Chủ đề 6 Thiết kế quy trình nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh vật đa chức năng dùng cho cây đậu nành(cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh).

Hiện nay có rất nhiều dạng phân bón khác nhau đã được sử dụng trong nông nghiệp như: Phân hoá học dưới dạng đa lượng hoặc vi lượng, phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh.Trong những năm gần đây, ở nhiều nước trên thế giới, người ta đã tổ chức sản xuất công nghiệp một số loại phân vi sinh vật và đem bán ở thị trường trong nước. Một số loại phân vi sinh vật được bán rộng rãi trên thị trường thế giới. Tuy nhiên, các loại phân vi sinh vật còn rất ít và chỉ là bộ phận nhỏ so với phân hoá học trên thị trường phân bón. Ở Việt Nam, phân VSV cố định đạm cây họ đậu và phân VSV phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 và đến năm 1987 phân Nitragin trên nền chất mang than bùn mới được hoàn thiện và đến năm 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật. Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số VSV phân giải lân. Phân bón vi sinh vật được sản xuất bằng cách nhân sinh khối VSV trong môi trường và điều kiện thích hợp để đạt được một mật độ nhất định sau đó xử lý bảo quản và đưa đi sử dụng trực tiếp hoặc phối trộn với cơ chất hữu cơ tạo sản phẩm phân hữu cơ vi sinh vật. Trong khuôn khổ các đề tài nghiên cứu thuộc chương trình công nghệ sinh học giai đoạn 1991-2000 Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam đã phối kết hợp cùng gần 20 cơ quan nghiên cứu, giảng dạy và công ty chuyên ngành đã xây dựng và triển khai thành công các qui trình sản xuất phân vi sinh vật cố định nitơ, phân vi sinh vật phân giải lân, phân vi sinh vật hỗn hợp cố định nitơ và phân giải lân.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Lớp SH11 GVHD: ThS Nguyễn Văn Minh Chủ đề Thiết kế quy trình nghiên cứu sản xuất phân vi sinh vật đa chức dùng cho đậu nành(cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh) Danh sách nhóm: Nguyễn Hồng Huy Khơi Hồ Giang Trúc Loan Đào Thị Ngân Phạm Thị Kim Ngân Nguyễn Như Ngọc Võ Thị Ngọt Dương Thị Thu Thảo Nguyễn Thị Quang Đinh Thái Hòa 1153010365 1153010423 1153010512 1153010515 1153010528 1153010536 1153010745 1053010612 1153010268 MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU I./ Đặt vấn đề II./ Tổng quan tình hình sản xuất sử dụng phân vi sinh .2 PHẦN II: NỘI DUNG I./ Sơ lược đậu tương II./ Phân vi sinh vật đa chức 1./ Vi sinh vật cố định đạm 2./ Vi sinh vật phân giải lân 3./ Vi sinh vật kích thích tăng trưởng 11 4./ Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh 13 5./ Quy trình sản xuất phân 15 PHẦN I: MỞ ĐẦU I./ Đặt vấn đề Trong sản xuất nông nghiệp, phân bón đóng vai trị quan trọng định chất lượng sản lượng thu hoạch Hiện có nhiều dạng phân bón khác sản xuất sử dụng nông nghiệp như: Phân hoá học đa lượng vi lượng: Phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh Ngành nông nghiệp nước ta chủ yếu sử dụng phân bón hóa học canh tác sản xuất Tuy nhiên sử dụng không cách, lạm dụng loại phân bón thuốc trừ sâu hóa học làm tăng dư lượng chất hóa học gây