2xTCID50, 3xTCID50, (1xTCID50=106,8PFU/mL) Hai nhóm cá đối chứng ngâm với giả dược (keo phèn AH AP) Cá mú cọp sau sử dụng vắc-xin bất hoạt nuôi điều kiện ổn định nhiệt độ 25-270C nồng độ muối 25-30‰ Theo dõi cá 30 ngày để đánh giá mức độ an toàn vắc-xin Mức độ an toàn vắc-xin đánh giá thông qua triệu chứng lâm sàng tỷ lệ sống cá sau sử dụng vắc-xin Tỷ lệ sống tính theo cơng thức: 2.4.19 Đánh giá hiệu vắc-xin điều kiện thực nghiệm Thí nghiệm đánh giá 3.000 cá mú chuột (kích thước 2-2,5 cm) sản xuất Trung tâm giống Hải sản Cát Bà, cá thí nghiệm gây miễn dịch phương pháp ngâm với vắc-xin keo phèn bất hoạt (TCID50=106,8PFU/mL) với liều 1mL/10 cá, thời gian 60 phút có sục khí, ngày cho ăn thức ăn cá tạp đánh bắt tự nhiên Vắc-xin sử dụng lần, lần thử nghiệm bể composite trước thả lồng biển 15 ngày; sau đó, vắc-xin thử nghiệm bể giả lồng biển lần thời điểm 30 ngày lần thời điểm 60 ngày sau thả Lồng đối chứng: 3.000 cá mú chuột (kích thước 2-2,5 cm) ni thả lồng, ngày cho ăn thức ăn cá tạp đánh bắt ngồi tự nhiên khơng sử dụng vắc-xin Cá theo dõi tháng, thông số đánh giá bao gồm: i) Tỷ lệ sống = số cá sống sót sau thí nghiệm/tổng số cá trước thí nghiệm*100 ii) Tăng trưởng theo khối lượng: 48 - Wtb1, Wtb2: Khối lượng trung bình thời điểm T1 T2 iii) Tỷ lệ tăng trưởng chiều dài thân: - Ltb1, Ltb2: Chiều dài toàn thân cá thời điểm T1 T2 iv) Xác định hồng cầu tổng số, định lượng hồng cầu [160] 10µL máu cho vào ống nghiệm nhựa có chứa EDTA Mật độ hồng cầu xác định buồng đếm hồng cầu kính hiển vi quang học (40X) Mật độ hồng cầu tính theo cơng thức: C x 10 x x 200 (tb/mm3) với C tổng số hồng cầu vùng đếm v) Định lượng định loại tế bào bạch cầu Mẫu máu cố định lame nhuộm dung dịch nhuộm Wright Giemsa [49] Theo thứ tự sau: (1) nhuộm với dung dịch Wright 3-5 phút; (2) ngâm dung dịch pH 6,2 – 6,8 -6 phút; (3) nhuộm với dung dịch Giemsa 20 – 30 phút; (4) ngâm dung dịch pH 6,2 15 – 30 phút; (5) rửa lại nước cất, để mẫu khô tự nhiên đọc mẫu Quan sát kính hiển vi vật kính X100 Tổng bạch cầu xác định cách đếm tổng số hồng cầu bạch cầu 2000 tế bào mẫu nhuộm Tổng bạch cầu xác định công thức: tổng bạch cầu (tb/mm3) = (số bạch cầu x mật độ hồng cầu buồng đếm)/số hồng cầu mẫu Tổng số loại bạch cầu xác định cách đếm tổng số bạch cầu 2000 tế bào Mật độ loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng loại bạch cầu x mật độ tổng bạch cầu)/2000 [99] 2.4.20 Kiểm tra độ khiết vắc-xin vô hoạt Sử dụng môi trường bản: môi trường canh thịt (Tryptone soya broth); môi trường thạch máu (Tryptone soya agar thêm 7-10% máu cừu); 49 môi trường thạch nấm (Sabouraud dextrose agar); môi trường XLD (Xylose lysine desoxycholate); canh thang PPLO có bổ sung huyết ngựa cao nấm men (pleuropneumonia-like organism) Theo TCVN 8684:2011 “Vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y-Phép thử độ khiết” gồm nội dung sau: + Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn + Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc + Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella + Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma Mỗi loại mơi trường dùng ống đĩa, có kèm theo đối chứng dương, cấy 0,2 ml vắc-xin vào ống đĩa Mơi trường cấy sau nuôi cấy nhiệt độ 370C theo dõi ngày Riêng môi trường kiểm tra nấm nuôi nhiệt độ 25-280C theo dõi 14 ngày 2.4.21 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm nghiên cứu thực lần, kết biểu diễn dạng giá trị trung bình (Mean) ± sai số (SD) Số liệu nghiên cứu minh họa sử dụng Excel (Microsoft, USA) phần mềm SPSS ver 20 Sự khác biệt nhóm thí nghiệm đánh giá ANOVA-one way sử dụng phần mềm IBM SPSS Statistic 20 (SPSS 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA), sai khác có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 50 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập, lựa chọn chủng giống gốc phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú 3.1.1 Phân lập vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh từ cá mú nghi nhiễm bệnh tỉnh miền Bắc, Việt Nam Trong tổng số 60 mẫu cá mú có triệu chứng bệnh hoại tử thần kinh bơi bất thường theo hình trơn ốc, bơi khơng định hướng, thân sẫm màu thu thập từ vùng biển quanh đảo Cát Bà, khu vực vịnh Lan Hạ, Cát Hải (Hải Phòng), vùng biển Vân Đồn, Quảng Yên (Quảng Ninh), vùng biển Đồng Châu (Thái Bình), vùng biển Hải Thịnh, Nghĩa Hưng (Nam Định) Mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm vi rút sàng lọc phương pháp RT-PCR nhằm phát gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu vi rút hoại tử thần kinh Hình 3.1 Hình 3.1 Mẫu cá mú A: cá mú khỏe mạnh; B C: mẫu cá mú nghi mắc VNN Theo Nishizawa cộng sự, 1994 [163] gen mã hóa kháng nguyên vi rút hoại tử thần kinh nằm cấu trúc ARN2, cấu trúc chứa hai đoạn gen có đặc điểm bảo tồn cao, bao gồm đoạn T2 có kích thước 870 bp đoạn T4 có kích thước 420 bp, vùng biến đổi T4 đoạn ARN2 cấu trúc làm 51 nên tính đa dạng kiểu gen vi rút hoại tử thần kinh sử dụng rộng rãi để nghiên cứu phát loài phát sinh loài chủng Betanodavirus [163, 180] Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi thực sàng lọc mẫu bệnh phẩm nghi nghiễm bệnh hoại tử thần kinh dựa vào gen T4 Kết trình bày Bảng 3.1; Hình 3.2 Phụ lục Bảng 3.1 Kết sàng lọc gen T4 mẫu cá nghi nhiễm VNN Địa điểm Số lượng mẫu QN Số mẫu dương Tỷ lệ dương tính tính gen T4 (%) 16 50,00 HP 15 40,00 NĐ 14 57,14 TB 15 10 66,67 Tổng số 60 32 53,33 Kết sàng lọc phương pháp RT-PCR cho thấy, tổng số 60 mẫu cá mú nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh có 32 mẫu phát thấy đoạn gen có kích thước 420 bp, tương ứng với kích thước đoạn gen T4 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh (Hình 3.2), đó, số lượng mẫu cá dương tính với gen T4 Thái Bình 10/15, chiếm tỷ lệ 66,67%, Nam Định 8/14, chiếm tỷ lệ 57,14%, Hải Phòng 6/15, chiếm tỷ lệ 40%, Quảng Ninh 8/16, chiếm tỷ lệ 50% Các mẫu dương tính với gen T4 sử dụng để phân lập vi rút tế bào mẫn cảm GS01 52 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR số mẫu nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh Giếng 1-5: mẫu nghi nhiễm bệnh hoại tử thần kinh; M: thang ADN chuẩn 1kb (ThermoScientific) Bairoch, 2018 liệt kê 594 dịng tế bào có nguồn gốc từ cá [28], dòng tế bào dùng để phân lập nhân giống vi rút gây bệnh động vật thuỷ sản [34] Theo Qin cộng sự, (2006), vi rút hoại tử thần kinh thích nghi tốt tế bào GS01, vậy, nghiên cứu này, tế bào GS01 sử dụng để phân lập vi rút hoại tử thần kinh từ 32 mẫu cá mú thu thập xác định dương tính với gen mã hoá kháng nguyên vi rút hoại tử thần kinh [177, 178] Vi rút nhân lên tế bào đánh giá hiệu ứng huỷ hoại tế bào (cytopathic effects - CPE) Thực nuôi cấy 32 mẫu bệnh phẩm tế bào GS01 cho thấy: sau 72 giờ, đĩa tế bào GS01 bắt đầu xuất hiện tượng tế bào co trịn, bong tróc khỏi bề mặt đĩa ni cấy, sau 96 giờ, tồn mẫu bệnh phẩm gây hiệu ứng huỷ hoại tế bào với tỷ lệ 20%, sau 53 168 giờ, 32/32 mẫu bệnh phẩm gây bệnh tích tế bào trầm trọng, tỷ lệ tế bào bị phá huỷ lên tới 85-98% Hình 3.3, Bảng 3.2 Hình 3.3 Hình ảnh tế bào GS01 A: Tế bào GS01 chưa gây nhiễm mẫu NNV B: Tế bào GS01 sau 120 gây nhiễm NNV Bảng 3.2 Kết nuôi cấy mẫu bệnh phẩm tế bào GS01 STT Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) theo thời gian (giờ) Ký hiệu mẫu 24 48 72 96 120 144 168 192 QN02 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN04 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN07 _ + + + ++ ++ ++ +++ QN08 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ QN12 _ _ + + + ++ ++ ++++ QN14 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ HP02 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 10 HP03 _ _ + + + ++ ++ +++ 11 HP05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 12 HP06 _ _ + + + ++ ++ +++ 54 13 HP07 _ _ + + + ++ ++ +++ 14 HP09 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 15 HP12 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 16 HP15 _ _ + + + ++ ++ +++ 17 NĐ01 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 18 NĐ03 _ _ + + + ++ ++ ++ 19 NĐ04 _ _ + + + ++ ++ ++++ 20 NĐ05 _ _ + + + ++ ++ ++ 21 NĐ07 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 22 NĐ08 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 23 NĐ10 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 24 NĐ12 _ _ + + + ++ +++ +++ 25 TB02 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 26 TB03 _ _ + + + ++ ++++ ++++ 27 TB05 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 28 TB07 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 29 TB08 _ + + + ++ +++ ++++ ++++ 30 TB10 _ + + + ++ ++ +++ ++++ 31 TB11 _ + + + ++ ++ ++ +++ 32 TB13 _ _ + + + ++ +++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++: CPE > 50%; +: CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: khơng có CPE Kết Bảng 3.2 cho thấy, đĩa nuôi cấy tế bào GS01, mẫu bệnh phẩm bắt đầu gây hiệu ứng hủy hoại tế bào sau 72 gây nhiễm, biểu bệnh tích tế bào tăng ngày cao từ 168 đến 192 sau gây nhiễm Theo Valero cộng sự, 2021, vi rút hoại tử thần kinh gây hình thành khơng bào tất dịng tế bào bào nuôi cấy, nhiên, xuất mức độ tiến triển CPE vi rút hoại tử thần kinh gây dòng 55 tế bào khác nhau, đó, hiệu ứng bệnh tích tế bào tế bào E11 GF1 xuất sớm trầm trọng so với tế bào DLB1, SAF1 SaB1 [216] Theo Iwamoto cộng sự, 2000, dòng tế bào SSN-1, vi rút hoại tử thần kinh gây hiệu ứng bệnh tích tế bào vào ngày thứ với dấu hiệu đặc thù tế bào co trịn riêng rẽ, chứa khơng bào tế bào chất phá huỷ hoàn toàn lớp tế bào vào ngày thứ [101] Sự tạo không bào tế bào thần kinh hệ thống thần kinh trung ương, đặc biệt vùng tủy sống, dẫn đến rối loạn thần kinh bơi lội bất thường [229] Theo Qin cộng sự, 2020, vi rút phân lập từ mô não, thận lách cá bị bệnh gây hiệu ứng hủy hoại tế bào tế bào SSN-1, GF-1 GS01 250C Sau 24 nuôi cấy, tế bào SSN-1 bắt đầu xuất xuất hiệu ứng bệnh tích tế bào, đó, hiệu ứng bệnh tích tế bào tế bào GF-1 xuất sau 36 nuôi cấy tế bào GS01, hiệu ứng bệnh tích tế bào xuất sau 72 nuôi cấy Tế bào SSN-1 nhiễm bệnh với bệnh tích tế bào co trịn, cụm lại giống trùm nho, bệnh tích tế bào GF-1 bị nhiễm bệnh trở nên co tròn căng phồng lên rõ rệt với bong bóng lớn từ màng sinh chất, tế bào GS01 bị nhiễm bệnh hình thành khơng bào rõ rệt tế bào chất Vào ngày thứ sau gây nhiễm, tế bào SSN-1 cho thấy hiệu giá vi rút cao đạt × 108,4 TCID50/mL, hệu giá vi rút tế bào GF-1 × 108,2 TCID50/mL hiệu giá tế bào GS01 × 107,3 TCID50/mL [178] Kết nuôi cấy mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm vi rút hoại tử thần kinh tế bào GS01 nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu nhiều tác giả giới, tế bào bị hủy hoại biểu bệnh tích trầm trọng sau ngày gây nhiễm [101, 178, 216] 3.1.2 Xác định độc lực vi rút (TCID50 LD50) Độc lực vi rút xác định liều gây chết 50% tế bào (tissue culture infective dose - TCID50) và/hoặc liều gây chết 50% động vật thí 56 nghiệm (Lethal dose- LD50) Các giá trị nhỏ độc lực vi rút mạnh ngược lại TCID50 mẫu vi rút xác định tế bào GS01, thí nghiệm thực mơ tả phương pháp nghiên cứu Kết xác định TCID50 trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết xác định TCID50 tế bào GS01 Hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) (%) theo STT Ký hiệu TCID50/ độ pha loãng vi rút mẫu 10 -1 10 -2 10 -3 -4 -5 -6 -7 10 10 10 10 10 -8 10 -9 mL QN02 100 100 98 85 80 70 50 25 10 10-6,9 QN04 65 60 55 40 15 + - - 10-3 QN05 70 70 60 50 35 20 + - 10-3,9 QN07 85 80 80 70 50 20 10 - 10-4,9 QN08 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 QN10 85 80 70 52 45 20 10 - 10-4,3 QN12 85 80 80 70 48 20 10 - 10-4,9 QN14 90 90 85 60 50 25 15 - 10-4,8 HP02 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 10 HP03 95 95 90 70 60 52 35 20 10-5,9 11 HP05 70 70 60 50 35 20 + - 10-3,9 12 HP06 90 90 85 70 50 25 15 - 10-4,9 13 HP07 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 14 HP09 60 60 50 40 20 + - - 10-3 15 HP12 90 90 85 70 50 25 15 - 10-4,9 16 HP15 95 95 80 75 60 52 35 20 10-5,9 57 17 NĐ01 70 70 60 50 35 20 + - 10-3,9 18 NĐ03 85 80 80 70 50 20 10 - 10-4,9 19 NĐ04 60 60 50 40 15 + - - 10-3 20 NĐ05 65 60 55 40 15 + - - 10-3 21 NĐ07 55 55 50 30 15 + - - 10-2,7 22 NĐ08 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 23 NĐ10 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 24 NĐ12 85 80 80 70 50 20 10 - 10-4,9 25 TB02 90 90 85 60 50 25 15 - 10-4,8 26 TB03 95 95 90 70 60 52 35 20 10-5,9 27 TB05 100 100 95 80 70 60 48 25 10 10-6,8 28 TB07 70 70 60 50 35 20 + - 10-3,9 29 TB08 55 55 50 30 15 + - - 10-2,7 30 TB10 90 90 85 70 50 25 15 - 10-4,9 31 TB11 85 80 70 52 45 20 10 - 10-4,3 32 TB13 95 95 90 70 60 52 35 20 10-5,9 Kết Bảng 3.3 cho thấy, 11/32 mẫu có TCID50 từ 10-5,9 đến 106,9 (QN02, QN08, HP02, HP03, HP07, HP15, NĐ08, NĐ10, TB03, TB05, TB13); 9/32 mẫu có TCID50 từ 10-4,8-10-4,9 (QN07, QN12, QN14, HP06, HP12, NĐ03, NĐ12, TB02, TB10), 12/32 mẫu có TCID50 đạt 10-2,7-10-4,3 (QN04, QN05, QN10, HP05, HP09, NĐ01, NĐ04, NĐ05, NĐ07, TB07, TB08, TB11) Từ kết Bảng 3.3, bảy mẫu có TCID50 từ 10-6,8 đến 106,9 , bao gồm QN02, QN08, HP02, HP07, NĐ08, NĐ10, TB05 mẫu TB08 có TCID50 10 -2,7 lựa chọn để xác định LD50 Cá gây nhiễm vi rút 58 phương pháp tiêm theo mô tả phần phương pháp Kết thí nghiệm thu Bảng 3.4, Phụ lục Bảng 3.4 Kết xác định LD50 cá mú giống Ký STT hiệu mẫu Tỷ lệ chết tích luỹ sau 120 độ pha loãng vi rút (%) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 