KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỬU TẠO VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỦ THẨN KINH TRÊN CÁ MỦ {EpínepheỄus sp ) QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM Mẫn Hồng Phước1’1 2’ *, Phạm Thị Tâm2, Đồng Văn Quyền1, Vũ Thị Bích[.]
KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỬU TẠO VẮC XIN VÔ HOẠT PHÒNG BỆNH HOẠI TỦ THẨN KINH TRÊN CÁ MỦ {EpínepheỄus sp.) QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM Mẫn Hồng Phước1’1 2’ *, Phạm Thị Tâm2, Đồng Văn Quyền1, Vũ Thị Bích Huyền3, Lê Minh Hải4 TĨMTẮT Bệnh hoại tử thần kinh bệnh cấp tính, gây chết hàng loạt cá mú giai đoạn ấu trùng cá bột Bài báo trinh bày kết nghiên cứu tạo vắc xin bất hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú ni quy mơ phịng thí nghiệm Chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh TB05 phân lập từ tỉnh Thái Binh có độc lực TCIDso = 1068 LD50 = 107'5 lựa chọn làm chủng nghiên cứu chế tạo vắc xin Vi rút bất hoạt beta - propiolactone 0,1% phối họp vói hydroxit nhơm để tạo vắc xin Bàng phương pháp ngâm, vắc xin an toàn cá mú từ giai đoạn ấu trùng đến cá bột, tỷ lệ bảo hộ vói liều cơng cường độc 0,2 x TCID50, 0,5 X TCIDr/l va X TCID5() đạt 75% Kết nghiên cứu làm tiền đề cho việc sản xuất vắc xin phòng ngừa bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú, giúp phát triển bền vững nghề ni cá mú Việt Nam Từ khóa: vắc xin, vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh, công cường độc, bảo hộ, cámú ĐẶT VẤN SỀ Bệnh hoại tử thần kinh (viral nervous necrosis disease - VNN) bệnh cấp tính nguyên nhân gây thiệt hại lớn kinh tế nghề nuôi cá biển nuôi trồng thủy sản công nghiệp Tác nhân VNN vi rút thuộc giống Betanodavirus, họ Nodaviridae [12], [8], [4], [11], [9], [1] Để phịng bệnh vi rút gây vắc xin biện pháp hữu hiệu Cho đến nay, nhiều loại vắc xin phòng VNN nghiên cứu thử nghiêm Một số loại vắc xin phòng VNN phát triển vắc xin bất hoạt, vắc xin tái tổ họp, loại vắc xin mang lại hiệu định [3] vắc xin tái tổ họp sử dụng nhiều loài cá khác nhau, cá mú bảy dải (Epinephelus septemfasciatus) [ 15], cá mú lưng gù (Cromileptes altiveliể) [6], cá mú đốm cam (Epinephelus coioideề) [2] cá chêm châu Á (Lates caỉcander) [18], Kết cho thấy, vắc xin tạo kháng thể đặc hiệu có tỷ lệ bảo hộ dao động từ 67% đến 82% cá trưởng thành Tuy nhiên, vắc xin tái tổ họp hạn chế định giá thành cao, hiệu bảo hộ thấp [7], [14], [16] Hiện nay, số loại vắc xin bất hoạt phòng bệnh VNN phát triển vắc xin bất hoạt Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Đại học Mở Hà Nội Email: manphuoc@gmail.com Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Trường Đại học Vinh 66 phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú lưng gù, cá mú đốm cam [5], cá mú đốm đỏ (RGNNV), cá mú bảy dải [17] cá mú cẩm thạch nâu (Epinephelus íuscoguttatuầị [10] Hiệu bảo hộ loại vắc xin dao động từ 86% đến 100% Mặc dù vắc xin bất hoạt đặc hiệu hiệu hon so vói vắc xin tái tổ họp phòng chống VNN, đa dạng chủng vi rút gây bệnh VNN đòi hỏi