Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của vi khuẩn nội sinh và cao chiết từ cây dược liệu sâm đại hành (eleutherine subaphylla gagnep)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN NỘI SINH VÀ CAO CHIẾT TỪ CÂY DƢỢC LIỆU SÂM ĐẠI HÀNH (Eleutherine subaphylla Gagnep) KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS Dƣơng Nhật Linh SVTH: Lê Thị Mai Thảo MSSV: 1153010749 Niên khóa: 2011 - 2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 GVHD: ThS D KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NG NHẬT LINH LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt năm vừa qua Em xin gửi lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến cô Dương Nhật Linh tận tình hướng dẫn, bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt suốt thời gian thực đề tài Em xin cảm ơn chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh chị phòng thí nghiệm ủng hộ, giúp đỡ em lúc làm đề tài Bên cạnh đó, xin cảm ơn bạn tôi, bạn nhóm làm đề tài em sinh viên học việc phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh quan tâm, giúp đỡ trình thực đề tài Cuối xin cảm ơn Ông Bà, Cha Mẹ, cảm ơn gia đình bên con, tạo điều kiện tốt để hoàn thành việc học Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất người thầy, người cô đáng kính khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học mở thành phố Hồ Chí Minh, xin chúc thầy cô ngày gặt hái nhiều thành công Xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực Lê Thị Mai Thảo SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep.) Hình Kết vòng kháng khuẩn, kháng nấm phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 31 Hình Phân lập vi khuẩn nội sinh đĩa TSA 48 Hình Hình ảnh quan sát đại thể vi thể số chủng vi khuẩn nội sinh 49 Hình 3 Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh E coli 52 Hình Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh S aureus 53 Hình Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi khuẩn gây bệnh S typhi 54 Hình Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh T rubrum 58 Hình Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh T mentagrophytes .58 Hình Kết thử đối kháng vi khuẩn nội sinh với vi nấm gây bệnh M gypseum .59 Hình Kết thử hoạt tính kháng khuẩn cao chiết từ củ sâm đại hành 67 Hình 10 Kết thử hoạt tính kháng nấm cao chiết từ củ sâm đại hành .70 Hình 11 Kết MIC cao chiết từ củ sâm đại hành dung môi chloroform 73 Hình 12 Kết MIC cao chiết từ củ sâm đại hành dung môi methanol 74 Hình 13 Kết MIC cao chiết từ củ sâm đại hành dung môi methanol 75 Hình 14 Kết MIC cao chiết từ củ sâm đại hành dung môi ethanol 75 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH DANH MỤC BẢNG Bảng Kết quan sát đại thể vi thể chủng vi khuẩn nội sinh .46 Bảng Kết định tính khả kháng khuẩn gây bệnh vi khuẩn nội sinh 50 Bảng 3 Kết định lượng khả kháng khuẩn gây bệnh vi khuẩn nội sinh 55 Bảng Kết định tính khả kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh 56 Bảng Kết đường kính vòng kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh 60 Bảng Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh TC20 61 Bảng Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn nội sinh TL19 62 Bảng Khối lượng cao chiết thu dung môi khác .63 Bảng Kết số lượng nấm vi khuẩn sống có cao chiết 64 Bảng 10 Kết đường kính vòng kháng khuẩn cao chiết từ củ sâm đại hành 65 Bảng 11 Kết đường kính kháng nấm cao chiết từ củ sâm đại hành 67 Bảng 12 Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết từ củ sâm đại hành chủng vi sinh vật gây bệnh 71 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Quy trình thí nghiệm 26 Sơ đồ 2 Quy trình chuẩn bị chiết xuất cao dược liệu 32 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Ảnh hưởng dung môi đến khối lượng cao chiết 63 Biểu đồ So sánh kết kháng khuẩn loại cao chiết từ củ sâm đại hành 66 Biểu đồ 3 So sánh kết kháng nấm loại cao chiết từ củ sâm đại hành 68 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit- đơn vị hình thành khuẩn lạc Cs Cộng DMSO Dimethyl sulfoxid E coli Escherichia coli MHA Muller Hinton Agar M gypseum Microsporum gypseum MIC Minimum Inhibtory Concetration - Nồng độ ức chế tối thiểu NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa PDA Potato Dextrose Agar S aureus Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar SE Standard Error S typhi Salmonella typhi TSA Trypticase Soy Agar T rubrum Trichophyton rubrum T mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH III DANH MỤC BẢNG IV DANH MỤC SƠ ĐỒ V DANH MỤC BIỂU ĐỒ V DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI MỤC LỤC VII ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.2 S L ỢC VỀ VI SINH VẬT NỘI SINH 1.1.1 Phân loại vi sinh vật nội sinh 1.1.2 Nguồn gốc, phân bố đa dạng sinh học vi sinh vật nội sinh S L ỢC VỀ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH ( ELEUTHERINE SUBAPHYLLA GAGNEP ) 1.3 1.4 1.2.1 Phân loại khoa học 1.2.2 Mô tả 1.2.3 Phân bố, thu hái chế biến 1.2.4 Thành phần hóa học 1.2.5 Tác dụng dược lý 1.2.6 Công dụng 10 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG N ỚC 10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 12 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NG ỜI 13 1.4.1 Staphylococcus aureus 13 1.4.2 Escherichia coli 14 1.4.3 Salmonella typhi 15 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.4.4 1.5 1.6 GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Pseudomonas aeruginosa 15 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN NG ỜI 16 1.5.1 Dermatophytes 16 1.5.2 Chi Trichophyton 17 1.5.3 Chi Microsporum 18 1.5.4 Chi Epidermophyton 19 KHÁI QUÁT VỀ PH NG PHÁP CHIẾT CAO D ỢC LIỆU 19 1.6.