QN02 100 100 100 100 QN08 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30 15 15 10-5,5 HP02 100 100 100 80 46,7 40 10-7,5 HP07 100 100 100 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10-6,2 NĐ08 100 100 100 86,7 86,7 66,7 53,3 30 NĐ10 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30 TB05 100 100 100 93,3 93,3 80 TB08 66,7 53,3 30 13,3 6,7 6,7 6,7 0 10-1,5 ĐC 0 0 0 K 80 60 53,3 13,3 13,3 10-6,2 80 LD50 /mL 73,3 60 15 10-6,5 26,6 13,3 10-5,5 66,7 53,3 33,3 10-7,5 Ghi chú: K không đánh giá Kết Bảng 3.4 cho thấy: mẫu vi rút có độc lực cao tế bào có mẫu HP02, TB05 có độc lực cao cá với LD50 đạt 107,5 , mẫu gồm QN2, QN08, HP07, NĐ08, NĐ10 có LD50 từ 10-5,5 đến 10-6,5 Mẫu TB08 có độc lực thấp tế bào có LD50 cá giống đạt 10-1,5 Từ kết này, mẫu có độc lực cao HP02, TB05 lựa chọn để xác định loài phương pháp sinh học phân tử Kết xác định loài hai mẫu HP02 TB05 thơng qua trình tự gen T4 trình bày Bảng 3.5 Phụ lục Theo đó, trình tự gen T4 mẫu vi rút TB05 có tỷ lệ tương đồng đạt 98,37%-99,19%, trình tự gen T4 mẫu vi rút HP02 có tỷ lệ tương đồng đạt 97,95%-98,47% với trình tự ARN2 chủng vi rút hoại tử thần kinh công bố Genebank 59 Kết cho phép kết luận chủng vi rút phân lập từ mẫu mang ký hiệu HP02 TB05 vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Bảng 3.5 So sánh mức độ tương đồng trình tự đoạn gen T4 mẫu HP04 TB05 với trình tự GenBank Mã số GenBank Tên chủng gen xác định trình tự Phần trăm trình tự so sánh với GenBank (%) Mức độ tương đồng (%) Mẫu TB05 KU705815.1 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence 87 99,19 MG874758.1 Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 segment ARN2, complete sequence 87 98,64 AF283554.1 Yellow grouper nervous necrosis virus major coat protein gene, partial cds 87 98,64 MF144241.1 Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence 87 98,37 KY930894.1 Betanodavirus sp strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds 87 98,37 KU705815.1 Mouse grouper nervous necrosis virus isolate VI37 segment ARN2, complete sequence 92 98,47 MG874758.1 Epinephelus coioides nervous necrosis virus isolate HN1 segment ARN2, complete sequence 92 97,95 Mẫu HP02 60 MF144241.1 Einephelus coioides nervous necrosis virus strain KS1 segment ARN2, complete sequence 90 98,18 KY930894.1 Betanodavirus sp strain KS1 segment ARN2 capsid protein mARN, complete cds 90 98,18 3.1.3 Kết lựa chọn chủng giống gốc phục vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Hiệu phòng bệnh vắc-xin phụ thuộc vào chất lượng chủng giống gốc với đặc tính: đại diện kháng nguyên, hiệu kích thích kháng thể bảo hộ, mức độ khiết, hiệu xuất nhân giống tế bào mẫn cảm, ổn định khả kích thích sinh kháng thể bảo hộ di truyền Việc lựa chọn chủng đại diện kháng nguyên thực phương pháp trung hòa tế bào GS01 huyết cá gây miễn dịch với chủng NNV HP02 TB05 kháng nguyên 32 mẫu vi rút phân lập Kết trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Hiệu giá kháng thể trung hòa kháng nguyên mẫu phân lập Ký hiệu mẫu vi rút Hiệu giá kháng thể Ký hiệu Hiệu giá kháng thể trung hòa mẫu vi rút trung hòa QN02 HP02 256 TB05 512 NĐ01 HP02 64 TB05 128 QN04 128 256 NĐ02 64 128 QN05 128 256 NĐ03 128 QN07 256 128 NĐ04 128 256 QN08 128 128 NĐ05 64 256 QN10 256 512 NĐ08 256 512 QN12 128 128 NĐ10 64 128 QN14 128 128 NĐ12 128 61 HP02 256 512 TB02 128 HP03 128 512 TB03 128 HP05 128 128 TB05 256 512 HP06 32 128 TB07 128 HP07 256 128 TB08 512 HP09 64 128 TB10 64 128 HP12 64 128 TB11 128 HP15 64 256 TB13 64 128 Số liệu Bảng 3.6 cho thấy: kháng thể hai chủng NNV HP02 NNV TB05 cho phản ứng trung hòa với mẫu vi rút phân lập, độ pha loãng kháng thể cho phản ứng trung hòa chủng NNV HP02 nằm khoảng 1/4-1/256, chủng NNV TB05 tương ứng 1/128-1/512 Kết bước đầu cho thấy, chủng NNV TB05 có khả tạo kháng thể trung hịa vượt trội so với chủng NNV HP02, vậy, chủng NNV TB05 sử dụng để nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Chủng NNV HP02 lựa chọn làm chủng thử thách cường độc thí nghiệm đánh giá hiệu lực vắc-xin Theo Tổ chức Thú y giới (OIE), 2018, chủng giống gốc phải mã hóa hồ sơ giống, xác định rõ tên chủng, nguồn gốc không nhiễm yếu tố ngoại lai vi khuẩn, nấm mốc vi rút khác Giống gốc phải bảo quản cách cẩn thận, không làm nhiễm chéo chủng vi rút với Vì vậy, lơ giống gốc phải đánh giá độ khiết trước đưa vào sản xuất [167] Thực theo TCVN 8684: 2011 phép thử độ khiết vắcxin chế phẩm sinh học dùng thú y (Phụ lục 6), chủng NNV TB05 kiểm tra môi trường: nước thịt, thạch máu, thạch nấm canh 62 thang PPLO để kiểm tra tạp nhiễm nấm, Mycoplasma, vi khuẩn hiếu khí, yếm khí tổng số Mơi trường kiểm tra sau bổ sung giống gốc tiến hành đem nuôi 35-370C, thời gian 20-24 tiêu vi khuẩn, nuôi nhiệt độ 25-280C, thời gian 7-10 ngày tiêu nấm Mycoplasma Mỗi lô giống kiểm tra lặp lại lần Kết kiểm tra độ vơ trùng giống gốc trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết kiểm tra độ khiết giống gốc Môi trường đánh giá Chủng giống gốc NNV TB05 Đối Số Lần kiểm tra Thời gian theo dõi (ngày) PPLO (pleuropne Nước umoniathịt like organism) Kết luận Thạch máu Thạch Sabou raud 14 - - - - - Đạt 14 - - - - - Đạt 14 - - - - - Đạt 14 - - - - - - Thạch XLD chứng Ghi chú: - âm tính Từ kết Bảng 3.7 cho thấy, ống giống gốc NNV TB05 kiểm tra cho kết âm tính (khơng xuất vi khuẩn, vi nấm Mycoplasma mơi trường đánh giá) Căn theo TCVN 8684:2011 kết luận chủng TB05 đạt tiêu chuẩn khiết, vô trùng Hiệu giá vi rút tiêu quan trọng phải xác định lưu giữ hồ sơ giống gốc Hiệu giá vi rút chủng NNV TB05 (TCID50) 63 chuẩn độ tế bào GS01 Kết xác định TCID50 chủng NNV TB05 trình bày Bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết xác định hiệu giá vi rút chủng giống gốc Chủng Số lần Dải pha giống kiểm loãng vi gốc tra rút 10-1 – 10-8 Liều gây Hiệu giá vi rút nhiễm (PFU/mL) (mL) 0,1 10-6,7 -8 10 – 10 0,1 10 -6,9 10-1 – 10-8 0,1 10-6,8 Đối 10-1 – 10-8 0,1 đệm Âm tính chứng đệm PBS PBS NNV TB05 -1 Hiệu giá vi rút trung bình (PFU/mL) 10-6,8 Âm tính Từ kết Bảng 3.8 cho thấy: qua lần kiểm tra, hiệu giá vi rút chủng giống gốc NNV TB05 ổn định, dao động từ 10-6,7 – 10-6,9 TCID50/mL, giá trị trung bình 10-6,8 TCID50/mL Sự ổn định chủng giống gốc di truyền khả nhân lên tế bào mẫn cảm yêu cầu cần có chủng giống lựa chọn để sản xuất vắc-xin Đánh giá ổn định khả nhân lên chủng TB05 thực cách cấy chuyển liên tiếp tế bào GS01 10 đời liên tiếp Sau đời cấy chuyển, xác định hiệu giá vi rút, kết trình bày Bảng 3.9 64 Bảng 3.9 Kết kiểm tra độ ổn định chủng NNV TB05 Chủng giống NNV TB05 Đối chứng Lần cấy chuyển Hiệu giá vi rút (PFU/mL) 10-6,8 10-6,7 10-6,8 10-6,9 10-6,8 10-6,8 10-6,9 106,8 10-6,7 10 10-6,8 Âm tính Hiệu giá vi rút giống gốc (PFU/mL) 10-6,8 Âm tính Kết Bảng 3.9 cho thấy: Hiệu giá chủng NNV TB05 tương đối ổn định qua 10 lần cấy chuyển, dao động từ 10-6,7-10-6,9 TCID50/mL, thấp lần cấy chuyển thứ 10-6,7 TCID50/mL cao lần cấy chuyển thứ 10-6,9 TCID50/mL, nhiên khác biệt khơng có ý 65 nghĩa thống kê (p > 0,05) Kết thu thấy, chủng NNV TB05 ổn định khả nhân lên tế bào GS01 Sau 10 lần cấy chuyển liên tục, đồng thời với việc xác định hiệu giá vi rút, mẫu nuôi cấy kiểm tra ổn định gen mã hoá kháng nguyên T4 chủng NNV TB05 Bằng phương pháp RT-PCR kỹ thuật giải trình tự gen, kết kiểm tra thu thể Hình 3.4 Hình 3.5 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu F2-R3, sản phẩm RT-PCR mẫu vi rút thu 10 đời cấy chuyển nhân đoạn gen có kích thước 420 bp tương ứng với kích thước lý thuyết đoạn gen T4 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra gel agarose 1% M: thang DNA chuẩn kb (ThermoScientific); 1-10: Sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút 10 đời cấy chuyển; 11: đối chứng âm; 12: sản phẩm PCR khuếch đại mẫu vi rút TB05 Sản phẩm PCR tinh sử dụng sinh phẩm GenJET PCR Purification Kit (ThermoScientific-Mỹ) theo hướng dẫn nhà sản xuất, sau giải trình tự cơng ty MARCOGEN (Hàn Quốc), xử lý liệu 66 phân tích phần mềm BioEdit version 7.2.1 Trình tự gen T4 mẫu NNV TB05 10 đời cấy chuyển phân tích cơng cụ BLAST, kết thu sau: 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | f1 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f2 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f3 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f4 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f5 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f6 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f7 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f8 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f9 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA f10AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCA 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | f1 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f2 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f3 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f4 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f5 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f6 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f7 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f8 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f9 CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA f10CAAATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCA 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | f1 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f2 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC 67 f3 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f4 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f5 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f6 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f7 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f8 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f9 GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC f10GCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCAC 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | f1 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f2 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f3 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f4 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f5 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f6 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f7 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f8 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f9 CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA f10CTCAAGAAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCA 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | f1 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f2 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f3 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f4 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f5 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f6 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f7 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f8 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f9 ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG f10ATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGG 68 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | f1 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f2 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f3 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f4 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f5 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f6 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f7 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f8 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f9 CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG f10CACTGTCTTCACCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG Hình 3.5 So sánh trình tự gen T4 10 đời vi rút Kết phân tích cho thấy, sau 10 đời cấy chuyển, trình tự gen T4 chủng giống gốc NNV TB05 không bị biến đổi, không xuất đột biến Kết cho thấy, chủng giốc gốc NNV TB05 ổn định di truyền sau 10 đời cấy chuyển Trong quy trình sản xuất vắc-xin, chủng vi rút đảm bảo đầy đủ đặc tính bao gồm khiết, ổn định di truyền sau 5-10 lần cấy chuyển, khả sinh miễn dịch tốt vật chủ, tương đồng với kháng nguyên vi rút gây bệnh lưu hành, có suất cao chế tạo sử dụng làm giống gốc (master seed) Xuất phát giống gốc, người ta tiếp tục cấy chuyển để tạo giống sản xuất (worrking seed), thông thường, số đời cấy chuyển để tạo giống sản xuất từ vi rút đời Trong cấy truyền nhiều lần vậy, bên cạnh khả tạp khuẩn cịn có vấn đề xảy i) vi rút bị biến đổi tính di truyền dẫn tới khơng cịn tính kháng ngun ban đầu, ii) khả nhân lên vi rút thay đổi, thông thường dẫn đến hiệu giá (năng suất thu hoạch) vi rút giảm đi, lý này, sau đời cấy chuyển, nhà sản xuất phải đánh giá lại đặc tính giống gốc để đảm bảo chế tạo vắc-xin ổn định hiệu lực, an toàn 69 Từ kết thu được, nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng giống gốc TB05 từ chủng NNV phân lập từ mẫu bệnh phẩm mắc bệnh hoại tử thần kinh cá mú nuôi khu vực miền Bắc, Việt Nam Chủng NNV TB05 tiến hành đông khô để lưu trữ Việc lưu trữ chủng giống gốc có ý nghĩa vô quan trọng sản xuất vắc-xin, điều đảm bảo đặc tính chủng giống gốc ổn định lâu dài Dịch giống gốc (nồng độ 106,8-107 PFU/ml) hoà (tỉ lệ 1:1) chất mang chứa 22% sữa gầy (skim milk), 1,6 M sucrose làm lạnh -800C trong 24 Các ống giống tiến hành đông khô thời gian 10 giờ, hàm ẩm chất mang 5%, tiến hành hàn ống giống nhiệt Kết đông khô chủng giống gốc vi rút thể Hình 3.6 Hình 3.6 Đông khô giống gốc vi rút NNV TB05 70 3.2 Kết chế tạo vắc-xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú quy mô phịng thí nghiệm 3.2.1 Tối ưu điều kiện ni cấy tế bào GS01 3.2.1.1 Tối ưu môi trường nuôi cấy tế bào Chúng tiến hành đánh giá khả sinh trưởng phát triển tế bào GS01 loại mơi trường có bổ sung 10% huyết bào thai bị Hình 3.7 Ảnh hưởng mơi trường đến mật độ tế bào Kết Hình 3.7 cho thấy môi trường L-15 + 10% FBS cho mật độ tế bào cao với giá trị trung bình đạt 53±1,05x106 tế bào/mL, mật độ tế bào môi trường DMEM + 10% FBS môi trường MEM + 10% FBS đạt giá trị trung bình tương ứng 45,5±2,10x106 tế bào/mL 28,5±1,15x106 tế bào/mL Do môi trường L-15 + 10% FBS lựa chọn cho nuôi cấy tế bào GS01 để sản xuất kháng nguyên 3.2.1.2 Tối ưu pH môi trường nuôi cấy tế bào Hầu hết dịng tế bào thích ứng với điều kiện pH môi trường từ 6,87,8 Tuy nhiên pH tối ưu cho loại tế bào phát triển có khác biệt Chúng tiến hành đánh giá pH tối ưu cho q trình nhân ni tế bào GS01 với khoảng pH môi trường Kết thể Bảng 3.10 71 Bảng 3.10 Xác định pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào GS01 Mật độ tế bào (x106 tế bào/mL) pH môi trường Lần Lần Lần Trung bình (x106 tế bào/mL) 6,5-6,9 35,7 38,5 37,4 37,2 ± 1,12 7,0-7,4 49,1 51,5 50,9 50,5 ± 2,25 7,5-7,8 38,6 39,2 40,1 38,7 ± 2,05 Kết Bảng 3.10 cho thấy khoảng pH 7,0-7,4 có mật độ tế bào cao với giá trị trung bình đạt 50,5 ± 2,25x106 tế bào/mL, khoảng pH 6,5-6,9 khoảng pH 7,5-7,8 cho giá trị trung bình thấp 37,2 ± 1,12 x106 tế bào/mL 38,7 ± 2,05 x106 tế bào/mL Do khoảng pH 7,07,4 chọn điều kiện pH tối ưu cho môi trường nuôi cấy tế bào GS01 3.2.1.3 Tối ưu mật độ tế bào ban đầu thời điểm thu hoạch vi rút Thời điểm thu hoạch vi rút có ý nghĩa quan trọng trình nhân ni vi rút để đạt lượng kháng nguyên cao nhất, tiến hành khảo sát lượng tế bào ban đầu cấp vào chai nuôi đánh giá thời điểm thích hợp để đạt hiệu giá vi rút cao Kết thể Bảng 3.11 Hình 3.8 Bảng 3.11 Xác định mật độ tế bào ban đầu, thời điểm thu hoạch vi rút Hiệu giá vi rút (PFU/mL)/giờ nuôi cấy Mật độ tế bào 120 144 168 ban đầu 24 48 72 96 giờ giờ 192 216 1x104 tế bào/mL 1,58x 104 g 5,13x 104 g 3,03x 105 e 2,43x 106 f 4,06x 106 d 6,03x 106 b 3,33x 106 d 2,05x 1,35x 106 f 106 f 2x104 tế bào/mL 2,13x 104 g 6,05x 105 e 1,02x 106 c 4,78x 106 d 6,86x 106 a 6,82x 106 a 6,53x 106 b 6,33x 5,2x1 106 b 06 c 4x104 tế bào/mL 3,54x 104 g 8,43x 105 e 3,63x 106 d 4,53x 106 d 6,58x 106 a 6,74x 106 a 6,25x 106 b 5,73x 4,13x 106 c 106 d 72 Ghi chú: Mật độ tế bào ban đầu, hiệu giá vi rút/giờ nuôi cấy so sánh tương ứng; chữ bên phải số liệu biểu giá trị xử lý thống kê hàm ANOVA nhân tố (mật độ tế bào thời gian nuôi) giảm dần a>b>c>d>e>f>g, giá trị với chữ khác cho thấy khác biệt đáng kể (p75% [Phụ lục 6] 3.3.1 Đánh giá tiêu chuẩn vật lý Sự thay đổi tính chất vật lý vắc-xin có ảnh hưởng lớn đến chất lượng vắc-xin như: giảm hiệu lực vắc-xin hay hoàn toàn, tăng phản ứng phụ sau dùng vắc-xin, độ dài miễn dịch ngắn lại Bảng 3.19 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vật lý vắc-xin Lô sản xuất 170520 290520 030620 250620 Vắc-xin bất hoạt Độ đồng Khơng có tách lớp (Đạt) 7,0 Khơng có tách lớp (Đạt) 6,9 Khơng có tách lớp (Đạt) 7,0 Khơng có tách lớp (Đạt) pH=7 7,0 93 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vật lý vắc-xin thành phẩm cho thấy lô sản xuất khác có độ ổn định pH, vắc-xin đồng sau q trình nhũ hóa khơng có tượng tách lớp 3.3.2 Đánh giá tiêu chuẩn vô trùng vắc-xin Mục đích kiểm tra vơ trùng phát loại bỏ mẫu vắc-xin bị tạp nhiễm (vi khuẩn nấm), nhằm đảm bảo vắc-xin sử dụng an toàn Thực theo TCVN 8684:2011 “Vắc-xin chế phẩm sinh học dùng thú y-phép thử độ khiết” (phụ lục 6) Mỗi lô vắc-xin lấy ngẫu nhiên lọ Đặt vắc-xin tủ ấm 370C giờ, lắc kỹ sau trộn lọ vắc-xin vào làm Dùng pipet hút vắc-xin cấy vào môi trường kiểm tra với lượng 0,2 ml/ống với môi trường thử nghiệm lỏng 0,2 mL/đĩa với môi trường rắn Kết kiểm tra tiêu chuẩn vơ trùng Bảng 3.20 Hình 3.16 Bảng 3.20 Kết kiểm tra tiêu chuẩn vô trùng vắc-xin Môi trường đánh giá Thạch XLD PPLO (pleuro pneumonialike organism Kết luận Âm tính Âm tính Âm tính Đạt Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Đạt Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Đạt Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính Lơ vắcxin Lần kiểm tra Nước thịt Thạch máu Thạch Saboroud Lơ Âm tính Âm tính Lơ Âm tính Lơ 3 Đối chứng 94 Hình 3.16 Kết kiểm tra độ vơ trùng vắc-xin Kiểm tra sau nuôi cấy ngày nhiệt độ 370C môi trường là: canh thịt, thạch máu môi trường XLD (Xyloza Lysin Deoxycholat) PPLO (pleuro pneumonia-like organism 14 ngày nhiệt độ 250C môi trường thạch nấm Kết cho thấy lô vắc-xin cấy vào môi trường kiểm tra không phát vi sinh vật phát triển môi trường đánh giá 3.3.3 Đánh giá mức độ an toàn vắc-xin Đánh giá mức độ an toàn vắc-xin nhằm đảm bảo vắc-xin đưa vào sử dụng không gây bệnh không gây hại cho động vật sử dụng Thực đánh giá tính an tồn vắc-xin bất hoạt miêu tả phần phương pháp Kết thể Bảng 3.21 95 Bảng 3.21 Xác định mức độ an toàn vắc-xin STT Loại vắc-xin Tỷ lệ chết (%) Tỷ lệ sống (%) NNV TB05 + AH 97 NNV TB05 + AP 98 Đối chứng âm (không sử dụng vắc-xin chất bổ trợ) 98 Biểu lâm sàng Hai ngày đầu sau xử lý vắcxin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày biểu bình thường Tăng trưởng cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Hai ngày đầu sau xử lý vắcxin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày biểu bình thường Tăng trưởng cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Các hoạt động sinh lý biểu lâm sàng bình thường Nhìn chung, lơ cá sử dụng vắc-xin có chất bổ trợ có biểu giảm ăn, phản xạ bơi lội hai ngày đầu xử lý vắc-xin Tuy nhiên ngày sau đó, hoạt động sinh lý cá trở lại bình thường Kết chứng tỏ, vắc-xin an tồn cá thí nghiệm Vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh lây nhiễm cho cá qua tế bào biểu mô đường tiêu hóa, qua sợi trục thần kinh bề mặt da hệ thống tuần hoàn máu Ở ấu trùng nhiễm bệnh tự nhiên, vi rút phát tế bào biểu mô da, biểu mô ruột tế bào thần kinh hệ thần kinh trung ương giai đoạn đầu trình lây nhiễm Tổn thương vi rút hoại tử thần kinh ban đầu thường cột sống, sau tổn thương đến não võng mạc [124] Trong mô não mắt, tế bào bị hoại tử để lại không bào, thay đổi bệnh lý sử dụng làm số cho thấy cá mú bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh [211] Nghiên cứu Roberts (2008) cho biết, số quan lympho cá bị nhiễm vi rút hoại tử thần kinh xuất trung tâm đại thực bào sắc tố 96 (melanomacrophage-MMC), xuất gia tăng MMC dấu hiệu cho thấy phản ứng bảo vệ thể vật chất lạ cá Với phân tích trên, nghiên cứu này, thực kiểm tra biến đổi vi thể mô não võng mạc cá sử dụng vắc-xin cá gây nhiễm với chủng NNV TB05 Kết thu sau: cá gây nhiễm với chủng NNV TB05 có xuất khơng bào trung tâm đại thực bào sắc tố não võng mạc (Hình 3.17 B, D), cá tiêm vắc-xin khơng xuất tổn thương (Hình 3.17 A, C) Hình 3.17 Mô não võng mạc cá nhuộm hematoxylin eosin A: Mô não cá sử dụng vắc-xin 21 ngày, B: Mô não cá gây nhiễm với chủng NNV TB05, C: Mô võng mạc xá sử dụng vắc-xin 21 ngày, D: Mô võng mạc cá gây nhiễm với chủng NNV TB05 97 Các nghiên cứu trước báo cáo rằng, cá nhiễm bệnh hoại tử thần kinh, vi rút hoại tử thần kinh phát mang, ruột, dày, lách, gan, thận, môn vị, xương, tế bào máu vây, đặc điểm bệnh lý đặc trưng vi rút hoại tử thần kinh gây cá hình thành khơng bào não võng mạc [29,154] Trong nghiên cứu tại, theo kết kiểm tra mô học não, mắt cá, nhận thấy NNV TB05 phá hủy nghiêm trọng não mắt cá với khơng bào hình thành dày đặc mơ kiểm tra, đặc điểm bệnh tích phù hợp với đặc điểm bệnh lý vi rút hoại tử thần kinh báo cáo Trong đó, cá gây miễn dịch với vắc-xin sử dụng chủng NNV TB05 bất hoạt khơng gây bệnh tích mô não mắt Kết nghiên cứu khẳng định, vắc-xin bất hoạt keo phèn chúng tơi nghiên cứu chế tạo hồn tồn an tồn với cá thí nghiệm 3.3.4 Đánh giá độ dài miễn dịch vắc-xin bán thành phẩm Trong nghiên cứu này, vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú sản xuất dạng keo phèn, hấp phụ nhôm hydroxit Cá sử dụng vắc-xin theo dõi tháng, định kỳ hàng tháng kiểm tra tế bào có chức miễn dịch, đồng thời tách riêng 20 cá sử dụng vắc-xin để thử thách cường độc với chủng NNV HP02, liều 1xTCID50 để đánh giá khả bảo hộ vắc-xin cá thí nghiệm thơng qua tỷ lệ cá bảo hộ sau thử thách cường độc Các tế bào có chức miễn dịch cá sản sinh từ mô lympho trung ương thận, tuyến ức, lách mô lympho niêm mạc ruột, chúng bao gồm tế hồng cầu, bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho, tế bào mast tế bào huyết khối [47, 68, 147] Quá trình tạo máu kiểm sốt cytokine hoạt động thụ thể tế bào đa năng, việc đánh giá thơng số huyết học có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu 98 tình trạng thể chất tình trạng nhiễm bệnh cá [84] Nhìn chung, tế bào bạch cầu cá đóng vai trò quan trọng việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch bẩm sinh, với chức thực bào, chúng có khả tiêu diệt tác nhân bệnh hiệu [47] Trong số tế bào có chức miễn dịch cá, tế bào tiểu cầu có khả thực bào bên cạnh chức đông máu [206]; bạch cầu đơn nhân có chức thực bào gây độc khơng đặc hiệu [53]; bạch cầu trung tính tìm thấy máu, mơ lympho khoang phúc mạc thực bào phần tử tế bào lạ tạo anion superoxide hợp chất diệt khuẩn; bạch cầu toan phân bố mô liên kết, đặc biệt đường tiêu hóa, mang hệ tuần hồn, chúng có vai trò quan trọng đáp ứng miễn dịch với ký sinh trùng; tế bào bạch cầu hạt đặc biệt tế bào bạch cầu đa nhân tìm thấy máu cá bị nhiễm ký sinh trùng chức xác chúng chưa biết rõ Trong nghiên cứu này, để đánh giá hiệu vắc-xin việc kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu, theo dõi tiêu; số lượng hồng cầu tổng số, bạch cầu tổng số, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, tiểu cầu Kết theo dõi trình bày Bảng 3.22 Bảng 3.22 Kết theo dõi tế bào có chức miễn dịch cá thử nghiệm vắc-xin Bố trí thí nghiệm Chỉ tiêu theo dõi Tháng thứ Tháng thứ Tháng thứ Số lượng hồng cầu (x103 tế 2.639,00 2.598,40 2.208,64 bào/mL máu) Lô thử Tổng số bạch nghiệm cầu (x103 tế 118,16 116,98 95,92 vắc-xin bào/mL máu) Lympho (x103 82,48 78,36 75,22 tế bào/mL máu) Tháng thứ Tháng thứ 2.186,55 2.142,82 92,08 91,16 74,47 72,24 99 Lơ đối chứng Bạch cầu trung tính (x103 tế 2,82 2,54 2,36 bào/mL máu) Bạch cầu đơn nhân (x103 tế 3,35 3,22 2,96 bào/mL máu) Tiểu cầu (x103 21,19 19,07 17,16 tế bào/mL máu) Số lượng hồng cầu/mL máu 2.030,00 2.036,09 2.038,13 (x103 tế bào/mL máu) Tổng số bạch cầu/mL máu 90,89 90,80 90,62 (x10 tế bào/mL máu) Lympho (x103 71,72 71,58 71,65 tế bào/mL máu) Bạch cầu trung tính (x103 tế 2,31 2,32 2,32 bào/mL máu) Bạch cầu đơn nhân (x103 tế 2,68 2,69 2,68 bào/mL máu) Tiểu cầu (x103 16,05 16,19 16,21 tế bào/mL máu) 2,29 2,27 2,84 2,78 16,65 16,31 2.038,11 2.036,07 90,67 90,80 71,65 71,60 2,32 2,32 2,68 2,69 16,22 16,19 Số liệu Bảng 3.22 cho thấy, số công thức máu lô cá sử dụng vắc-xin cao đáng kể so với lô đối chứng suốt tháng theo dõi, kết chứng tỏ, vắc-xin kích thích quan tạo máu sản sinh, biệt hóa tế bào có chức miễn dịch Theo Hibiya cộng sự, 1982, mô máu cá dễ bị tổn thương mầm bệnh yếu tố stress môi trường, trường hợp cá bị bệnh, đặc biệt bệnh gây biến đổi chức thận làm giảm mạnh bạch cầu đại thực bào lympho Theo nghiên cứu Ranzani cộng sự, 2004, số lượng tiểu cầu giảm nhanh có xuất vi khuẩn tổ chức Sự biến động tế bào có chức miễn 100 dịch cá, có ảnh hưởng đáng kể đến tình trạng sức khỏe cá, thay đổi theo xu hướng tăng lên thông số biểu thị tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc cá tác nhân nhiễm trùng Cùng với nghiên cứu làm rõ khả tăng cường đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu cá sử dụng vắc-xin, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu đánh giá thơng qua khả hình thành kháng thể bảo hộ, kết trình bày Hình 3.18; Phụ lục Hình 3.18 Tỷ lệ sống cá lô thử nghiệm vắc-xin Tỷ lệ sống sót so sánh nhóm sử dụng thử nghiệm Dấu hoa thị biểu khác biệt thống kê nhóm thời điểm theo thử nghiệm Dấu hoa thị cho biết khác biệt có ý nghĩa: (** p ≤ 0,01 *** p ≤ 0,001) Sau tháng theo dõi, lô đối chứng âm sử dụng giả dược dung dịch nhôm hydroxit khơng có kháng ngun bất hoạt có tỷ lệ sống đạt 70,9% Ở lô đối chứng dương, với liều gây nhiễm từ 1xTCID50 chủng dại NNV TB05 101 2-3 tháng đầu, tỷ lệ cá chết gây nhiễm chủng dại NNV TB05 tương ứng 96,3% 95,8%, từ tháng 4-6 tỷ lệ sống tương đối cá tăng lên tương ứng 9,7%, 14,2% 21,9% Đối với lô cá sử dụng vắc-xin, tỷ lệ sống tương đối cá sau thử thách cường độc với chủng NNV HP02 giảm dần theo tháng, cụ thể, tháng thứ tỷ lệ sống tương đối đạt 79,3%, tháng thứ đạt 75,8%, tháng thứ đạt 63,1%, tháng thứ đạt 51,1%, tháng thứ đạt 41,6% Kết thí nghiệm chứng tỏ vắc-xin kích thích tạo kháng thể bảo hộ cá thí nghiệm, nhiên, lượng kháng thể giảm dần qua thời gian theo dõi Trong thực tế, cá mú nuôi thương phẩm thường thu hoạch từ tháng thứ 5-7, cá đạt khối lượng khoảng 0,5kg, lý thực nghiên cứu xác định độ dài miễn dịch vắc-xin vòng tháng Theo Bovo cộng sự, 2008, Betanodavirus gây bệnh cho nhiều loài cá khác nhau, bao gồm loài cá nước mặn cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus), cá bớp (Rachycentron canadum), cá vược (Dicentrachus labrax), cá chẽm (Lates calcarifer), cá tráp (Sparus aurata), cá ngừ vây xanh Thái Bình Dương (Thunnus directionalis), loài cá mú khác (Họ Serranidae), nhiều loài cá dẹt khác nhau, bao gồm cá bơn (Hippoglossus hippoglossus) cá bơn Nhật Bản (Paralichthys oliveatus) Đối với cá nước ngọt, NNV gây bệnh cá rô phi (Oreochromis niloticus) [30] cá bảy màu (Poecilia reticulata) [90] Trên đối tượng cá khác nhau, NNV gây phá hủy hệ thần kinh trung ương ảnh hưởng nghiêm trọng đến giai đoạn cá non (ấu trùng, cá bột, cá giống), tỷ lệ thất thoát dao động từ 15–100%, cá lớn bị ảnh hưởng vi rút Kết Hình 3.18 cho thấy, giai đoạn tháng tuổi, tỷ lệ chết sau gây nhiễm với chủng NNV HP02 giảm đáng kể so với tháng thứ 4, điều chứng tỏ, giai đoạn trưởng thành, mức độ mẫn cảm cá với vi rút giảm Theo quy định Thông tư số 10/2018/TT- 102 BNNPTNT ngày 14 tháng năm 2018 việc ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia thuốc thú y - yêu cầu chung, yêu cầu vắc-xin thủy sản 60% mẫu huyết lô động vật thủy sản dùng vắc-xin có hiệu giá kháng thể đạt ngưỡng bảo hộ 80% mẫu huyết lô động vật thủy sản khơng dùng vắc-xin âm tính, vậy, kết thể Hình 3.18 cho thấy, sau tháng thứ 3, tỷ lệ bảo hộ vắc-xin cá mú 75,8%, tháng thứ 63,1%, tháng thứ 51,1%, kết cho thấy, để vắc-xin có hiệu theo quy định, cần thực tiêm nhắc lại sau tháng thứ 103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN - Lựa chọn chủng vi rút TB05 làm chủng giống gốc đạt tiêu chí sản xuất vắc-xin như: độc lực cao tế bào (106,8 TCID50/mL) cá (107,5 LD50/mL), chủng giống gốc độ khiết 100%, an toàn 100% ổn định nhân nuôi tế bào ổn định mặt di truyền sau 10 đời cấy chuyển - Đã nghiên cứu thành công vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú với đầy đủ thông số tối ưu như: +) Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tế bào (môi trường L-15 + 10% FBS, pH 7,0-7,4); +) Điều kiện gây nhiễm vi rút vào tế bào GS01 với liều gây nhiễm MOI 0,01 cho hiệu giá vi rút cao thời điểm ngày sau nhân ni; +) Hóa chất β-propiolactone nồng độ 0,1% lựa chọn để bất hoạt vi rút; +) Vắc-xin bán thành phẩm phối trộn với nhôm hydroxit với liều kháng nguyên tối thiểu 106TCID50/mL - Vắc-xin đạt tiêu chuẩn về: Tính ổn định, vơ trùng, an tồn 100% tỷ lệ bảo hộ đạt 75,8% cho cá sau tháng KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản vắc-xin đánh giá tính an tồn, hiệu lực bảo hộ vắc-xin thực địa sau thời gian bảo quản, tiến đến sản xuất quy mơ cơng nghiệp nhằm đưa vắc-xin vào phịng bệnh hoại tử thần kinh cá mú Việt Nam 104 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Mạnh Hùng (2018), “Phân lập xác định đặc tính vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh NNV (Nervous necrosis virus) cá mú (Epinephelus sp.) miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số 15, tr.87-93 Mẫn Hồng Phước, Phạm Thị Tâm, Đồng Văn Quyền, Vũ Thị Bích Huyền, Lê Minh Hải (2022), “Nghiên cứu tạo vắc-xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú (Epinephelus sp.) quy mơ phịng thí nghiệm”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, số 6, kỳ 2, tr 66-71 105 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh, Trương Hồng Việt, (2005), “Bệnh thường gặp cá mú nuôi Vũng Tàu”, Hội thảo quốc gia Phát triển thủy sản vùng hạ lưu sông Mekong, trang 529-534 Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Mạnh Thắng, (2008), “Vacxin phòng bệnh đốm trắng cá tra, triển vọng ứng dụng”, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Công ty NAVETCO 23/06/2008 Đỗ Thị Hoà, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, (2004), “Bệnh học thuỷ sản”, NXB Nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên, (2008), “Bệnh hoại tử thần kinh cá biển ni Khánh Hồ”, Đại học Nha Trang Võ Văn Quang, Trần Thị Lê Vân, Trần Quang Thịnh, (2013) , “Thành phần loài trạng khai thác cá mú giống vịnh Quy Nhơn, Bình Định”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Biển, tập 13, số 3, tr 241–247 Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Trần Thế Mưu, Nguyễn Quang Linh, Nguyễn Thị Thanh, (2015), “Nghiên cứu phương pháp phát vi rút gây bệnh sản xuất vắc –xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công nghiệp”, Báo cáo tổng kết đề tài KC 04.03/11- 15 Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành, Nguyễn Thị Biên Thùy, (2006), “Kết nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng (đốm trắng) cho cá tra ba sa”, Báo cáo tổng kết đề tài KC-06-20-NN, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I Vũ Dũng Tiến, Đỗ Ngọc Liên, Lại Văn Hùng, Ngô Văn Quang, (2003), “Kết ban đầu điều chế thử vắc-xin phòng bệnh đốm đỏ cá trắm cỏ Ctenopharyngodon idellus”, Tuyển tập báo cáo khoa học nuôi trồng thủy sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, trang 465 – 469 106 Nguyễn Thị Thanh Thùy, Nguyễn Hữu Dũng, Wergeland H.I., (2012), "Thành phần protein độc tính vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét cá mú chấm cam (Epinephelus coioides) ni thương phẩm Khánh Hịa", Tạp chí khoa học - Công nghệ thủy sản, 4/2012, tr 180-184 10 Lê Anh Tuấn, (2004), “Tình hình ni cá mú Việt Nam: trạng trở ngại mặt kỹ thuật”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thủy sản, trang 174–179 11 Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh, (2004), “Những dấu hiệu mô bệnh học VNN cá song chấm nâu Epinephelus coioides Hải Phòng Nghệ An”, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I 12 Phan Thị Vân, Nguyễn Thị Hường, Nguyễn Thị Hạnh, Võ Anh Tú, (2013), "Đánh giá kháng nguyên tác dụng nhũ dầu lên tính kháng nguyên vi khuẩn bất hoạt Vibrio alginolyticus, Vibrio paramaemolyticus, Vibrio haveyi cá Giò (Rachycentron canadum) ni Việt Nam", Tạp chí nơng nghiệp phát triển nông thôn, 13/2013, tr 153-158 Tài liệu tiếng anh 13 Adams A., (2019), “Progress, challenges and opportunities in fish vaccine development”, Fish & Shellfish Immunology, 90, pp 210-224 14 Adamek M., Matras M., Rebl A., Stachnik M., Falco A., Bauer J., (2022), “Don’t let it get under your skin vaccination protects the skin barrier of common carp from disruption caused by cyprinid herpesvirus 3”, Front Immunol, 13:787021 15 Afsharipour E., Zorriehzahra M.J., Takami G.A., Kakoolaki S., Motallebi A.A., Sharifpour I., (2021), “An investigation on protective effects of the new killed vaccine against nervous necrosis virus (NNV) using histopathology and immunohistochemistry approach on the brain and eye tissues of acipenser stellatus pallas 1771”, Fish & Shellfish Immunology, 116, pp 91–97 16 Aida V., Pliasas V.C., Neasham P.J., North J.F., Mcwhorter K.L., Glover S.R., Kyriakis, C.S, (2021), “Novel Vaccine Technologies in Veterinary 107 Medicine: A Herald to Human Medicine Vaccines”, Frontiers in Veterinary Science, 8, 654289 17 Akazawa N., Alvial A., Blanc P.P., Miguel Burgos J., W Chamberlain G., Forster J., Tung H., Ibarra R., Khoa L.V., Kibenge F., V Lightner D., Hao N.V., Lussian Nikuli H., Omar I., Ralaimarindaza L., Bondad-Reantaso M., St-Hilaire S., Dick Towner R., Loc T.H., Villarreal M., (2016), Reducing disease risk in aquaculture Word bank Report number 88257-GLB, 119 pp 18 Aksnes I., Braaen S., Markussen T., Akesson C.P., Villoing S., Rimstad E., (2021), “Genetically modified attenuated salmonid alphavirus: A potential strategy for immunization of Atlantic salmon”, Journal of Fish Diseases, 44, pp 923–937 19 Aly S.M., Eissa A.E., ElBanna N.I., Albutti A., (2021), “Efficiency of monovalent and polyvalent Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus vaccines on the immune response and protection in gilthead sea bream, Sparus aurata (L.) against vibriosis”, Fish & Shellfish Immunology, 111, pp 145–151 20 Angsujinda K., Timothy J.M,, Duncan R.S., Jes K., Wanchai A., (2020), “Expression profile of selected genes of the E-11 cell line in response to redspotted grouper nervous necrosis virus infection”, Aquaculture Reports, Volume 18, 100468 21 Athanassopoulou F., Billinis C., Prapas T., (2004), “Important disease conditions of newly cultured species in intensive freshwater farms in Greece: First incidence of Nodavirus infection in Acipenser sp”, Diseases of Aquatic Organisms, 60, pp 247-252 22 Arimoto M., Mori K., Nakai T., Muroga K., Furusawa I., (1993), “Pathogenicity of the causitive agent of viral nervous necrosis disease in striped jack, Pseudocaranx dentex”, Journal of Fish Diseases, 16, pp 461–469 23 Arimoto M., Sato J., Maruya K., Mimura G., Furusawa I., (1996), “Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJVNN)”, Aquaculture, 143, pp 15–22 108 24 Assefa A., Abunna F., (2018), “Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish”, Vet Med Int, 2018, pp 1-10 25 Awadasseid A., Wu Y., Tanaka Y., Zhang W., (2021),” Current advances in the development of SARS-CoV-2 vaccines”, Int J Biol Sci, 17, pp 8–19 26 Azad I., Shekhar M., Thirunavukkarasu A., Poornima M., Kailasam M., Rajan J., (2005), “Nodavirus infection causes mortalities in hatchery produced larvae of Lates calcarifer”, First report from India Diseases of Aquatic Organisms, 63, pp 113–118 27 Bahnemann H.G., (1990), “Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine”, Vaccine, 8(4), pp 299-303 28 Bairoch A., (2018), “The Cellosaurus, a Cell-Line Knowledge Resource”, J Biomol Tech, 29(2), pp 25-38 29 Bandín I., Souto S., (2020), “Betanodavirus and VER Disease: A 30-year Research Review”, Pathogens, 9, 106 30 Bigarré L., Cabon J., Baud M., Heimann M., Body A., Lieffrig F., (2009), “Outbreak of Betanodavirus infection in tilapia, Oreochromis niloticus (L.), in fresh water”, JouARNl of Fish Diseases, 32, pp 667-673 31 Binesh C., (2013), “Mortality due to viral nervous necrosis in zebrafish Danio rerio and goldfish Carassius auratus”, Diseases of Aquatic Organisms, 104, pp 257-260 32 Bitchava K., Chassalevris T., Lampou E., Athanassopoulou F., Economou V., Dovas C.I (2019), “Occurrence and molecular characterization of Betanodavirus in fish and invertebrates of the Greek territorial waters”, Journal of Fish Diseases, 42, pp 1773–1783 33 Bly J.E., Clem L.W., (1992), “Temperature and teleost immune functions”, Fish & Shellfish Immunology, 2, pp 159–171 34 Bols Niels C., Phuc H Pham, Dayeh Vivian R., Lee Lucy E.J., (2017), “Invitromatics, invitrome, and invitroomics: introduction of three new terms 109 for in vitro biology and illustration of their use with the cell lines from rainbow trout”, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 53(5), pp 383-405 35 Boltaña S., Rohera N., Goetz F.W and Mackenzie S.A., (2011), “PAMPs, PRRs and the genomics of gram negative bacterial recognition in fish”, Dev Comp Immunol, 35, pp 1195-1203 36 Boudarkov V.A., Sereda A.D., Carpov O.N., Ponomarev V.N., (2016), “Using gamma rays to inactivate African swine fever virus”, Russ Agric Sci, 42, pp 375–7 37 Boukedjouta R., Pretto, T., Abbadi M., Biasini L., Toffan A., Mezali K., (2020), “Viral encephalopathy and retinopathy is endemic in wild groupers (genus Epinephelus spp.) of the Algerian coast”, Journal of Fish Diseases, 43, pp 801–812 38 Bullock L.H and Smith G.B., (1991), “Seabasses (Pisces: Serranidae)”, Memoirs of the Hourglass Cruises 8(2): 1-243 39 Breuil G., Pepin JF., Castric J., Fauvel C., Thiery R., (2000), “Detection of serum antibodies against Nodavirus in wind and farmed adult sea bass: application to the screening of brood stock in sea bass hatcheries”, Bull Eur: Assoc Fish Pathol, 20, pp 95–100 40 Brian M., Hillar K., (1996), “Virology Methods Manual 1st Edition”, Academic Press, page 374 41 Brown F., (1995), “Vaccination today and tomorrow”, Biosci Rep, 15(6), pp 493-502 42 Brudeseth B.E., Wiulsrød R., Fredriksen B.N., Lindmo K., Løkling K.E., Bordevik M., Steine N., Klevan A., Gravningen K.,(2013), “Status and future perspectives of vaccines for industrialized fin-fish farming”, Fish & Shellfish Immunology, Volume 35, Issue 6, Pages 1759-1768 43 Cascarano M.C., Stavrakidis-Zachou O., Mladineo I., Thompson K.D., Papandroulakis N., Katharios P., (2021), “Mediterranean Aquaculture in a 110 Changing Climate: Temperature Effects on Pathogens and Diseases of Three Farmed Fish Species”, Pathogens, 10, pp 1205 44 Chauvet C., (1988), “Etude de la croissance du me´rou Epinephelus guaza des coˇtes tunisiennes”, Aquat Living Resour, 1, pp 277–288 45 Chaves-Pozo E., Bandín I., Olveira J.G., Esteve-Codina A., Gómez-Garrido J., Dabad M., Alioto T., Ángeles Esteban M., Cuesta A., (2019), “European sea bass brain DLB-1 cell line is susceptible to Nodavirus: A transcriptomic study”, Fish & Shellfish Immunology, 86, pp 14–24 46 Chen J., Xiao L., Peng C., Ye Z., Wang D., Yang Y., Zhang H., Zhao M., Li S., Lin H., Zhang Y., (2019), “Socially controlled male-to-female sex reversal in the protogynous orange-spotted grouper, Epinephelus coioides”, Journal of Fish Biology, 94 (3), pp 414-421 47 Chettri J.K., Raida M.K., Andersen L.H., Kania P.W and Buchmann K., (2011), “PAMP induced expression of immune relevant genes in head kidney leukocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Dev Comp Immunol, 35, pp 476-482 48 Cherif N., Fatma A., (2017), “Nodavirus in wild fish population collected around aquaculture cage sites from coastal areas