phải nghiên cứu lựa chọn tạo vắc xin từ chủng vi rút thực địa có độ tưong đồng kháng nguyên cao vói chủng vi rút gây bệnh nước hay khu vực Nghiên cứu trinh bày kết tạo vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hoại tử thần kinh cá mú {Epinephelus sp.) từ chủng thực địa Việt Nam quy mơ phịng thí nghiệm VẬT UỆU VÃ PHUOWG PHÁP NGHIÕI ClMl 2.1 Vật liệu - Chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh TB05 phân lập từ mô mắt não cá mú nghi mắc bệnh Cồn Vành, Thái Binh, lưu trữ 80°C Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội - Cá thí nghiệm: cá mú giống (Epinephelus coioideầ) (1,5 cm) cung cấp Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc, Xuân Đán, Cát Bà, Hải Phịng Cá kiểm tra khơng nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh phản ứng RT - PCR ni bể xi măng NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nông thôn - KỲ - THÁNG 3/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương phápnuôi cấy vi rút Vi rút TB05 I|uôi tế bào GS01 (Đại học Wageningen, Hà Lan) Trước sử dụng, tế bào hoạt hóa chai nuôi cấy với môi trường Leibovitz’s L - 15 có be sung 10% huyết bào thai bê (Fetal Calf Serum - FCS, Sigma) Tế bào nuôi tủ ấm nhiệt độ 27°c, 5% co2 ngày để đạt mật độ 105 tế bào/ml Sau lây nhiễm với chủng TB05 Theo dôi hiệu ứng huỷ hoại tế bào (Cytopathic Effect - CFE) ngày Khi CPE đạt khoảng 90% - 95% tiến hành thu dịch vi rút khỏi chai nuôi cấy ly tâm thu dịlch có chứa vi rút 2.2.2 Chuẩn độ vi rút TCID50 (Tissue Culture Infective Dose, 50%) Chuẩn độ vi rút thực đĩa nhựa 96 giếng nuôi tế bào GS01 Dịch vi rút pha loãng theo hệ số 10 dung dịch muối cân Hanks (Hank’s Balanced Salt Solution - HBSS) Vi rút hấp phụ vào tế bào trorg Tiếp tục ni tế bào bàng Leibovitz’s L - 15 có 10% FCS Quan sát CPE vòng ngày để xác định TCID50 theo phương pháp Reed Muench (1938) [13] 1g TCID50= lgA+xllgf lgTCID50= lgA+x21gf Trong đó: f hệ số pha loãng 50-AI xl= - A1-B1 5O-B1 1x2= + Bất hoạt Binary ethylenimine (BEI): BEI O,1M bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0.001M 0,002M Hỗn họp ủ 37°C/36 BEI loại khỏi dịch bất hoạt cách trung hòa với IM Na - thiosulfate (Merck) 12 + Bất hoạt beta - propiolactone: chỉnh pH dịch vi rút 7,3, bổ sung beta - propiolactone theo tỷ lệ 1: 2000 (v/v) Khuấy hỗn họp máy khuấy từ 24 giờ/4°c Beta - propiolactone loại bỏ cách chỉnh pH 7,0,37°C/24 Dịch vi rút TB05 sau bất hoạt formalin, BEL beta - propiolactone gày miễn dịch cho thỏ lần, lần cách lần thứ ngày với vói liều TCID50 = 106’8, định kỳ ngày lần sau lần gây miễn dịch đầu tiên, lấy huyết thỏ để thực phải ứng ELISA nhằm xác định khả tạo đáp ứng miễn dịch vi rút bất hoạt lựa chọn hóa chất gây bất hoạt phù họp để sản xuất vắc xin 2.2.4 Phản úng ELISA Phản ứng thực với kháng thể pha loãng dung dịch đệm carbonate, giếng phủ 100 pl ủ qua đêm nhiệt độ 4°c Dịch kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/400 PBS, ủ nhiệt độ 37°c/l giờ, goat anti - rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000, ủ nhiệt độ phòng 45 