nhiễm mơi trường đất, môi trường nước ảnh hưởng đến sinh vật người đồng thời làm đất canh tác bị bạc màu nhanh chóng Dưới tác động việc đẩy mạnh cơng nghiệp hóa đại hóa đất nước góp phần làm diện tích đất nơng nghiệp ngày giảm Chính để tăng suất, sản lượng trồng đồng thời phải đảm bảo môi trường phát triển bền vững vấn đề cấp thiết Cùng với chất hữu cơ, vi sinh vật sống đất, nước vùng rễ có ý nghĩa quan trọng mối quan hệ trồng, đất phân bón Hầu q trình xảy đất có tham gia trực tiếp gián tiếp vi sinh vật (mùn hoá, khống hố chất hữu cơ, phân giải, giải phóng chất dinh dưỡng vơ từ hợp chất khó tan tổng hợp chất dinh dưỡng từ môi trường ) Phân bón vi sinh Noble Hiltner sản xuất Đức (1896) đặt tên Nitragin Sau phát triển sang số nước khác Mỹ (1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) Thụy Điển (1914) Phân đạm vi sinh, phân vi sinh hỗn hợp, phân vi sinh vật phân giải phosphate khó tan có khả chuyển hố hợp chất phospho khó tan thành dễ tiêu cho trồng sử dụng, góp phần nâng cao suất chất lượng nông phẩm, không gây hại đến sức khoẻ người, động thực vật không ảnh hưởng xấu đến môi trường sinh thái Phân bón vi sinh dựa vào chủng vi sinh vật phân giải chất hữu bùn, phế thải, rác thải, phế phẩm công nông nghiệp,… tạo sinh khối, sinh khối tốt cho cho đất, giúp cải tạo làm đất tơi xốp II./ Tổng quan tình hình sản xuất sử dụng phân vi sinh Hiện có nhiều dạng phân bón khác sử dụng nơng nghiệp như: Phân hố học dạng đa lượng vi lượng, phân hữu cơ, phân sinh học, phân vi sinh.Trong năm gần đây, nhiều nước giới, người ta tổ chức sản xuất công nghiệp số loại phân vi sinh vật đem bán thị trường nước Một số loại phân vi sinh vật bán rộng rãi thị trường giới Tuy nhiên, loại phân vi sinh vật cịn phận nhỏ so với phân hoá học thị trường phân bón Ở Việt Nam, phân VSV cố định đạm họ đậu phân VSV phân giải lân nghiên cứu từ năm 1960 đến năm 1987 phân Nitragin chất mang than bùn hoàn thiện đến năm 1991 có 10 đơn vị nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học phân lập nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm số VSV phân giải lân Phân bón vi sinh vật sản xuất cách nhân sinh khối VSV mơi trường điều kiện thích hợp để đạt mật độ định sau xử lý bảo quản đưa sử dụng trực tiếp phối trộn với chất hữu tạo sản phẩm phân hữu vi sinh vật Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu thuộc chương trình cơng nghệ sinh học giai đoạn 1991-2000 Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam phối kết hợp gần 20 quan nghiên cứu, giảng dạy công ty chuyên ngành xây dựng triển khai thành công qui trình sản xuất phân vi sinh vật cố định nitơ, phân vi sinh vật phân giải lân, phân vi sinh vật hỗn hợp cố định nitơ phân giải lân Sản phẩm phân bón VSV hội đồng khoa học nghiệm thu, đánh giá công nhận tiến kỹ thuật Để sản xuất phân vi sinh đa chức ta cần tuyển chọn chủng vi sinh vật có đủ khả năng: cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, đối kháng nấm bệnh có ảnh hưởng tốt đến trồng Vì ngồi hoạt tính tốt nhiều chủng vi sinh vật cịn có hoạt tính sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển suất trồng