of Tunisia”, Fish Aquac J., 8, pp 2–7 49 Chinabut S., Limsuwan C., Kitsawat P., (1991), “Histology of the Walking Catfish Clarias Batrachus) 96pp 50 Chukwu-Osazuwa J., Cao T., Vasquez I., Gnanagobal H., Hossain A., Machimbirike V.I., (2022), “Comparative reverse vaccinology of piscirickettsia salmonis, aeromonas salmonicida, yersinia ruckeri, Vibrio anguillarum and moritella viscosa, frequent pathogens of Atlantic salmon and lumpfish aquaculture”, Vaccines, 10:473 51 Colin P.L., (1992), “Reproduction of the Nassau grouper, Epinephelus striatus (Pisces: Serranidae) with relationship to environmental conditions”, Env Biol Fish, 34, pp 357-377 111 52 Costa J.Z., Thompson K.D (2016), “Understanding the interaction between Betanodavirus and its host for the development of prophylactic measures for viral encephalopathy and retinopathy”, Fish Shellfish Immunol, 53, pp 35–49 53 Cuesta A., Angeles Esteban M., Meseguer J., (1999), “Natural cytotoxic activity of gilthead seabream (Sparus aurata L.) leucocytes assessment by flow cytometry and microscopy”, Vet Immunology Immunopath 71: pp 161-171 54 Cuesta A., Vargas-Chacoff L., García-López A., Arjona F.J., MartínezRodríguez G., Meseguer J., Mancera J.M., Esteban M.A., (2007), “Effect of sex-steroid hormones, testosterone and estradiol, on humoral immune parameters of gilthead seabream”, Fish & Shellfish Immunology, 23, pp 693–700 55 Curtis P., Drawbridge M., Iwamoto T., Nakai T., Hedrick R., Gendron A (2001), “Nodavirus infection of juvenile white seabass, Atractoscion nobilis, cultured in southern California: First record of viral nervous necrosis (VNN) in North America”, JouARNl of Fish Diseases, 24, pp 263-271 56 Cutrín J.M., Dopazo C.P., Thiéry R., Leao P., Olveira J.G., Barja J.L., Bandín I (2007), “Emergence of pathogenic Betanodaviruses belonging to the SJNNV genogroup in farmed fish species from the Iberian Peninsula”, Journal of Fish Diseases, 30, pp 225–232 57 Dadar M., Dhama K., Vakharia V.N., Hoseinifar S.H., Karthik K., Tiwari R., (2017), “Advances in aquaculture vaccines against fish pathogens: global status and current trends”, Rev Fish Sci Aquac, 25, pp 184–217 58 Dalla Valle L., Toffolo V., Lamprecht M., Maltese C., Bovo G., Belvedere P., (2005), “Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR”, Veterinary Microbiology, 110, pp 167–179 59 Dalmo R.A., (2019), “DNA Vaccines for fish: Review and perspectives on correlates of protection”, Journal of Fish Diseases, 41, pp 1–9 112 60 Desmettre P., Martinod S., Pastoret P.P., Blancou J., Vannier P., Verschueren C., (2015), “Research and development In Veterinary Vaccinology Eds”, Elsevier Press: Amsterdam, the Netherlands, 1997; pp 175–194 61 Dhar A.K., Manna S.K., Thomas Allnutt F.C., (2014), “Viral vaccines for farmed finfish”, Virus disease, 25, pp 1–17 62 Doan Q.K., Vandeputte M., Chatain B., Morin T., Allal F., (2017), “Viral encephalopathy in aquaculture: a review”, Journal of Fish Diseases; 40 (5): p.717–742 63 Dorson M., Castric J., Torchy C., (1978), “Infectious pancreatic necrosis virus of salmonids: biological and antigenic features of a pathogenic strain and of a non-pathogenic variant selected in RTG-2 cells”, Jounal of Fish Diseases, Volume 1, Issue 4, pp 309-320 64 Duff D.C.B., (1942), “The oral immunization of trout against Bacterium salmonicida”, J Immunol 44, pp 87-94 65 Elward K., Gasque P., (2003), ““Eat me” and “don't eat me” signals govern the innate immune response and tissue repair in the CNS: emphasis on the critical role of the complement system”, Molecular Immunology, 40, pp 85-94 66 Embregts C.W.E., Forlenza M., (2016), “Oral vaccination of fish: lessons from humans and veterinary species”, Dev Comp Immunol, 64, pp 118–137 67 Evans Joyce J., Klesius Phillip H., Shoemaker Craig A., (2004), “Efficacy of Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus) by intraperitoneal and bath immersion administration”, Vaccines, Volume 22, Issues 27–28, pp 3769-3773 68 Evans T., (1997), “Developmental biology of hematopoiesis”, Hematol Oncol Clinic North Am, 11, pp 1115-1147 69 Fan C., Ye X., Ku Z., Kong L., Liu Q., Xu C., Cong Y., Huang Z., (2017), “Beta-Propiolactone Inactivation of Coxsackievirus A16 Induces Structural Alteration and Surface Modification of Viral Capsids”, J Virol, 91, pp 8-17 113 70 Fernández Sánchez J.L., Le Breton A., Brun E., Vendramin N., Spiliopoulos G., Furones D., Basurco B., (2022), “Assessing the economic impact of diseases in Mediterranean grow-out farms culturing European seabass”, Aquaculture, 547, 737530 71 Figueroa C., Torrealba D., Morales-Lange B., Mercado L., Dixon B., Conejeros P., (2022), “Commercial vaccines not confer protection against two genogroups of piscirickettsia salmonis, LF-89 and EM-90, in Atlantic salmon”, Biology-Basal, 11:993 72 Fletcher T.C., (1986), “Modulation of nonspecific host defenses in fish”, Vet Immunol Immunopathol, 12, pp 59–67 73 Froese R., Pauly D., (2022), FishBase Epinephelus Bloch, 1793 Accessed through: World Register of Marine Species at: https://www.marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=126068 on 2022-12-05 74 Froese R., Pauly D., (2019), "Species in Epinephelus", FishBase 75 Frerichs G.N., Tweedie A., Starkey W.G., Richards R.H., (2000), “Temperature, pH and electrolyte sensitivity, and heat, UV and disinfection inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy vi rút”, Aquaculture, 185, pp.13–24 76 Ghiasi M., Binaii M., Ghasemi M., Fazli H., Zorriehzahra M J , (2016), “Haemato-biochemical disorders associated with Nodavirus like-agent in adult leaping mullet Liza saliens (Risso, 1810) in the Caspian Sea”, Virusdisease, 27(1), pp 12-18 77 Glenny A.T., Pope C.G., Waddington H., Wallace U., (1926), “Immunological notes XVI1.−XXIV”, J Pathol Bacteriol, 29, pp 31-40 78 Goldstein M.A., Tauraso N.M., (1970), “Effect of formalin, betapropiolactone, merthiolate, and ultraviolet light upon influenza virus infectivity chicken cell agglutination, hemagglutination, and antigenicity”, Appl Microbiol, 19, pp 290–294 79 Gudding R., Lillehaug A., Evensen Ø., (1999), “Recent developments in fish vaccinology”, Veterinary Immunology and Immunopathology, Volume 72, Issues 1–2, pp 203-212 114 80 Gupta D., Parthasarathy H., Sah V., Tandel D., Vedagiri D., Reddy S., Harshan K.H., (2021), “Inactivation of SARS-CoV-2 by β-propiolactone causes aggregation of viral particles and loss of antigenic potential”, Virus Res, 305, 198555 81 Grisez L., Tan Z., (2007), “Vaccine development for Asian aquaculture”, The Fish Site, Intervet Norbio Singapore Pte Ltd 82 Grotmol S., Nerland A H., Biering E., Totland G K., Nishizawa T., (2000), “Characterisation of the capsid protein gene from a Nodavirus strain affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an optimal reversetranscriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) detection assay”, Diseases of Aquatic Organisms, 39, pp 79–88 83 Gye H.J., Nishizawa T., (2018), “Reducing background optical density in enzyme-linked immunosorbent assay for detecting nervous necrosis virus (NNV)-specific IgM by immobilizing fish sera”, Aquaculture, 485, pp 93–100 84 Hanington P.C., Tamb J., Katzenback B.A., Hitchen S.J., Barreda D.R., Belosevic M., (2009), “Development of macrophages of cyprinid fish”, Dev Comp Immunol, 33: pp 411-429 85 Hanif A., Bakopoulos V., Dimitriadis G.J., (2004), “Maternal transfer of humoral specific and non-specific immune parameters to sea bream (Sparus aurata) larvae”, Fish & Shellfish Immunology, 17, pp 411–435 86 Hanif A., Bakopoulos V., Leonardos I., Dimitriadis G.J., (2005), “The effect of sea bream (Sparus aurata) broodstock and larval vaccination on the susceptibility by Photobacterium damsela subsp piscicida and on the humoral immune parameters”, Fish & Shellfish Immunology, 19, pp 345–361 87 Hayward C.J., Bott N.J., Nowak B.F., (2009), “Seasonal epizootics of sea lice, Caligus spp., on southern bluefin tuna, Thunnus maccoyii (Castelnau), in a long-term farming trial”, Journal of Fish Diseases, 32, pp 101–106 88 Hazreen-Nita M., Azila A., Mukai Y., Firdaus-Nawi M., Nur-Nazifah M., (2019), “A Review of Betanodavirus Vaccination as Preventive Strategy to Viral Nervous Necrosis (VNN) Disease in Grouper”, Aquacult Int, 27, pp 1565–1577 115 89 Heemstra P.C., Randall J.E., (1993), “Groupers of the world (Family Serranidae, Subfamily Epinephelinae) An annoted and illustrated catalogue of the grouper, rockcod, hind, coral grouper and lyretail species known to date”, FAO Species Catalogue, FAO Fisheries Synopsis no 125, Rome 90 Hegde A., (2003), “Characterization and immunological studies of fish nervous necrosis virus”, A thesis submitted for the degree of doctor of philosophy department of Biological sciences National University of Singapore 91 Herrera-Rodriguez J., Signorazzi A., Holtrop M., de Vries-Idema J., Huckriede A., (2019), “Inactivated or damaged? Comparing the effect of inactivation methods on influenza virions to optimize vaccine production”, Vaccine, 37, pp 1630–1637 92 Hoare R., Hovland H., Langston A.L., Imsland A., Stefansson S.O., Mulcahy M., Wergeland H.I., (2002), “Susceptibility of three different strains of juvenile Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) cultured at two different temperatures to Vibrio anguillarum and temperature effect on antibody response”, Fish & Shellfish Immunology, 13, pp 111–123 93 Hogen E.H., Derek T.O., Christopher B.F., (2018), “Optimizing the utilization of aluminum adjuvants in vaccines: you might just get what you want”, Vaccines, 3:51 94 Holland M.C.H., Lambris J.D (2002), “The complement system in teleosts”, Fish & Shellfish Immunology, 12, pp 399-420 95 Hølvold L.B., Myhr A.I., Dalmo R.A., (2014), “Strategies and hurdles using ADN vaccines to fish”, Vet Res, 45, pp 1–11 96 Hou Y.Y., Suzuki Y., Aida K., (1999), “Effects of steroid hormones on immunoglobulin M (IgM) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss”, Fish Physiol Biochem, 20, pp 155–162 97 Huang S.M., Cheng J.H., Tu C., Chen T.I., Lin C.T., Chang S.K., (2017), “A bivalent inactivated vaccine of viral nervous necrosis virus and grouper Iridovirus applied to grouper broodfish (Epinephelus coioides) reduces the risk of vertical transmission”, Taiwan Vet J, 43(03), pp 171–176 116 98 Hussain I., Price G.W., Farid A.H., (2014), “Inactivation of aleutian mink disease virus through high temperature exposure in vitro and under fieldbased composting conditions”, Vet Microbiol, 173, pp 50–58 99 Hrubec T.C., Jenifer L.C., Stephen A.S., (2000), “Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured tilapia (Oreochromis hybrid)”, Vet Clin Pathol, 29(1), pp 7-12 100 Ito Y., Okinaka Y., Mori K.I., Sugaya T., Nishioka T., Oka M., Nakai T., (2008), “Variable region of Betanodavirus RNA2 is sufficient to determine host specificity”, Diseases of Aquatic Organisms, 79, pp 199-205 101 Iwamoto T., Nakai T., Mori K., Arimoto M., Furusawa I., (2000), “Cloning of fish cell line SSN-1 for piscine Nodavirus”, Dis Aquat Org, 43, pp 81–89 102 Jeong Y.U., Subramanian D., Jang Y.H., Kim D.H., Park S.H., Park K., (2016), “Protective efficiency of an inactivated vaccine against Streptococcus iniae in olive flounder paralichthys olivaceus”, Arch Polish Fish, 24, pp 23–32 103 Jeong K.H., Kim H.J., (2020), “Current status and future directions of fish vaccines employing virus-like particles”, Fish & Shellfish Immunology, 100, pp 49–57 104 Jiao X., Shuang C., Yong-hua H., Li S., (2010), “Comparative study of the effects of aluminum adjuvants and Freund's incomplete adjuvant on the immune response to an Edwardsiella tarda major antigen”, Vaccine, Volume 28, Issue 7, pp 1832-1837 105 Johannes R.E., (1978), “Reproductive strategies of coastal marine fishes in the tropics”, Env Biol Fish, 3, pp 741-760 106 Johnson S.C., Sperker S.A., Leggiadro C.T., Groman D.B., Griffiths S.G., Ritchie R.J., Cook M.D., Cusack R.R., (2002), “Identification and characterization of a piscine neuropathy and Nodavirus from juvenile Atlantic cod from the Atlantic coast of North America”, J Aquat Anim Health, 14, pp 124–133 107 Johnstone C., Pérez M., Arizcun M., García-Ruíz C., Ciércoles C., ChavesPozo E., (2021), “Detection of Red-spotted grouper nervous necrosis virus 117 (RGNNV) in shrimp and squid of the Mediterranean Sea”, In Proceedings of the 20th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish, Virtual, 20–23 September 2021; European Association of Fish Pathologist: Aberdeen, Scotland, 2021 108 Jones R.S., Gutherz E.J., Nelson W.R., Matlock C., (1989), “Burrow utilization by yellowedge grouper, Epinephelus flavolimbatus, in the northwestern Gulf of Mexico”, Enviromental Biology of Fishes, 26, pp 277-284 109 Jose Priya T.A., Kappalli S., (2022), “Modern biotechnological strategies for vaccine development in aquaculture - prospects and challenges”, Vaccine, 40, pp 5873–5881 110 Jurado M., García-Valtanen P., Estepa A., Perez L., (2013), “Antiviral activity produced by an IPNV-carrier EPC cell culture confers resistance to VHSV infection”, Vet Microbiol, 166, pp 412–418 111 Kai Y.H., Chi S.C., (2008), “Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioides) by bath immunization”, Vaccine, 26, pp 