phút, chất sinh màu TMB ủ 15 phút 37°c dừng phản ứng H9SO4 IM Đọc kết phản ứng máy đọc đĩa ELISA, bước sóng 450 nm A1-B1 A: độ pha lỗng vói tỷ lệ cận có bệnh tích, AI: tỷ lệ cận có bệnh tích 2.2.5 Thí nghiệm lựa chọn chất bổ trợ vắc xin Đối với vắc xin vơ hoạt, việc lựa chọn hóa chất làm chết mầm bệnh nhtmg tri tính sinh miễn dịch đóng vai trị định cho tính tồn vẹn kháng nguyên độ an toàn vắc xin Trong nghiên cứu này, NNV bất hoạt hóa chất: Dịch vi rút sau bất hoạt tạo dạng keo phèn vói chất bổ trợ aluminum hydroxide (AH) aluminum phosphate (AP) Thí nghiệm đánh giá khả bảo hộ vắc xin bố trí thành lơ, lơ 200 cá mú bột (1,5 cm) gây miễn dịch phương pháp ngâm với vắc xin vô hoạt bổ sung keo phèn với AH AP, thịi gian 10 phút có sục khí, sử dụng vắc xin lần, lần cách 10 ngày Lô đối chứng, cá ngâm với giả dược (keo phèn AH AP) + Bất hoạt formalin (formaldehyde 35%); formalin bổ sung vào dịch vi rút để đạt nồng độ 0,1% 0,2% Hỗn họp ủ 37°C/24 Formalin loại khỏi dịch bất hoạt cách trung hòa với PBS 12 Cá mú bột sau sử dụng vắc xin nuôi điều kiện ổn định nhiệt độ 25°c - 27°c nồng độ muối 25%O - 30%o Theo dõi cá 30 ngày để đánh giá mức độ an tồn thực thí nghiệm đánh già hiệu bảo hộ vắc xin B: độ pha lỗng với tỷ lệ cận có bệnh tích, Bl: tỷ lệ cận có bệnh tích 2.3 Phươnggây phápbất hoạt vi rút NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 3/2022 67 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ + Mức độ an tồn vắc xin đánh giá thông qua triệu chứng lâm sàng tỷ lệ sống cá sau sử dụng vắc xin Tỷ lệ sống tính theo cơng thức: Tỷ lệ sống = (1 - tỷ lệ tử vong cá tiêm vắc xin/tỷ lệ tử vong cá không tiêm vắc xin) X 100 + Hiệu lực vắc xin đánh giá phương pháp thử thách cường độc Cá mú thí nghiệm (cá ngâm vắc xin) lô đối chứng (cá ngâm vói giả dược) ngày thứ 30 sau gây miễn dịch chia thành nhóm, nhóm 30 cá cơng cường độc riêng rẽ vói chủng NNV TB05 (TCID50 = 1068PFU/ml) vơi liều: 0,2 X TCID50, 0,5 X TCID50, X TCID50, X TCID50, X TCID50, X TCID50 Tiếp tục theo dõi cá 15 ngày để đánh giá mức độ bảo hộ Tỷ lệ bảo hộ tính cơng thức: Tỷ lệ bảo hộ = (tỷ lệ chết lô giả dược - tỷ lệ chết lô sử dụng vắc xin)/tỷ lệ chết lô giả dược) X 100% Kết hình cho thấy, liều gây nhiễm thấp 0,001, hiệu giá vi rút mức thấp tăng nhẹ vào ngày thứ 5, mức hiệu giá không đạt tiêu chuẩn để sản xuất vắc xin Ở liều gây nhiễm cao 0,1, tế bào bị hủy hoại từ ngày thứ sau gây nhiễm hiệu giá vi rút đạt cao thời điểm này, vào ngày tiếp theo, đĩa nuôi cấy vi rút bổ sung mơi trường trì, hiệu giá vi rút giảm Kết chứng tỏ liều gây nhiễm 0,1 cho hiệu giá vi rút cao gây hủy hoại tế bào nhanh mạnh, đó, liều gây nhiễm 0,01 hiệu giá vi rút cao ngày thứ trì tế bào đến ngày thứ Nghiên cứu giới cho thấy việc trì tế bào tạo đỉnh hiệu giá vi rút sau lần thay môi trường trì cho phép nhân ni thu hoạch vi rút với hiệu giá vi rút cao, điều giúp tiết kiệm tế bào, chủng giống vi rút, môi trường, giá thể nuôi cấy nhân công Do liều gây nhiễm 0,01 chọn để gây nhiễm vi rút lên tế bào GS01 [10] 2.2.6 Thí nghiệm xác định hiệu