Chính sau đánh giá khả chủng vi sinh vật dùng để sản xuất phân ta cần phải đánh giá ảnh hưởng chúng đến đối tượng trồng sử dụng Chỉ sử dụng chủng vi sinh vật vừa có hoạt tính tốt vừa không gây ảnh hưởng xấu đến trồng mơi trường sinh thái Ngồi tiêu quan trọng ta cịn phải đánh giá đặc tính sinh học như: thời gian mọc; kích thước tế bào, khuẩn lạc; khả thích ứng pH; khả cạnh tranh Để tạo loại phân vi sinh mang đặc tính tốt PHẦN II: NỘI DUNG I./ Sơ lược đậu tương Phân loại Cây đậu tương hay đỗ tương, đậu nành (tên khoa học Glycine max) loại họ Ðậu (Fabaceae), đặc điểm hạt đậu tương giàu hàm lượng protein, thực phẩm quan trọng cho người gia súc Trên giới có 1,000 loại đậu tương với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu tương có kích thước nhỏ hạt đậu Hà lan (pea) lớn giống trái anh đào (cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc đỏ, vàng, xanh, nâu màu đen Trong ngũ cốc, đậu tương đánh giá cao Điều kiện sống - Đất: Cây đậu tương không yêu cầu nghiêm khắc đất trồng, đất thích hợp đậu tương loại đất có tầng canh tác sâu, giàu chất hữu cơ, canxi, kali pH (độ chua) trung tính, mực nước ngầm sâu, giữ ẩm tốt, dễ thoát nước Đậu tương chịu mặn chua nhiều trồng khác, độ pH thích hợp 6,0-7,0 - Nước: Ở giai đoạn nảy mầm con, tỷ lệ sử dụng nước thấp Nhu cầu nước đậu tương tăng dần giai đoạn từ 3-5 kép, tăng nhanh cao giai đoạn từ hoa đến vào - Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nở hoa đậu 25-28oC, ẩm độ khơng khí 7580%, ẩm độ đất 70-80% Nhu cầu dinh dưỡng Có 16 nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng phát triển triển đậu tương Trong đó, nguyên tố Carbon (C), Hydro (H) Oxy (O) thành phần chủ yếu chất khô hấp thụ dạng CO2, H2O O2 tự khơng khí Những ngun tố cần thiết khác N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Mn Mo, Cu, B, Zn Cl Bên cạnh Coban (Co) nguyên tố cần thiết cho việc cố định đạm (N) coi nguyên tố cần thiết (Ngô Thế Dân cs, 1999) Cây đậu tương phản ứng phân đạm, nhiên bón phân đạm làm tăng suất, tỷ lệ đạm hạt hàm lượng protein chứng tỏ cố định N2 không đủ để cung cấp cho Lân đóng vai trị quan trọng hình thành phát triển nốt sần đậu tương Kali (K) tích lũy lá, đỉnh sinh trưởng hạt tăng lên bón kali tăng, kali (K) cần cho phát triển nốt sần Theo Giáo sư Đỗ Ánh (1965) đậu tương tỷ lệ Ca: P: K tối thích 2: l: 1,5 Đậu tương hấp thụ lân photphat khó tan AlPO4, FePO4 Đậu tương có nhu cầu cao với S, bón thêm S tăng suất đậu Trên đất chua, bón vơi cần thiết Bón vơi có tác dụng giảm nồng độ chất độc hại như: sắt (Fe), nhôm (Al), mangan (Mn) đồng thời cung cấp dinh dưỡng caxi cho Vai trò nguyên tố vi lượng thường thể rõ hay không tùy thuộc vào đặc tính đất Trên đất giàu caxi (Ca) có tượng thiếu sắt (Fe), phun phân bón có chứa chất vi lượng hịa tan dạng chellat bổ sung thiếu hụt này, mangan cần cho đậu tương đất dư thừa bón nhiều có tượng ngộ độc mà cụ thể biến dạng, màu vàng có mơ bị chết Khi pH đất phạm vi 5,8 - 6,7; xử lý hạt với muối mo làm tăng suất đậu Đậu tương có nhu cầu cao với vi lượng bo (B), đồng (Cu) kẽm (Zn) II Phân vi sinh vật đa chức Trên sở tính tác