1450 – 1457 112 Kai Y.H., Wu Y.C., Chi S.C., (2014), “Immune gene expressions in grouper larvae (Epinephelus coioides) induced by bath and oral vaccinations with inactivated Betanodavirus”, Fish & Shellfish Immunology, 40, pp 563–569 113 Kanemaru T., Nakamura M., Murata R , Kuroki K., Horie H., Uchida K., Senthilkumaran B., Kagawa H., (2012), “Induction of sexual maturation of the female honeycomb grouper, Epinephelus merra, in the non-breeding season by modulating environmental factors with GnRH analogue implantation”, Aquaculture, 358, pp 85-91 114 Kara H.M., Chaoui L., Derbal F., Zaidi R., de Boisséson C., Baud M., Bigarré L., (2014), “Betanodavirus associated mortalities of adult wild groupers Epinephelus marginatus (Lowe) and Epinephelus costae (Steindachner) in Algeria”, Journal of Fish Diseases, 37, pp 273–278 115 Kim J.O., Kim W.S., Oh M.J., (2015), “Development of a Recombinant Protein Vaccine Based on Cell-Free Protein Synthesis for Sevenband 118 Grouper (Epinephelus septemfasciatus) Against Viral Nervous Necrosis”, J Microbiol Biotechnol, 25(10), pp 1761–1767 116 Kim J.O., Sih K.W., Cho J.K., Kim K.M., Son M.H., Oh M.J., (2014), “Complete genome sequence of nervous necrosis virus isolated from sevenband grouper (Epinephelus septemfasciatus) in South Korea”, 2(6) 117 Kim Y.C., Kwon W.J., Min J.G., Kim K., Jeong H., (2019), “Complete genome sequence and pathogenic analysis of a new Betanodavirus isolated from shellfish”, Journal of Fish Diseases, 42(4), pp 1–13 118 Kim M.S., Park J.S., Kim K.H., (2015), “Generation of G gene-deleted viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) and evaluation of its vaccine potential in olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Fish & Shellfish Immunology, 45, pp 666–671 119 Klafack S., Schroeder L., Jin Y., Lenk M., Lee P.Y., Fuchs W., (2022), “Development of an attenuated vaccine against koi herpesvirus disease (KHVD) suitable for oral administration and immersion”, NPJ Vaccines, 7:106 120 Klosterhoff M.C., Pereira Junior J., Rodrigues R.V., (2015), “Ontogenic development of kidney, thymus and spleen and phenotypic expression of CD3 and CD4 receptors on the lymphocytes of cobia (Rachycentron canadum)”, Anais da Academia Brasileira de Ciências, 87, pp 2111–2121 121 Klesius P.H., (1990), “Effect of size and temperature on the quantity of immunoglobulin in channel catfish Ictalurus punctatus”, Vet Immunol Immunopathol, 24, pp 187–195 122 Kobayashi Y., (2022), “Control of gonadal maturation and sex in grouper”, Aquaculture and Fisheries, Volume 7, Issue 5, pp 519-524 123 Kole S., Shin SM., Kwak I.S., Cho S.H., Jung S.J., (2022), “Efficacy of chitosan-PLGA encapsulated trivalent oral vaccine against viral haemorrhagic septicemia virus, Streptococcus parauberis, and miamiensis avidus in olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Fish & Shellfish Immunology, 127, pp 843–854 119 124 Korsnes K., Karlsbakk E., Skår C.K., Sælemyr L., Nylund A., Kvamme B.O., Mortensen S., (2017), “High nervous necrosis virus (NNV) diversity in wild wrasse (Labridae) in Norway and Sweden”, Dis Aquat Organ, 126, pp 43–50 125 Kumar R., Joy K.P., Singh S.M., (2016), “Morpho-histology of head kidney of female catfish Heteropneustes fossilis: Seasonal variations in melanomacrophage centers, melanin contents and effects of lipopolysaccharide and dexamethasone on melanins”, Fish Physiology and Biochemistry, pp 1-20 126 Lan N.G.T., Salin K.R., Longyant S., Senapin S., Dong H.T., (2021), “Systemic and mucosal antibody response of freshwater cultured Asian seabass (Lates calcarifer) to monovalent and bivalent vaccines against Streptococcus agalactiae and Streptococcus iniae”, Fish & Shellfish Immunology, 108, pp 7–13 127 Lee C., Hu S., Kim B., Soyano K., Lee Y.D., (2020), “Induced maturation and fertilized egg production of the red spotted grouper (Epinephelus akaara) using adaptive physiology of photoperiod and water temperature”, Aquaculture Research, 51 (5), pp 2084-2090 128 Li J., Suo Y., Liao X., Ahn J., Liu D., Chen S., (2017), “Analysis of Staphylococcus aureus cell viability, sublethal injury and death induced by synergistic combination of ultrasound and mild heat”, Ultrason Sonochem, 39, pp 101–110 129 Lillehaug A., Sevatdal S., Endal T., (1996), “Passive transfer of specific maternal immunity does not protect Atlantic salmon (Salmo salar L.) fry against yersiniosis”, Fish & Shellfish Immunology, 6, pp 521–535 130 Lin C.C., Lin J.H.Y., Chen M.S., Yang H.L., (2007), “An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper (Epinephelus coioides)”, Aquaculture, 268, pp 265–273 131 Liu X.D., Huang J.N., Weng S.P., Hu X.Q., Chen W.J., Qin Z.D., Dong X.X , Liu X.L., Zhou Y., Asim M., Wang W.M., He J.G., Lin L., (2015), 120 “Infections of nervous necrosis virus in wild and cage-reared marine fish from South China Sea with unexpected wide host ranges”, Journal of Fish Diseases, 38(6), pp 533-540 132 Liu G., Zhu J., Chen K., Gao T., Yao H., Liu Y., (2016), “Development of Streptococcus agalactiae vaccines for tilapia”, Dis Aquat Organ, 122, pp 163–170 133 Liu X., Jiao C., Ma Y., Wang Q., Zhang Y., (2018), “A live attenuated vibrio anguillarum vaccine induces efficient immunoprotection in tiger puffer (Takifugu rubripes)”, Vaccine, 36, pp 1460–1466 134 Liu L., Lu D.Q., Xu J., Luo H.L., Li A.X., (2019), “Development of attenuated erythromycin-resistant Streptococcus agalactiae vaccine for tilapia (Oreochromis niloticus) culture”, Journal of Fish Diseases, 42, pp 693–701 135 Liu Y.L., He T.T., Jiang X.L., Sun S.S., Wang L.K., Nie P., (2022), “Development of a hyper-adhesive and attenuated Edwardsiella ictaluri strain as a novel immersion vaccine candidate in yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco)”, Microb Pathog, 167:105577 136 Lorenzen N., LaPatra SE., (2005), “ADN vaccines for aquacultured fish”, Rev.sci tech Off int Epiz, 24 (1), pp 201–213 137 Low C.F., Syarul Nataqain B., Chee H.Y., Rozaini M.Z.H., Najiah M., (2017), “Betanodavirus: Dissection of the viral life cycle: Review”, Journal of Fish Diseases, 00, pp -8 138 Lubzens E., Young G., Bobe J., Cerdà J., (2010), “Oogenesis in teleosts: How fish eggs are formed”, General and Comparative Endocrinology, 165 (3), pp 367-389 139 Ma J Bruce T.J., Jones E.M., Cain K.D., (2019), “A review of fish vaccine development strategies: conventional methods and modern biotechnological approaches”, Microorganisms, 7(11), pp 569-587 121 140 Ma J., Casadei E., Bruce T.J., Sepahi A., Cain K.D., Salinas I., (2022), “Long-term efficacy of nasal vaccination against enteric red mouth (ERM) disease and infectious hematopoietic necrosis (IHN) in juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Vaccine, 40, pp 229–238 141 Magnadottir B., Jonsdottir H., Helgason S., Bjornsson B., Jorgensen T.O., Pilstrom L., (1999), “Humoral immune parameters in Atlantic cod (Gadus morhua L.): II The effects of size and gender under different environmental conditions”, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 122, pp 181–188 142 Magnadottir B., Audunsdottir S.S., Bragason B.T.H., Gisladottir B., Jonsson Z.O and Gudmundsdottir S., (2011), “The acute phase response of Atlantic cod (Gadus morhua): Humoral and cellular responses”, Fish Shellfish Imunnol, 30, pp 1124-1130 143 Malecki J.K., Roy L.A., Arias C.R., Nhat Truong T., Hanson T.R., Lange M.D., (2021), “Bioeconomic analysis of flavobacterium columnare vaccine pond trials with channel catfish”, N Am J Aquac, 83, pp 207–217 144 Martinez D.J., (2015), “Epidemiology and pathogenesis of Nervous Necrosis Virus”, A thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy Farm Animal and Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Science, the University of Sydney 287P 145 Marsian J., Hurdiss D.L., Ranson N.A., Ritala A., Paley R., Cano I., (2019), “Plant made nervous necrosis virus like particles protect fish against disease”, Front Plant Sci, 10:880 146 Maule A.G., Schrock R., Slater C., Fitzpatrick M.S., Schreck C.B., (1996), “Immune and endocrine responses of adult chinook salmon during freshwater immigration and sexual maturation”, Fish & Shellfish Immunology, 6, pp 221–233 147 Metcalf D., Nicola N.A., (1995), “The hematopoietis colonystimulating factors: From biological to clinical applications”, New York: Cambridge University Press, USA, 329 p 122 148 Mohamed L.A., Soliman W.S., (2013), “Development and efficacy of fish vaccine used against some bacterial diseases in farmed Tilapa”, Nat Sci, 11(6), pp 120–128 149 Mohammadi Y., Mesbah M., Dezfoulnejad M.C., Mehrgan M.S., Islami H.R., (2021), “Growth performance, blood biochemical parameters, immune response, and antioxidant defense of Asian seabass (Lates calcarifer) fingerlings exposed to monovalent and bivalent vaccines against Streptococcus iniae and Vibrio harveyi”, Aquac Int, 29, pp 2751–2767 150 Mori K., Nakai T., Nagahara M., Muroga K., Mekuchi T., Kanno T., (1991), “A viral disease in hatchery-reared larvae and juveniles of redspotted grouper”, Fish Pathology, 26 (1991) (1991), pp 209-210 151 Mori K., Nakai T., Muroga K., Arimoto M., Mushiake K., Furusawa I., (1992), “Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis”, Virology, 187, pp 368-371 152 Mugimba K.K., Byarugaba D.K., Mutoloki S., Evensen O., Munang’andu H.M., (2021), “Challenges and solutions to viral diseases of finfish in marine aquaculture”, Pathogens, 10, 673 153 Mulero I., García-Ayala A., Meseguer J., Mulero V., (2007), “Maternal transfer of immunity and ontogeny of autologous immune competence of fish: a minireview”, Aquaculture, 268, pp 244–250 154 Munday B.L., Kwang J., Moody N., (2002), “Betanodavirus infections of teleost fish: a review”, Journal of Fish Diseases, 25, pp 127–142 155 Muniesa A., Basurco B., Aguilera C., Furones D., Reverté C., SanjuanVilaplana A., Jansen M.D., Brun E., Tavornpanich S., (2020), “Mapping the knowledge of the main diseases affecting sea bass and sea bream in Mediterranean”, Transbound Emerg Dis, 67, pp 1089–1100 156 Murata R., Karimata H., Ashraful M., Nakamura M., (2009), “Gonadal sex differentiation in the Malabar Aquaculture, 293, (3), pp 286-289 grouper, Epinephelus malabaricus”, 123 157 Nakamura M., Kobayashi Y., Miura S., Alam M.A., Bhandari R.K., (2005), “Sex change in coral reef fish”, Fish Physiology and Biochemistry, 31 (2–3), pp 117-122 158 Nakamura M., Nozu R., Nakamura S., Higa M., Bhandari R.K., Kobayashi Y., Horiguchi R., Komatsu T., Kojima Y., Murata R., Soyano K., Ogawa S., Hirai T., Matsubara H., Tokumoto T., Kobayashi T., Kagawa H., Adachi S., Yamauchi K., Nagahama Y., (2022), “Morphological and physiological studies on sex change in tropical fish: Sexual plasticity of the ovaries of hermaphroditic and gonochoristic fish”, Galaxea J Coral Reef Stud., 24 (1), pp 5-17 159 Nagae M., Fuda H., Hara A., Kawamura H., Yamauchi K., (1993), “Changes in serum immunoglobulin M (IgM) concentrations during early development of chum salmon (Oncorhynchus keta) as determined by sensitive elisa technique”, Comp Biochem Physiol A Physiol, 106, pp 69–74 160 Natt Michael P., Herrick Chester A., (1952), “A New Blood Diluent for Counting the Erythrocytes and Leucocytes of the Chicken”, Poultry Science, Volume 31, Issue 4, pp 735-738 161 Newaj-Fyzul A., Austin B., (2015), “Probiotics, immunostimulants, plant products and oral vaccines, and their role as feed supplements in the control of bacterial fish diseases”, Journal of Fish Diseases, 38(11), pp 937-955 162 Nishioka T., Sugaya T., Kawato Y., Mori K., Nakai T., (2016), “Pathogenicity of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) Isolated from asymptomatic wild Japanese jack mackerel Trachurus japonicas”, Fish Pathol, 51, pp 176–183 163 Nishizawa T., Mori K., Nakail T., Furusawa I., Muroga K., (1994), “Polymerase chain reaction (PCR) amplification of RNA of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV)”, Dis aqua Org, 18, pp 103-107 164 Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Muroga K., (1997), “Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene”, Applied and Environmental Microbiology, 63, pp 1633– 1636 124 165 Nishizawa T., Gye H.J., Takami I., Oh M.J., (2012), “Potentiality of a live vaccine with nervous necrosis virus (NNV) for sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus at a low rearing temperature”, Vaccine, 30 (6), pp 1056–1063 166 Nylund A., Karlsbakk E., Nylund S., Isaksen T., Karlsen M., Korsnes K., Handeland S., Martinsen R., Mork Pedersen T & Ottem K., (2008), “New clade of Betanodaviruses detected in wild and farmed cod (Gadus morhua) in Norway”, Archives of Virology, 153, pp 541–547 167 OIE (2018), “Viral encephalopathy and retinopathy”, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, pp 1–20 168 OIE (2019) “Viral encephalopathy and retinopathy,” in Manual of diagnostic tests for aquatic animals Available at: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/c hapitre_viral_encephalopathy_retinopathy.pdf 169 Padrós F., Constenla M., Casal J., Fioravanti M., Ciulli S., Gustinelli A., Caffara M., Acosta F., Sitjà-Bobadilla A., Palenzuela O., (2020), “Perform FISH (727610) Deliverable 3.2—Epidemiological Status of Mediterranean Farmed