lực vắc xin mơ hình thực địa Thí nhiệm đánh hiệu lực vắc xin mơ hình thực nghiệm bố trí thành lơ kèm đối chứng Lơ thí nghiệm ngâm vắc xin, liều vắc xin ml/20 ấu trùng ml/5 cá bột (TCID50 g 106’8PFU/ml), thòi gian xử lý vắc xin 30 phút bể sục khí, số liều sử dụng vắc xin sử dụng từ giai đoạn ấu trùng nuôi (lần 1) bể ương giai đoạn cá giống chuyển bè nuôi biển ao đất (lần 2) Lô đối chứng không ngâm vắc xin, lơ thí nghiệm ni điều kiện nhiệt độ 25°c - 27°c, nồng độ muối 25%O - 30%o Theo dõi 90 ngày đánh giá mức độ bảo hộ, tiêu tăng trọng cá KẾT QUÀ NGHẼN cúu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Xác định liều gây nhiễm vi rút vào tế bào mẫn cảm Chủng NNV TB05 gây nhiễm vào tế bào GS01 mơ tả trên, vói hiệu giá TCID50 _ 106'8PFU/ml Các tiêu theo dõi Mức độ hủy hoại tế bào (CPE %) 68 Hình Hiệu giá vi rút theo ngày gây nhiễm NNV vào tế bào GS01 Bất hoạt vi rút 3.2 Vi rút xử lý bất hoạt vói ba loại hóa chất formaldehyde, beta - propiolactone BEI với nồng độ tương ứng là: 0,1% 0,2%; 0,05% 0,1%; 0,001M 0,002M gây nhiễm trở lại đĩa tế bào GS01 để đánh giá mức độ bất hoạt thông qua hình thành bệnh tích tế bào (CPE) Kết trình bày bảng Bảng Kết đánh giá mức độ bất hoạt NNV Nồng độ BEI Nồng độ beta -propiolactone Nồng độ formalin 0,2% 0,001M 0,002M 0,05% 0,1% 0,1% 65 15 35 NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nịng thơn - KỲ - THÁNG 3/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ I Kết bàng) cho thấy, hóa chẩt formaldehyde, beta - propiolactone BEI có khả gây bất hoạt xi rút NNV với nồng độ gây bất hoạt tưong ứng 0,2%, 0,1% 0,002M Tiếp tục đánh giá kihả nàng tạo kháng thể đặc hiệu vi rút bất hoại phương pháp ELISA cho kết hình làm giảm mức độ tạo đáp ứng miễn dịch Trong BEI beta - propiolactone với nồng độ tương ứng 0,002M 0,1% gây bất hoạt hồn tồn NNV đảm bảo tính kháng nguyên vi rút Tuy nhiên vi rút bất hoạt beta - propiolactone cho hiệu giá kháng thể cao thòi gian dài so với bất hoạt BEI Do vậy, beta - propiolactone 0,1% chọn làm hóa chất bất hoạt vi rút 3.3 FonnaKfi ■BLÍ Beta-pcopíơlactũne Hình Kết thực phản ứng ELISA phát kháng thể đặc niệu thỏ tiêm vi rút bất hoạt (OD450) Kết hình cho thấy, hiệu giá kháng thể đậc hiệu tạo từ vi rút bất hoạt với BEI beta - propiolactone cao đáng kể so vói vi rút bất hoạt với formalin Kết Irong hình bảng cho thấy, formaldehyde có khả bất hoạt vi rút Chọn lọc chất bổ trợ vắc xin Để sản xuất vắc xin phịng bệnh hoại tử thần kinh có hiệu quả, ngồi giống vi rút việc nghiên cứu xác định chất bổ trợ ổn định, phù họp với phương thức sử dụng đặc điểm sinh lý cá từ giai đoạn ấu trùng đến cá bột yếu tố định đến chất lượng sản phẩm đáp ứng yêu cầu sản xuất ứng dụng Trong nghiên cứu này, chủng NNV TB05 sử dụng dạng để gây đáp ứng miễn dịch, bao gồm: vi rút bất hoạt vi rút bất hoạt phối họp với chất bổ trợ aluminum hydroxide (AH) aluminum phosphate (AP), liều kháng nguyên sử dụng 106’8PFLĩ/ml Kết trình bày bảng Bảng Xác định mức độ an toàn vắc xin Tỷ lệ Tỷ lệ Loại vắc xin Biểu lâm sàng chết (%) sống (%) Hai