dụng chủng loại VSV sử dụng, phân bón VSV cịn gọi tên: - Phân VSV cố định nitơ (phân đạm vi sinh) chứa VSV sống cộng sinh với đậu, hội sinh vùng rễ trồng cạn hay tự đất, nước có khả sử dụng N từ khơng khí tổng hợp thành đạm cung cấp cho đất trồng - Phân VSV phân giải hợp chất phosphate khó tan (phân lân vi sinh) sản xuất từ VSV có khả chuyển hố hợp chất phosphate khó tan thành dễ tiêu cho trồng sử dụng - Phân VSV kích thích, điều hồ sinh trưởng thực vật chứa VSV có khả sản sinh hoạt chất sinh học có tác dụng điều hồ, kích thích q trình trao đổi chất - Phân VSV chức sản phẩm có chứa khơng VSV làm phân bón cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng thực vật mà cịn có loại VSV có khả ức chế, tiêu diệt VSV gây bệnh trồng Vi sinh vật cố định đạm Đạm nguyên tố khoáng quan trọng dinh dưỡng trồng Năng suất trồng phụ thuộc lớn vào lượng đạm cung cấp cho Cố dịnh nitơ q trình khử nitơ khơng khí(N2) thành dạng đạm ammoni(NH3) Năm 1886, Hellriegel Wilfath phát họ đậu có khả cố định đạm từ khơng khí Năm 1889, vi khuẩn cộng sinh nốt sần họ đậu xếp vào chi Rhizobium Đa phần nòi thuộc Rhizobium phát triển pH thích hợp từ 6,5-7, pH 8, sinh trưởng chúng bị cản trở Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn nằm khoảng từ 2426oC Trên 37oC, sinh trưởng chúng bị đình 2.Vi sinh vật phân giải lân đối kháng nấm bệnh 2.1Phân giải lân 2.1.1 Các dạng lân chuyển hóa lân Các dạng lân Lân hay phospho yếu tố cần thiết cho trồng Lượng lân dễ tiêu đất thường không đáp ứng nhu cầu trồng có suất cao Bón phân lân tăng cường độ hồ tan dạng lân khó tiêu đất biện pháp quan trọng sản xuất nông nghiệp Bón phân hữu cơ, xác động vật vào đất mức độ định biện pháp tăng hàm lượng lân cho đất Lân đất gồm dạng chính: Lân hữu Lân hữu có thể động vật, thực vật, vi sinh vật thường gặp hợp chất chủ yếu phytin (phytin chất họ hàng: inositol, inositolmonophosphate, inositoltriphosphate), phospholipit, axit nucleic Trong khơng bào người ta cịn thấy lân vơ dạng octhophosphate làm nhiệm vụ đệm chất dự trữ Cây trồng, vi sinh vật trực tiếp đồng hoá lân hữu Muốn đồng hoá chúng phải chuyển hố thành dạng muối H3PO4 Lân vơ Lân vơ thường dạng khống apatit, phosphoric, phosphate sắt, phosphate nhôm Muốn trồng sử dụng phải qua chế biến, để trở thành dạng dễ tan Nhờ vi sinh vật lân hữu vơ hố biến thành muối axit phosphoric Các dạng lân phần sử dụng, biến thành lân hữu cơ, phần bị cố định dạng lân khó tan Ca3(PO2)2, FePO4, AlPO4 Những dạng khó tan mơi trường có pH thích hợp, với tham gia vi sinh vật chuyển hố thành dạng dễ tan 2.1.2 Sự chuyển hóa lân Trong đất thường tồn vi sinh vật có khả hoà tan lân Các vi sinh vật nhà khoa học đặt tên cho chúng là: HTL (hoà tan lân, tên tiếng anh PSM – phosphate solubilizing microorganisms) 2.2Vi sinh vật đối kháng nấm bệnh 2.2.1 Các loại nấm, bệnh thường gặp đậu tương 2.2.1 Bệnh thối thân Thối thân (Brown Stem Rot) gây nên nấm phialophoria Đây loại nấm sản xuất tới độc tố có tên gregation A, C D Đầu tiên, xuất nốt nhỏ, sau dày lan rộng thân vùng gốc bắt đầu biến màu nâu đen, vàng rụng thể nặng làm cho đậu tương bị chết 2.2.2 Bệnh