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) 20 1.6.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 20 1.6.3 Kỹ thuật chiết Sohxlet 21 1.6.4 Cô đặc sấy khô 22 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 24 2.2 VẬT LIỆU 24 2.3 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, môi trường 24 PH NG PHÁP THÍ NGHIỆM 25 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 25 2.3.2 Phương pháp phân lập vi khu n nội sinh 27 2.3.3 Phương pháp khảo sát khả kháng khu n, kháng nấm vi khu n nội sinh 28 2.3.4 Phương pháp chiết xuất cao từ củ sâm đại hành 31 2.3.5 Xác định giới hạn nhiễm khu n cao chiết 33 2.3.6 Định tính khả kháng khu n, kháng nấm cao chiết 34 2.3.7 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao chiết với vi khu n vi nấm gây bệnh 34 2.4 ĐỊNH DANH VI KHUẨN NỘI SINH BẰNG TEST SINH HÓA 36 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY 46 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.2 GVHD: ThS D NG NHẬT LINH KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TỪ CÂY SÂM ĐẠI HÀNH 46 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH 50 3.3.1 Kết định tính khả kháng khu n vi khu n nội sinh 50 3.3.2 Kết định tính khả kháng nấm vi khu n nội sinh 56 3.4 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH SINH HÓA CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH 61 3.5 KHẢO SÁT ẢNH H ỞNG CỦA DUNG MÔI CHIẾT ĐẾN KHỐI L ỢNG CAO CHIẾT THU Đ ỢC TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH 62 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết đến khối lượng cao chiết 62 3.5.2 3.6 Kết thử giới hạn nhiễm khu n cao chiết 64 KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA CAO CHIẾT TỪ CỦ SÂM ĐẠI HÀNH 64 3.6.1 Kết định tính khả kháng khu n cao chiết từ củ sâm đại hành 64 3.7 3.6.2 Kết định tính khả kháng nấm cao chiết từ củ sâm đại hành 67 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CHIẾT 70 3.8 THẢO LUẬN 76 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 KẾT LUẬN 79 4.2 ĐỀ NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 88 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO ix KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 2.3 Hình ảnh định danh chủng vi khuẩn nội sinh TL19 TC20 Thử nghiệm phân giải casein SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO Thử nghiệm phân giải tinh bột 95 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Catalase SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Oxidase 96 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 97 GVHD: ThS D KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NG NHẬT LINH PHỤ LỤC Kết xử lý thống kê 3.1 Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố khối lƣợng cao chiết thu đƣợc dung môi chiết khác phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 98 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 3.2 Kết sử lý thống kê ANOVA yếu tố đƣờng kính vòng kháng vi khuẩn gây bệnh vi khuẩn nội sinh sâm đại hành phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đƣờng kính vòng kháng E coli (mm) SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 99 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng S aureus (mm) SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 100 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng S typhi (mm) SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 3.3 Kết sử lý thống kê ANOVA yếu tố đƣờng kính vòng kháng vi nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh sâm đại hành phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đƣờng kính vòng kháng nấm T rubrum SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 102 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng nấm T metagrophytes SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 103 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng nấm M gypseum SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 104 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 3.4 Kết sử lý thống kê ANOVA yếu tố đƣờng kính vòng kháng vi khuẩn gây bệnh cao chiết từ sâm đại hành phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đƣờng kính vòng kháng S aureus SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 105 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng S typhhi SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 106 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS D NG NHẬT LINH 3.5 Kết sử lý thống kê ANOVA yếu tố đƣờng kính vòng kháng vi nấm gây bệnh cao chiết từ sâm đại hành phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0  Kết đƣờng kính vòng kháng nấm T rubrum SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 107 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng nấm T mentagrophytes SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 108 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  GVHD: ThS D NG NHẬT LINH Kết đƣờng kính vòng kháng nấm M gypseum SVTH: LÊ THỊ MAI THẢO 109 ... nội sinh, nên tiến hành thực đề tài Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm vi khuẩn nội sinh cao chiết từ dƣợc liệu sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep) Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính. .. tính kháng vi khuẩn vi nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh cao chiết từ dược liệu Eleutherine subaphylla Gagnep Từ đó, chọn chủng nội sinh dung môi cho cao chiết có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao. .. cao Nội dung thực bao gồm:  Phân lập khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm gây bệnh vi khuẩn nội sinh dược liệu sâm đại hành (Eleutherine subaphylla Gagnep)  Chiết xuất cao dược liệu từ