ngày đầu sau xử lý vắc xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày NNV + AH 96 biểu binh thường Tăng trường cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Hai ngày đầu sau xử lý vắc xin cá ăn kém, bơi lội chậm chạp Các ngày NNV +AP 97 biểu bình thường Tăng trưởng cá không thay đổi so với lô đối chứng âm Đối chứng âm (không sử dụng Các hoạt động sinh lý biểu lâm sàng 98 vắc xin chất bổ trợ) bình thường STT Ị 1 Nhìn chung, lơ cá sử dụng vắc xin có chất bổ X 60 “Ầp trợ c° biểu giảm ăn, phản xạ bơi lội ĩ hai ngày đầu sau tiêm vắc xin Tuy nhiên, £ *0 cac ngày sau đó, hoạt động sinh lý cá trở lại bình ° ' 0,5 ĩ2 thường Kết chứng tỏ Vắc xin an tồn đối vói TCID TCID TCID TCTD TCID TCID cá thí nơhicm 50 50 50 50 50 50 llgllicill AP ■ ỉă Ss T So3 z í.33 ™ n^hiệrn đánh «iá khả năn*bả0 hêcủa vắc xin sau 15 ngày theo dõi sau cóng cường Hình So sánhmứcđ ộbảo hộ cá vói vắc xin vô hoạt độc Kết cho thấy> tỷ lệ cá sống sót lơ thí có chat 10 trợ khác nghiệm đối chứng tương đương hình " 80 M M 9 Ịta 91 99 99 99 9 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 3/2022 69 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ Kết thể hình cho thấy, tỷ lệ bảo hộ tương đối cá gây miễn dịch với kháng nguyên có bổ sung nhôm hydroxit nhôm phosphate cho khả bảo hộ cao vói liều 0,2 X TCID50, 0,5 X TCID50 X TCID50, tất lô thí nghiệm cho tỷ lệ bảo hộ 75% Kết thí nghiệm cho phép lựa chọn nhơm hydroxit làm chất bổ trợ vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nguyên bệnh, tuổi cá, đường đưa vắc xin, nhiệt độ môi trường nước trinh sử dụng vắc xin, kỹ thuật sử dụng Vắc xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại tử thần kinh thử nghiệm trại cá mú giống Trung tâm Quốc gia Giống hải sản miền Bắc Kết theo dõi cá thể bảng Kết bảng cho thấy tỷ lệ sống cá mơ hình thử nghiệm vắc xin cao so với 3.4 Đánh giá hiệu lực vắc xin mơ hình thực địaao/lồng ni đối chứng đạt từ 30% - 34%, đồng thòi tỷ Hiệu lực vắc xin phòng bệnh cho cá lệ tăng trọng cá mơ hình thử nghiệm vắc không phụ thuộc vào chất lượng kháng xin cao ao/lồng nuôi đối chứng từ 17% - 25% nguyên mà bị ảnh hưởng yếu tố khác Bảng Kết thử nghiệm vắc xin mơ hình thực địa Vắc xin Đối chứng khơng sử dụng vắc xin Loại hình ni Tỷ lệ tăng trọng bình Tỷ lệ tăng trọng bình RPS (%) RPS (%) qn/tháng (%) qn/tháng (%) Mơ hình ni lồng biển 65 125 35 100 72 Mơ hình ni ao đất 117 38 100 KẾT LUẬN Bước đầu nghiên cứu chế tạo thành công vắc xin vơ hoạt phịng bệnh hoại tử thần kinh cá mú điều kiện phịng thí nghiệm Chủng vi rút TB05 gây bất hoạt beta - propiolactone nồng độ 0,1% phối trộn với chất bổ trợ nhơm hydroxit an tồn với cá thí nghiệm hiệu bảo hộ 75% với cá mú giống đồng thời tỷ lệ sống mơ hình thử nghiệm tăng 30% - 34% TÀI UỆU THAM KHÀO Badi’n I, Souto s (2020) Betanodavirus and VER disease: a 30 - year rearch review Pathogens, 9, p 106 c Un, J H-Y lún, M s Chen, H L Yang (2007) An oral nervous necrosis virus vaccine that induces protective immunity in larvae of grouper (Epinephelus coioideầ) Aquaculture, 