tàn lụi vi khuẩn Bệnh tàn lụi (Bacterial Blight) gây nên khuẩn Pseudomonas PV syringae Ban đầu khuẩn xuất khơng khí, đất sau thâm nhập vào vào mơ thân Cây lây nhiễm khuẩn thường cịi cọc, chậm lớn chết thể nặng, xuất đốm nhỏ, sau chuyển sang màu vàng đen làm cho rụng, cuống thân bị tổn thương dẫn đến tình trạng chết giảm suất đậu tương 2.2.3 Bệnh đốm nấm Secrostora Đây bệnh gây hại cho tất phận mặt đất đậu tương Ngồi gây bệnh đốm lá, nấm Secrostora cịn gây nhiều bệnh khác bệnh thối thân, bệnh trắng thân gặp nhiều loại hoa màu khác bắp cải, súp lơ, cà chua vào giai đoạn hình thành nụ thu hoạch Nếu khống chế bệnh suất đậu tương tăng 50-60% 2.2.4 Bệnh rỉ Do nấm Phakopsora pachyrhizi Sydow; Phakopsora sojae Sawada Vết bệnh nhô lên hai mặt lá, làm cho bị khô cháy, dần khả quang hợp 2.2.5 Bệnh đốm phấn Do nấm Peronospora manshurica (Naumov) Sydow Bệnh công chủ yếu lá, trái hạt, làm khô rụng sớm, trái hạt không phát triển 2.2.6 Bệnh chấm đỏ Do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv phaseoli ( Smith ) Dowson Bệnh xảy lá, thân, cành trái, chủ yếu làm rụng hết 2.2.7 Bệnh cháy nhũn Do nấm Rhizoctonia solani Kuhn, giai đọan sinh sản hữu tính Thanatephorus cucumeris thuộc lớp nấm Đãm Bệnh làm lá, cành, trái rụng sớm, sinh trưởng 2.2.8 Bệnh héo con, héo khơ Bệnh nấm Rhizoctonia solani Kuhn Bệnh công suốt giai đoạn sinh trưởng cây, thường gây thiệt hại nặng cho Khảo sát Bacillus Subtilis: Hình 1.Bacillus subtilis Khái quát chung Bacillus Subtilis: Bacillus subtilis phát lần phân ngựa (1941) Tổ chức y học Nazi Đức Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc đường ruột, chúng phân bố hầu hết tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước… Đặc điểm phân bố Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc đường ruột, chúng phân bố hầu hết tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất nước… Phần lớn chúng tồn đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 100 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng sa mạc, đất hoang Bacillus subtilis Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis vi khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 μm x 1,8 – μm, đứng thành chuỗi ngắn đơn lẻ, di động, - 12 lông Sinh bào tử nhỏ vi khuẩn nằm tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 μm Phát triển cách nảy mầm nứt bào tử, không kháng acid, có khả chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ…(Tơ Minh Châu, 2000) B subtilis có khả tổng hợp 20 loại kháng sinh khác nhau: subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin,chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin,… với đặc tính kháng khuẩn kháng nấm hữu ích Subtilin Subtilin có khả chịu nhiệt cao, khơng hoạt tính hấp autoclave pH 2, tác động ức chế phát triển vi sinh Subtilosin Subtolosin bacteriocin có tính kháng khuẩn mạnh Listeria monocytogenes Bacillus cereus Sublancin Sublancin không tác động với vi khuẩn gram âm có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn gram Sublancin bacteriocin bền, bảo quản nhiệt độ thường thời gian năm khơng hoạt tính TasA TasA có phổ kháng khuẩn