Fish”, Zenodo, 2020 170 Pakingking J.R., Bautista N.B., de Jesus-Ayson E.G., Reyes O., (2010), “Protective immunity against viral nervous necrosis (VNN) in brownmarbled grouper (Epinephelus fuscogutattus) following vaccination with inactivated Betanodavirus”, Fish Shellfih Immunol, 28, pp 525–533 171 Panzarin V., Patarnello P., Mori A., Rampazzo E., Cappellozza E., Bovo G., (2010), “Development and validation of a real-time TaqMan PCR assay for the detection of Betanodavirus in clinical specimens”, Archives of Virology, 155, pp 1193–1203 172 Panzarin V., Fusaro A., Monne I., Cappellozza E., Patarnello P., Bovo G., Capua I., Holmes E.C., Cattoli G., (2012), “Molecular epidemiology and evolutionary dynamics of Betanodavirus in southern Europe”, Infect Genet Evol 12, pp 63–70 125 173 Pérez-Casanova J.C., Rise M.L., Dixon B., Afonso L.O.B., Hall J.R., Johnson S.C., Gamperl A.K., (2008), “The immune and stress responses of Atlantic cod to long-term increases in water temperature”, Fish & Shellfish Immunology, 24, pp 600–609 174 Plant K.P., Lapatra S.E., (2011), “Advances in fish vaccine delivery”, Developmental and Comparative Immunology, 35(12), pp 1256-1262 175 Praveenraj J., Praveena P.E., Bhuvaneswari T., Krishnan A.N., Jithendran K., (2018), “Experimental infection of Betanodavirus in freshwater fish Gambusia affinis (Baird and Girard, 1853)—a potential infection model for viral encephalopathy and retinopathy”, Aquaculture InteARNtional, 26, pp 617-627 176 Pridgeon J.W., Klesius P.H., (2012), “Major bacterial diseases in aquaculture and their vaccine development”, CAB Rev Perspect Agric Vet Sci Nutr Nat Resour, 7, pp 1–16 177 Qin Q.W., Wu T.H., Jia T.L., Hegde A., Zhang R.Q., (2006), “Development and characterization of a new tropical marine fish cell line from grouper, Epinephelus coioides susceptible to iridovirus and nodavirus”, J Virol Methods 131, pp 58–64 178 Qin Y., Liu J., Liu W., Shi H., Jia A., Lu Y., Liu X., (2020), “First isolation and identification of red-grouper nervous necrosis virus (RGNNV) from adult hybrid Hulong grouper (Epinephelus fuscoguttatus × Epinephelus lanceolatus) in China”, Aquaculture, 529, 735662 179 Radhakrishnan A., Vaseeharan B., Ramasamy P., Jeyachandran S., (2022), “Oral vaccination for sustainable disease prevention in aquaculture—an encapsulation approach”, Aquac Int, 14, pp 1-25 180 Rajan J.J.S., Praveena P.E., Bhuvaneswari T., Jithendran K.P., (2016), “Design and evaluation of reverse transcription nested PCR primers for the detection of betanodavirus in finfish”, Virus Disease, 27, pp 123–129 181 Reed L.T., Muench H., (1938), “A simple method of estimating fifty percent end points”, The American JouARNl of Hygienne: pp 493–497 126 182 Rimmer M.A., Phillips M.J., Sim SY., (2006), “Aquaculture of groupers in Asia and the Pacific”, In: Proceedings Economics and marketing of the live reef fish trade in Asia–Pacific, Noumea, ACIAR Working Paper No pp 116–134 183 Rivas L R., (1979), “Review of the Lutjanus campechanus complex of red snappers”, Quarterly Journal of the Florida Academy of Sciences, 15, pp 117-135 184 Rodgers C.J., Furones M.D., (1998), “Disease Problems in Cultured Marine Fish in the Mediterranean” Fish Pathol, 33, pp 157–164 185 Sambrook J., Russell D.W., (2001), Molecular cloning: a laboratory manual, CSHL Press 186 Samat N.A., Yusoff F.M., Rasdi N.W., Karim M., (2020), “Enhancement of live food nutritional status with essential nutrients for improving aquatic animal health: a review”, Animals (Basel) 10 187 Sanders B., Koldijk M., Schuitemaker H., (2015), “Inactivated viral vaccines/Vaccine analysis: strategies, principles, and control”, Berlin, Heidelberg: Springer, p 45–80 188 Sahul Hameed A.S., Ninawe A.S., Nakai T., Chi S.C., Johnson K.L., (2019), “ICTV virus taxonomy profile: Nodaviridae”, J Gen Virol, 100, pp 3–4 189 Saito H., Okamura T., Shibata T., Kato G., Sano M., (2022), “Development of a live attenuated vaccine candidate against herpesviral hematopoietic necrosis of goldfish”, Aquaculture, 552, 737974 190 Secombes C.J., Wang T., (2012), “The innate and adaptive immune system of fish In: Infectious disease in aquaculture: prevention and control”, Woodhead Publishing Limited, Sawston, pp 3–68 191 Seppola M., Johnsen H., Mennen S., Myrnes B., Tveiten H., (2009), “Maternal transfer and transcriptional onset of immune genes during ontogenesis in Atlantic cod”, Dev Comp Immunol, 33, pp 1205–1211 192 Shabram P., Aguilar-Cordova E., (2000), “Multiplicity infection/multiplicity of confusion”, Mol Ther, 2000, 2, pp 420–421 of 127 193 Shapiro D.Y., (1987), “Reproduction in groupers”, pp 295-327 In: Tropical snappers and groupers: biology and fisheries management J J Polovina and S Ralston Westview Press, Boulder, Colorado 194 Shahin K., Pirezan F., Rogge M., LaFrentz B.R., Shrestha R.P., Hildebrand M., (2020), “Development of IglC and GroEL recombinant vaccines for Fancisellosis in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish & Shellfish Immunology, 105, pp 341–349 195 Shefat S.H.T., (2018), “Vaccines for Use in Finfish Aquaculture”, Acta Scientific Pharmaceutical Sciences, 2, (11), pp 15-19 196 Shin Y.J., Kwon T.H., Seo J.Y., Kim TJ., (2013), “Oral immunization of fish against iridovirus infection using recombinant antigen produced from rice callus”, Vaccine, 31, pp 5210–5215 197 Smith C L., (1972), “A spawning aggregation of Nassau grouper Epinephelus striatus (Bloch)”, Trans Am Fish Soc, 101, pp 257-261 198 Sneeringer S., Bowman M., Clancy M Economic research report 290026 United States: Department of Agriculture, Economic Research Service (2019) 199 Souto S., Olveira J.G., Va´zquez-Salgado L., Dopazo C.P., Bandi´n I., (2018), Betanodavirus infection in primary neuron cultures from sole”, Veterinary Research, volume 49, 86 200 Su H.M., (1999), “Grouper Aquaculture in Chinese Taipei”, In Report of the APEC/NACA Cooperative Grouper Aquaculture Workshop, Hat Yai, Thailand, 7–9 April 1999; Collaborative APEC Grouper Research and Development Network Network of Aquaculture Centers in Asia-Pacific; pp 127–130 201 Stathopoulou P., Rafailidou N., Tzokas K., Batargias C., Tsiamis G., (2018), “Near-complete genome sequence of a fish nervous necrosis virus isolated from a clinical disease outbreak in farm-reared bream sparus aurata in Spain”, Genome Announc 6(1), pp 1–2 202 Swain P., Nayak S.K., (2006), “Role of maternally derived immunity in fish”, Fish & Shellfish Immunology, 27, pp 89–99 128 203 Tan S.M., Tan K.S., (1974), “Biology of the tropical grouper Epinephelus tauvina (Forskal) I A preliminary study on hermaphroditism in E tauvina”, Sing J Prim Ind, 2, pp 123–133 204 Tanaka S., Mori K., Arimoto M., Arimoto T., Nakai T., (2001), “Protective immunity of sevenband grouper Epinephelus septemfasciatus Thunberg, against experimental viral nervous necrosis”, Journal of Fish Diseases, 24, p.15–22 205 Tang L., Kang H., Duan K., Guo G., Lian G., Wu Y., Li Y., Gao S., Jiang Y., Yin J., Liu M., (2016), “Effects of Three Types of Inactivation Agents on the Antibody Response and Immune Protection of Inactivated IHNV Vaccine in Rainbow Trout”, Viral Immunol, 29(7), pp 430-435 206 Tavares-Dias M., Schalch S.H.C., Martins M.L., Silva E.D., Moraes F.R and Perecin D., (1999), Hematologia de teleústeos brasileiros com infecỗóo parasitaria I Variáveis Leporinus macrocephalus Garavello & Britski, 1988 (Anostomidae) e Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Characidae)”, Acta Sci Anim Sci, 21: pp 337-342 207 Thiery R., Cozien J., de Boisseson C., Kerbart-Boscher S., Nevarez L., (2004), “Genomic classification of new Betanodavirus isolates by phylogenetic analysis of the coat protein gene suggests a low host-fish species specificity”, JouARNl of General Virology, 85, pp 3079-3087 208 Thompson R and Munro J L., (1978), “Aspects of the biology and ecology of Caribbean reef fishes: Serranidae (hinds and groupers)”, Journal of Fish Biology 12, pp 115-146 209 Tizard I., (1998), “Grease anthraxgate and kennel cough: A revisionist history of early veterinary vaccines”, In Veterinary Vaccines and Diagnostics, Volume 41, pp 7–24 210 Toffan A., Panzarin V., Toson M., Cecchettin K., Pascoli F., (2016), “Water temprature affects pathogenicity of different Betanodavirus genotypes in experimentally challenged Dicentrarchus labrax”, Dis Aquat Organ, 119 (3), pp 231–236 129 211 Toffan A., Panzarin V., (2020), “Viral Encephalopathy and Retinopathy/Viral Nervous Necrosis (VER/VNN)”, Diagnostic Manual for the main pathogens in European seabass and Gilthead seabream aquaculture, pp 45-60 212 Toffan A., Biasini L., Pretto T., Abbadi M., Buratin A., Franch R., Dalla Rovere G., Panzarin V.M., Marsella A., Bargelloni L., (2021), “Age dependency of RGNNV/SJNNV viral encephalo-retinopathy in Gilthead Sea Bream (Sparus aurata)”, Aquaculture, 539, 736605 213 Ucko M., Colorni A., Diamant A., (2004), “Nodavirus infections in Israeli mariculture”, Journal of Fish Diseases, 27(8), pp 459-469 214 Valencia J., Grau A., Box A., Nunez V., Cohen-Sánchez A., Catanese G., (2018), “First detection of Nodavirus as an etiological agent of MME of morays (Muraena helena) in Ibiza and Formentera”, In Proceedings of the First Detection of Nodavirus as an Etiological Agent of MME of Morays (Muraena Helena) in Ibiza and Formentera; Societat d’Història Natural de les Balears: Palma, Spain, 2018 215 Valencia J.M., Grau A., Pretto T., Pons J., Jurado-Rivera J.A., Castro J.A., Toffan A., Catanese G., (2019), “Viral encephalopathy and retinopathy (VER) disease in Epinephelus marginatus from the balearic islands marine protected areas”, Dis Aquat Organ, 135, pp 49–58 216 Valero Y., Olveira J.G., López-Vázquez C., Carlos P D., and Bandín I., (2021), “BEI Inactivated Vaccine Induces Innate and Adaptive Responses and Elicits Partial Protection upon Reassortant Betanodavirus Infection in Senegalese Sole” Vaccines (Basel), 9(5): 458 217 Vallejos-Vidal E., Reyes-López F., MacKenzie S., (2017), “Immunostimulant diets and oral vaccination in fish”, In: Diagnosis and control of diseases of fish and shellfish, pp 147-184 218 Vargas D., Vallejos-Vidal E., Reyes-Cerpa S., Oyarzun-Arrau A., AcunaCastillo C., Imarai M., (2021), “The analysis of live-attenuated piscirickettsia salmonis vaccine reveals the short-term upregulation of innate and adaptive 130 immune genes in Atlantic salmon (Salmo salar): An In situ open-Sea cages study”, Microorganisms, 9:703 219 Vázquez Salgado L., Olveira J.G., Dopazo C.P., Bandín I., (2020), “Role of rotifer (Brachionus plicatilis) and Artemia (Artemia salina) nauplii in the horizontal transmission of a natural nervous necrosis virus (NNV) reassortant strain to Senegalese sole (Solea senegalensis) larvae”, Vet Q., 40, pp 205214 220 Vendramin N., Patarnello P., Toffan A., Panzarin V., Cappellozza E., Tedesco P., Terlizzi A., Terregino C., Cattoli G., (2013), “Viral Encephalopathy and Retinopathy in groupers (Epinephelus spp.) in southern Italy: A threat for wild endangered species”, BMC Vet Res, 9, pp 20 221 Vimal S., Madan N., Farook M.A., Nambi K.S.N., Majeed S.A., Rajkumar T., Venu S., Thirunavukkarasu A.R., Hameed A.S.S., (2014), “Production of recombinant vaccine using capsid gene of nodavirus to protect Asian sea bass, Lates calcarifer (Bloch, 1790)”, Aquaculture, 418–419, pp 148–154 222 Vinay Tharabenahalli-Nagaraju , Ye-Ji Kim, Myung-Hwa Jung, Wi- Sik Kim, Do-Hyung Kim, Sung-Ju Jung., (2013), “Inactivated vaccine against viral hemorrhagic septicemia (VHS) emulsified with squalene and aluminum hydroxide adjuvant provides long term protection in olive flounder (Paralichthys olivaceus)”, Vaccine, Volume 31, Issue 41, Pages 4603-4610 223 Vinitantharat S., Gravningen K., Greger E., (1999), “Fish vaccines”, Adv Vet Med 41: pp 539–550 224 Volpe E., Pagnini N., Serratore P., Ciulli S., (2017), “Fate of redspotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV) in experimentally challenged Manila clam Ruditapes philippinarum”, Dis Aquat Organ, 125, pp 53–61 225 Volpe E., Gustinelli A., Caffara M., Errani F., Quaglio F., Fioravanti M.L., Ciulli S., (2020), “Viral nervous necrosis outbreaks caused by the RGNNV/SJNNV reassortant betanodavirus in gilthead sea bream (Sparus 131 aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax)”, Aquaculture, 523, 735155 226 Watanabe K., Nishizawa T., Yoshimuzu M., (2000), “Selection of broodstock candidates of barfin flounder using an ELISA system with recombinant protein of barfin flounder nervous necrosis virus”, Dis Aqua Org, 41, pp 219–223 227 Widera M., Westhaus S., Rabenau H.F., Hoehl S., Bojkova D., Cinatl J., Ciesek S., (2021), “Evaluation of stability and inactivation methods of SARS-CoV-2 in context of laboratory settings”, Med Microbiol Immunol, 210, pp 235–244 228 Wu Y.C.C., Chi S.C.C., (2006), “Persistence of Betanodavirus in Barramundi brain (BB) cell line involves the induction of Interferon response”, Fish & Shellfish Immunology, 21, pp 540–547 229 Xing J., Zhang Z., Sheng X., Tang X., Chi H., Zhan W., (2020),“Identificatio n and characterization of a new strain of nervous necrosis virus isolated from pearl gentian grouper (Epinephelus lanceolatus × Epinephelus fuscoguttatus) in