268, pp 265 - 273 Hu’sgar s, Grotmol s, Hjeltnes B K, Radseth o M, Biering E (2001) Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus, and evaluation of a vaccine against SJNNV Dieases ofAquatic Organisms, 45, pp 33 - 44 Jia p, Jia K T and Yi M s (2015) Complete genome sequence of a fish nervous necrosis virus isolated from sea perch (Lateolabrax japonicus) in China Genome Announcements, 3, e00048-15 70 Kai Y-H., Chi S-C (2008) Efficacies of inactivated vaccines against betanodavirus in grouper larvae (Epinephelus coioideầị by bath immunization Vaccine, 26, pp 1450 -1457 K Yuasa, I Koesharyani, D Roza, K Mori, M Katata, T Nakai (2002) Immune response of humpback grouper, Cromileptes altivelis (Valenciennes) injected with the recombinant coat protein of betanodavirus Journal of Fish Diseases, 25, pp 53 - 56 Lorenzen N, Lorenzen E, Einer - Jensen K, Heppell J, Davis HL (1999) Genetic vaccination of rainbow trout against viral haemorrhagic septicaemia virus: small amounts of plasmid DNA protect against a heterologous serotype VlrusRes 63 (1 - 2): 19 - 25 Mu Y, Lin K, Chen X and Ao J (2013) Diagnosis of nervous necrosis virus in orange spotted grouper, Epinephelus coioides by a rapid and convenient RT - PCR method Acta Oceanologica Sinica, 32, 88 - 92 Muniesa A, Basurco B, Aguilera c, Furones D, Reverte’, Sanjuan - Vilaplana A, Jansen M D, Brun E, Tavompanich s (2020) Mapping the knowledge of the main disease affecting sea bass and sea bream in Mediterranean Transbound Emerg Dis, pp -12 10 Pakingking Jr R, Bautista N B, de Jesus Ayson E G, Reyes o (2010) Protective immunity NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN NÔNG THÔN - KỲ - THÁNG 3/2022 KHOA HỌC CÔHG NGHỆ against viral nervous necrosis (VNN) in brown marbled grouper (Epinephelus fuscogutattus) following vavccination with inactivated betanodavirus Fish & Shellfish Immunology, 28, pp 525 - 533 11 Pascoli F, Serral M, Toson M, Pretto T and Toffan A (2016) Betanodavirus ability to infect juvenile European sea bass, Dicentrarchus labrax at different water salinity, journal of Fish Diseases, 39 (9), 1061-1068 12 Peducasse s, Calstric J, Thiery R, Jeffrey J, Le Ven A and Baudin Laurencin F (1999) Comparative study of viral encephe lopathy and retinopathy in juvenile sea bass Dice itrarchus labrax infected in different ways Diseases of Aquatic Organisms, 36, 11-20 13 Reed L J, Muench H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints The American Journal ofHygiene 21 ■ 493 - 497 14 Sommerset R, Skern E, Biering H, Bleie I, Fiksdal u, Grove s (2005) Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination Immunology, 18, pp 13 - 29 Fish & Shellfish 15 Tanaka s Mori K, Arimoto M, Iwamoto T, Nakai T (2001) Protective immunity of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunberg, against experimental viral nervous necrosis Journal ofFish Diseases, 24, pp.15 - 22 16 Thiery R, Cozien J, Gabon J, Lamour F, Baud M, Schneemann A (2006) Induction of a protective immune response