rộng tổng hợp tiết vào môi trường 30 phút sau trình tạo bào tử bắt đầu, đồng thời TasA chuyển vào lớp màng kép tiền bào tử sau định vị lớp petidoglycan vách lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ưu trình tạo bào tử nảy mầm Surfactin Surfactin có tính đối kháng mạnh với vi khuẩn , virut Tác động surfactin làm ức chế kênh chuyển ion lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tính số enzyme Bacilysocin Bacilysocin kháng sinh có chất phospholipid có tính kháng khuẩn mạnh với nấm phát Bacillus subtilis 10 Tính đối kháng Bacillus subtilis Với vi sinh vật gây bệnh Hình thức đối kháng chủ yếu Bacillus subtilis vi sinh vật gây bệnh cạnh tranh dinh dưỡng tiết kháng sinh Thực tế ni cấy nấm bệnh có diện Bacillus subtilis với số lượng lớn xảy cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống vi khuẩn nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh (trong 24 giờ) sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng môi trường, đồng thời tạo số loại kháng sinh nên sinh trưởng nấm bị ức chế Với đồng loại Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis tạo chất kháng sinh giết chết tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu trình nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ tế bào với mục đích kéo dài thời kỳ trước tạo bào tử Tác dụng phân giải lân Bacillus subtilis Năm 1992, Mikio Shimizu cộng tiến hành tinh chế mô tả enzyme phytase từ Bacillus subtilis (natto) N-77, enzyme phân giải phytin thành phần lân hữu Bacillus subtilis có khả phân giải lân Đặc điểm nuôi cấy Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC Nhu cầu O2: Bacillus subtilis vi khuẩn hiếu khí có khả phát triển môi trường thiếu oxy Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp với pH = 7,0 – 7,4 Mơi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc có dạng hình trịn, rìa cưa khơng đều, có tâm sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính - 5mm Sau 1- ngày bề mặt nhăn nheo màu sẩm Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa gợn sóng Mơi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại vẩn mây đáy, khó tan lắc lên Dinh dưỡng: cần nguyên tố C, H, O, N nguyên tố khác 11 Vi khuẩn kích thích tăng trưởng phương pháp sinh tổng hợp IAA khả cố định đạm,hòa tan lân Khảo sát vi khuẩn Azospirillum lipoferum 3.1 Sơ lược Vi khuẩn Azospirillum sp (hình 2) thuộc chi Rhodosprillales.là loài vi khuẩn cố định đạm diện rễ, vùng đất xung quanh rễ, thân trồng Chúng sống tự đất hay cộng sinh với rễ loại ngũ cốc, cỏ có củ Hình Chủng vi khuẩn Azospirillumsp 12 Azospirillum lipoferum (Hình 3) loại vi khuẩn gram âm, hình que cong hình chữ S, chiều rộng - 1,5 mm chiều dài 2,0 - 3,0 mm Chiên mao chúng có vành lơng rung với bước sóng ngắn dùng để tạo thành tập đoàn di chuyển chiên mao dùng để bơi lội môi trường lỏng Hình Azospirillum lipoferum 3.2.Khảo sát đặc tính tốt vi khuẩn Azospirillum lipoferum áp dụng lúa Mười hai chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum xác định kĩ thuật PCR đối tượng dc khảo sát khả cố định đạm sinh học,hòa tan lân khó tan sinh tổng hợp IAA 