China”, Aquaculture, 529 230 Yamashita H., Mori K., Kuroda A., Nakai T., (2009), “Neutralizing antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an inactivated virus vaccine”, J Fish Dis, 32, pp 767–775 231 Yu S., Wei Y., Liang H., Ji W., Chang Z., Xie S., Wang Y., Li W., Liu Y., Wu H., (2022), “Comparison of Physical and Biochemical Characterizations of SARS-CoV-2 Inactivated by Different Treatments”, Virus Res, 14, 1938 232 Zapata A., Diez B., Cejalvo T., Gutierrez-De Frias C., Cortes A., (2006),” Ontogeny of the immune system of fish”, Fish & Shellfish Immunology, 20, pp 126–136 233 Zeng R., Pan W., Lin Y., He J., Luo Z., Li Z., (2021), “Development of a gene deleted live attenuated candidate vaccine against fish virus (ISKNV) with low pathogenicity and high protection”, iScience, 24, 102750 132 234 Zhang L., Ma J., Fan Y., Zhou Y., Xu J., Liu W., (2016), “Immune response and protection in gibel carp, carassius gibelio, after vaccination with βpropiolactone inactivated cyprinid herpesvirus 2”, Fish & Shellfish Immunology, 49, pp 344–350 235 Zhang D., Gao Y., Li Q., Ke X., Liu Z., Lu M., (2020), “An effective live attenuated vaccine against Streptococcus agalactiae infection in farmed Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish & Shellfish Immunology, 98, pp 853– 859 236 Zhang J., Hu Y., Sun Q., Li X., Sun L., (2021), “An inactivated bivalent vaccine effectively protects turbot (Scophthalmus maximus) against vibrio anguillarum and vibrio harveyi infection”, Aquaculture, 544:737158 237 Zhang Y., Zhou L., Zhang Y., (2014), “Investigation of UV-TiO2 photocatalysis and its mechanism in bacillus subtilis spore inactivation”, J Environ Sci (China), 26, pp 1943–1948 238 Zhang Z., Angen Y., Jiangfeng L., Zhang H., Hu M., Cheng J., Zhao L., Lin L., We S., (2017), “GapA, a potential vaccine candidate antigen against Streptococcus agalactiae in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)”, Fish & Shellfish Immunology, Volume 63, pp 255-260 239 Zheng Z., Wang Y., Wang Q., Deng N., Liao M., Qu J., Li B., Wang L., (2012), “Study on the immune enhancement of different immunoadjuvants used in the pentavalent vaccine for turbots”, Fish & Shellfish Immunology, Volume 32, Issue 3, Pages 391-395 240 Zhou S., Tu X., Pang H., Hoare R., Monaghan S.J., Luo J., (2020), “A T3SS regulator mutant of vibrio alginolyticus affects antibiotic susceptibilities and provides significant protection to danio rerio as a live attenuated vaccine”, Front Cell Infect Microbiol, 10, 183 241 Zorriehzahra M.J., Adel M., Dadar M., Ullah S., Ghasemi M., (2019), “Viral nervous necrosis (VNN) an emerging disease caused by Nodaviridae in aquatic hosts: Diagnosis, control and prevention: A review”, Iranian JouARNl of Fisheries Sciences, 18, pp 30–47 133 242 Zrnčić S., Padros F., Mladineo I., Fioravanti M.L., Gustinelli A., Palenzuela O., Toffan A., Panzarin V., Cuilli S., Fouz B., (2020) “Bottlenecks in diagnostics of Mediterranean fish diseases”, Bull Eur Ass Fish Pathol, 40, pp 71-82 243 https://www.gso.gov.vn/tin-tuc-thong-ke/2022/12/thong-cao-bao-chi-ve-tinhhinh kinh-te-xa-hoi-quy-iv-va-nam-2022/ 244 https://www.gso.gov.vn/tin-tuc-thong-ke/2022/10/day-manh-phat-trien-nuoi trong-thuy-san/ 245 https://tongcucthuysan.gov.vn/vi-vn/tin-tức/nghề-cá-trong-nước/doctin/2022-11-07/hoi-thao-quoc-gia-nuoi bien-viet-nam-nam-2022 246 http://thuysanvietnam.com.vn/vaccine-cho-ca-tra-mot-huong-tiep-can-moiarticle-13155.tsvn) 247 Lawrence S.A., (2000), “β-Propiolactone: Viral Inactivation in Vaccines and Plasma Products”, PDA J Pharm Sci Technol, 54, pp 209–217 248 Abd-Elghaffar A.A., Ali A.E., Boseila A.A., Amin M.A., (2016), “Inactivation of Rabies Virus by Hydrogen Peroxide”, Vaccine, 34, pp 798– 802 249 Trần Vĩ Hích, Nguyễn Thị Kim Cúc, (2020), “Đánh giá hiệu vaccine bất hoạt phòng bệnh mù mắt liên cầu khuẩn gây cá bớp nuôi Khánh Hịa”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ thủy sản, Trường Đại học Nha trang, số 1, trang 54-58 250 Trần Vĩ Hích, Takano R., Fukuda K., (2021), “Đánh giá hiệu vắc xin PISIVAC Irido Si việc phòng bệnh cá mú ngủ Iridovirus gây cá mú lai (Epinephelus fuscoguttatus x E lanceolatus) nuôi Khánh Hịa”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ thủy sản, Trường Đại học Nha trang, số 2, trang 55-58 134 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết sàng lọc mẫu cá nhiễm NNV Ký STT hiệu mẫu Biểu lâm sàng T4 STT Ký Biểu hiệu lâm mẫu sàng T4 QN01 AB - 31 HP16 ABCD - QN02 ABCD + 32 TB01 ABCD - QN03 AB - 33 TB02 AB + QN04 ABCD + 34 TB03 AB + QN05 AB + 35 TB04 AB - QN06 AB - 36 TB05 ABCD + QN07 ABCD + 37 TB06 ABCD - QN08 AB + 38 TB07 AB + QN09 AB - 39 TB08 AB + 10 QN10 AB + 40 TB09 AB - 11 QN11 AB - 41 TB10 AB + 12 QN12 ABCD + 42 TB11 AB + 13 QN13 ABCD - 43 TB12 ABCD - 14 QN14 AB + 44 TB13 AB + 15 QN15 AB - 45 TB14 ABCD - 16 HP01 ABCD - 46 NĐ01 AB + 17 HP02 AB + 47 NĐ02 AB + 18 HP03 AB + 48 NĐ03 AB + 19 HP04 AB - 49 NĐ04 AB + 20 HP05 ABCD + 50 NĐ05 ABCD + 21 HP06 AB + 51 NĐ06 AB - 22 HP07 AB + 52 NĐ07 AB - 135 23 HP08 ABCD - 53 NĐ08 ABCD + 24 HP09 ABCD + 54 NĐ09 ABCD - 25 HP10 AB - 55 NĐ10 ABCD + 26 HP11 AB - 56 NĐ11 AB - 27 HP12 AB + 57 NĐ12 AB + 28 HP13 AB - 58 NĐ13 AB - 29 HP14 ABC - 59 NĐ14 ABCD - 30 HP15 ABCD + 60 NĐ15 ABCD - Ghi chú: A : Bỏ ăn B : Bơi tách đàn, màu sắc thể đen tối C : Mắt lồi, bóng căng, ruột chứa dịch D : Bơi ngửa, bơi xoay trịn, có tượng chết (-) : Khơng có gen T4 (+) : Có gen T4 136 Phụ lục 2: Trình tự gen T4 mẫu TB05 HP02 TB05 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATGACACAAGGT TCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACAAATGACTTCAAGTCCATCC TCCTAGGATCCACGCCACTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTT CCAGCTGGACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACTGGA GATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAA ATGCTGGCACACCTGCAGGCTGGTTTCGCTGGGGCATCTGGGACA ACTTCAATAAGACGTTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGA GCAGCCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCACCCGT GTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGTCACAGGTCTTCGAA GGGGAGGGG HP02 ACAGGCAGCAGATATTGACGGGCTGCTCCATCAGAGTAGTAGGCA ACGCCATCTGTGAACGTCTTATTGAAGTTGTCCCAGATGCCCCAGC GAAACCAGCCTGCAGGTGTGCCAGCATTTCCAGCAAACTTCTTGA GGTGCCAATAAACAGCACGATCAACATCTCCAGTTCCAAGGCTGT AGTCGATGGACAGCGGACGGTCCAGCTGGAAGACTGCTCCATCAG GGGCAATATCCAGTGGCGTGGATCCTAGGAGGATGGACTTGAAGT CATTTGTGGAAAGGGAATCGTTGTACAGGGAACCTTGTGTCATGAT GGGAGCGGTGGTCTCTTCAGGTGTCTCAAGAGATGGAACGCTCAG TCGAACACTCCAGCGACACATGACTGAAGAATTTCCGGAGACTTG GGGGGGGGGTTGT 137 Phụ lục Trình tự gen T4 chủng NNV TB05 qua 10 đời cấy chuyển Số lần cấy Trình tự gen T4 chuyển AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG 138 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA 139 CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG 140 AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG 141 CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG 10 AGTGAGACACCTGAAGAGACCACCGCTCCCATCATG ACACAAGGTTCCCTGTACAACGATTCCCTTTCCACA AATGACTTCAAGTCCATCCTCCTAGGATCCACGCCA CTGGATATTGCCCCTGATGGAGCAGTCTTCCAGCTG GACCGTCCGCTGTCCATCGACTACAGCCTTGGAACT GGAGATGTTGATCGTGCTGTTTATTGGCACCTCAAG AAGTTTGCTGGAAATGCTGGCACACCTGCAGGCTGG TTTCGCTGGGGCATCTGGGACAACTTCAATAAGACG TTCACAGATGGCGTTGCCTACTACTCTGATGAGCAG CCCCGTCAAATCCTGCTGCCTGTTGGCACTGTCTTCA CCCGTGTTGATGGTTGGGGCGGAGGTAGCCTGACGT CACAGGTCTTCGAAGGGGAGGGG 142 Phụ lục 4: Ảnh tiêm cá Phụ lục 5: Thử nghiệm vắc-xin cho cá giống 143 Phụ lục 6: TCVN 8684:2011 VẮC XIN VÀ CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THÚ Y – PHÉP THỬ ĐỘ THUẦN KHIẾT Veterinary vaccines and biological products – Purity test Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp thử độ khiết vắc xin chế phẩm sinh học dùng thú y Thuốc thử môi trường nuôi cấy 2.1 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 2.1.1 Metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua 2.1.2 Dung dịch sắt(II) clorua axit sulfamic 2.1.3 Formaldehyt chuẩn 2.2 Môi trường nuôi cấy Sử dụng môi trường nuôi cấy pha chế sẵn chuẩn bị môi trường nuôi cấy trước sử dụng 2.2.1 Môi trường thioglycollat 2.2.2 Môi trường trypticaza đậu tương 2.2.3 Thạch máu 2.2.4 Canh thang thịt 2.2.5 Thạch Sabouraud 2.2.6 Sản phẩm thủy phân casein đậu tương 2.2.7 Canh thang PPLO, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 2.2.8 Thạch PPLO (tên đầy đủ pleuropneumonia-like organism agar, có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men 144 2.2.9 Dung dịch DPN-cystein, có bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, Lcystein hydroclorua huyết ngựa 2.2.10 Canh thang tim, có bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men 2.2.11 Thạch MacConkey 2.2.12 Thạch Salmonella-Shigella 2.2.13 Thạch brilliant green 2.2.14 Thạch desoxycholat xitrat 2.2.15 Thạch xyloza lysin deoxycholat (thạch XLD) 2.2.16 Canh thang selenit 2.2.17 Canh thang tetrathionat Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm sinh học thơng thường cụ thể sau: 3.1 Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 0C 3.2 Tủ ấm CO2 3.3 Tủ sấy 3.5 Máy lắc 3.7 Máy đo quang phổ, sử dụng cuvet cm, đo bước sóng 628 nm Cách tiến hành 4.1 Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn 4.1.1 Tiến hành 4.1.1.1 Cấy vắc xin ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thioglycollat (2.2.1), môi trường trypticaza đậu tương (2.2.2), đĩa môi trường thạch máu (2.2.3), lượng vắc xin cấy từ % đến % (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra Nếu vắc xin dạng đơng khơ phải hồ tan trở lại dung tích ban đầu 145 Ủ mơi trường cấy vắc xin tủ 37 oC, theo dõi từ ngày đến 10 ngày 4.1.1.2 Nếu vắc xin có chất diệt trùng giữ mẫu nhiệt độ từ 25 0C đến 30 0C thời gian từ 24 h đến 48 h trước tiến hành kiểm tra Kiểm tra vắc xin có chất diệt trùng sau: – Cấy mẫu vào ống 10 ml canh thang thịt (2.2.4), theo dõi 37 0C ngày – Cấy chuyển từ ống canh thang thịt sang ống canh thang thịt chuẩn bị, theo dõi 37 0C thời gian từ ngày đến 10 ngày 4.1.2 Đọc kết Mẫu vắc xin xem đạt tiêu chuẩn khơng có vi sinh vật mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 4.2 Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc 4.2.1 Tiến hành Mẫu vắc xin ria cấy môi trường thạch Sabouraud (2.2.5) sản phẩm thủy phân casein đậu tương (2.2.6) Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng (từ 20 0C đến 25 0C) 4.2.2 Đọc kết Mẫu vắc xin xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trường kiểm tra thời gian theo dõi 4.3 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma 4.3.1 Tiến hành Mẫu vắc xin cấy kiểm tra môi trường canh thang PPLO (2.2.7) với nồng độ từ % đến % vắc xin 100 ml môi trường đĩa thạch PPLO (2.2.8) có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml vắc xin đĩa Có thể sử dụng dung dịch DPN-cystein (2.2.9), bổ sung nicotinamid adenin dinucleotid, L-cystein hydroclorua huyết ngựa sử dụng môi trường canh thang tim (2.2.10) bổ sung proteoza pepton chất chiết nấm men để làm môi trường kiểm tra 146 Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 330C đến 370C Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm CO2 (3.2) 370C có % khí CO2, theo dõi 28 ngày Trường hợp dùng Dung dịch DPN-cystein Mơi trường canh thang tim ria cấy vào đâu??? 4.3.2 Đọc kết Mẫu vắc xin xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc môi trường kiểm tra 4.4 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella 4.4.1 Tiến hành nuôi cấy Mẫu vắc xin cấy môi trường kiểm tra, dùng loại môi trường sau: thạch MacConkey (2.2.11), thạch Salmonella-Shigella (2.2.12), thạch Brilliant Green (2.2.13), thạch desoxycholat xitrat (2.2.14) thạch XLD (2.2.15), với nồng độ từ % đến % dung tích mơi trường kiểm tra Ủ môi trường cấy vắc xin tủ 37 oC, theo dõi từ 18 h đến 24 h sau cấy chuyển tiếp sang ống mơi trường nước, dùng loại môi trường sau: canh thang selenit (2.2.16) canh thang tetrathionat (2.2.17) Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48 h đến 72 h 4.4.2 Đọc kết Mẫu vắc xin xem đạt khơng có vi khuẩn Salmonella mọc loại mơi trường kiểm tra 4.5 Kiểm tra có mặt formaldehyt vắc xin: phương pháp sắt(II) clorua 4.5.1 Tiến hành Pha loãng vắc xin nồng độ : 200 (phần thể tích) (nếu vắc xin dạng nhũ dầu pha lỗng nồng độ 1/20) Lấy 0,5 ml vắc xin pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml formaldehyt chuẩn (2.1.3) pha loãng theo tỉ lệ 147 1/200 0,5 ml metylbenzothiazolon hydrazon hydroclorua (2.1.1) Đậy nắp ống nghiệm, lắc nhẹ máy lắc (3.5) để đứng ống nghiệm 60 nhiệt độ phịng Sau thêm 1,0 ml sắt(II) clorua axit sulfamic (2.1.2) để đứng ống nghiệm 15 nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ vắc xin chất chuẩn máy đo quang phổ (3.7) bước sóng 628 nm 4.5.2 Đọc kết Mẫu vắc xin xem đạt độ hấp thụ đo nhỏ 0,74 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - Mọi thông tin cần thiết nhận biết đầy đủ mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - Tất điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn này, xem tuỳ ý, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết - Kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] ASEAN standards for animal vaccines Appendix – Guidelines for sterility testing of veterinary vaccines [2] CFR 113.28: Dectection of Mycoplasma contamination [3] CFR 113.28: Dectection of Salmonella contamination