against viral nervous necrosis in the European sea bass Dicentrarchus labrax by using betanodavirus virus like particles J Virol 80 (20): 10201 -10207 17 Yamashita H, Mori K, Kuroda A, Nakai T (2009) Neutralizing antibody levels for protection against betanodavirus infection in sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus (Thunberg), immunized with an inactivated virus vaccine Journal ofFish Diseases, 32, pp 767 - 775 18 Vimal s, Madan N, Farook M, Nambi K, Majeed s A, Rajkumar T (2014) Production of recombinant vaccine using capsid gene of nodavirus to protect Asian sea bass, Lates calcarifer (Bloch, 1790) Aquaculture, 418, pp 148 -154 DEVELOPMENT /iN INACTIVATED VACCINE TO PREVENT NERVOUS NECROSIS DISEASE IN GROUPER (Epinephelussọl) IN ALABORATORY SCALE Man Hong phuoc1'2, Pham Thi Tam2, Dong Van Quyen1, Vu Thi Bich Huyen3, Le Minh Hai4 institute ofBiotechnology, Vietnam Academy ofScience and Technology 2Ha Noi Open University 3Hanoi National University ofEducation 4Vinh University Summary Nervous necrosis is an acute disease that causes mass mortality of grouper in the juvenile, fingerlings adult stages This paper showed the results of a research to develop an inactivated vaccine to prevent nervous necrosis disease for farmed grouper in a laboratory scale TB05, a virus strain causing nervous necrosis disease was isolated from Thai Binh province, was selected as the strain for development of an inactivated vaccine; the virule ice of strain TB05 on cells and fingerlings is TCID50 = 1068 and LD50 = 107 5, respectively The vaccine was produced by growing strain TB05 in GS01 cells and then inactivated with beta propiolactone 0.1% and adsorbed with aluminum hydroxide By the immersion method, vaccine was safe for grouper from larvae stage to fingerlings 1.5 cm in length The relative protection rate of vaccine reached 75% with the challenge dose 0.2 X TCID50,0.5 X TCID50 and X TCID50 This results provide a scientific basis for the production of vaccine to prevent grouper from nervous necrosis disease, helping to sustainably develop grouper fc rming in Vietnam Keywords: Vaccin -‘S, nervous necrosis disease, challenge dose, prevent, grouper Người phản biện: TS Nguyễn Thị Thanh Thùy Ngày nhận bài: 4/01/2022 Ngày thông qua phản biện: 8/02/2022 Ngày duyệt đăng: 15/02/2022 NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nịng thơn - KỲ - THÁNG 3/2022 71 ... vắc xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nguyên bệnh, tuổi cá, đường đưa vắc xin, nhiệt độ môi trường nước trinh sử dụng vắc xin, kỹ thuật sử dụng Vắc xin bất hoạt keo phèn phòng bệnh hoại. .. 117 38 100 KẾT LUẬN Bước đầu nghiên cứu chế tạo thành công vắc xin vô hoạt phòng bệnh hoại tử thần kinh cá mú điều kiện phịng thí nghiệm Chủng vi rút TB05 gây bất hoạt beta - propiolactone nồng... sàng tỷ lệ sống cá sau sử dụng vắc xin Tỷ lệ sống tính theo cơng thức: Tỷ lệ sống = (1 - tỷ lệ tử vong cá tiêm vắc xin/ tỷ lệ tử vong cá không tiêm vắc xin) X 100 + Hiệu lực vắc xin đánh giá phương