3.2.1.Khả cố định đạm vi khuẩn phương pháp ARA Các chủng vi khuẩn Azospirillum lipoferum nuôi môi trường Nfb khơng có bổ sug ammonium ngày máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Các hột lúa Nàng Thơm Chợ Đào lột vỏ trấu tay khử trùng với cồn 70% phút nước oxi già 6% phút,rửa lại nước cắt vơ trùng,sau gieo mơi trường agar (1%) ngày có rễ non xuất vài mm,dùng kẹp chuyển hột lúa vào nghiệm 18 Ml chứa ml môi trường bán đặc, chủng 0,1 ml dung dịch vi khuẩn ( >109 tế bào/ ml),đậy nút gòn,đặt giá để dàn đèn Klux chế độ 16 sáng/8 tối tuần Sau dùng nút cao su đăc chủng đậy kín miệng ống nghiệm,dùng kim bơm 1ml khí acetylen tinh khiết, sau 24h rút lấy 1ml khí ống nghiệm để phân tích lượng 13 Ethylen máy LC-MS 3.2.2.Khả tổng hợp Indole-3-acetic acid (IAA) Vi khuẩn nuôi 25ml môi trường Nfb (>109 tế bào/ ml) bổ sung 100mg tryptophan/lít bình tam giác 100ml, lấy 1ml dịch vi khuẩn vào thời điểm 2, 10 ngày sau ni, ly tâm 13.000 vịng/ phút, lấy dịch để đo lượng IAA tổng hợp phương pháp so màu Salkowsky phương pháp Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (chỉ đo vào thời điểm 10 ngày sau ni) Số liệu thí nghiệm phân tích phần mềm Excel 2003 trị số trung bình nghiệm thức đánh giá khác biệt LSD.01 3.2.2.Khả hòa tan lân khó tan Vi khuẩn Azospirillum lipoferum ni 100ml mơi trường Pikovskaya với 5g apatit/lít bình tam giác 250ml 20 ngày để khảo sát khả hòa tan lân khó tan chủng vi khuẩn cách đo lượng lân hòa tan (P2O5) với phương pháp so màu (Oniani) - Kết luận: Thông qua kết khảo sát đăc tính tốt vi khuẩn Azospirillum lipoferum áp dụng lúa, từ chọn lọc đặc tính tốt để cố định đạm hữu hiệu cao,hịa tan lân khó tan nhiều tổng hợp lượng IAA đủ cung cấp cho đậu nành _ Vấn đề: A.lipoferum cộng sinh rễ lúa môi trường ngập nước, đậu tương thực vật cạn _ Ý tưởng: Azospirillum lipoferum 4B biến thể A.lipoferum có khả sống mơi trường đất (phát sinh roi bên) Hiện khảo sát 3.3 Tối ưu hóa mơi trường cho vi khuẩn Azospirillum lipoferum - - Sinh trưởng tốt 30oC Nhiệt độ tối ưu cho phát triển khoảng 35 - 37oC pH từ 6,0 - 7,0 Sự sinh trưởng phát triển chúng xảy hai điều kiện hiếu khí yếm khí (khử nitơ) thích hợp điều kiện vi hiếu khí với có khơng có đạm mơi trường (Dobereiner Pedrosa, 1987) Khuẩn lạc chúng môi trường agar khoai tây, có màu hồng nhạt hay đậm Vi khuẩnAzospirillum lipoferum phát triển tốt mơi trường có muối hữu malate, succinate, lactate hay pyruvate 14 Vi khuẩn không sử dụng đường đơn mà sử dụng đường fructose đường đa khác làm nguồn carbon chúng Thử đối kháng: Sau sàng lọc chủng vi khuẩn: - Rhizobium Japonicum (cố định đạm, nốt sần) - Bacillus subtilis N-77 - Azospirillum lipoferum 4B Phương pháp: - Cấy trang thạch đĩa, đục lỗ giếng để thử nghiệm lúc chủng vi sinh vật - Dấu hiệu kháng: xuất vòng tròn xung quanh giếng - Quy trình sản xuất phân Một yếu tố quan trọng sản phẩm phân vi sinh đa chức việc nghiên cứu chọn lựa chất mang Đối với yếu tố này, nhà khoa học dùng chất mang gồm hỗn hợp than bùn mùn hữu có đủ dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển tồn tại, không gây độc vi sinh vật trồng môi trường sinh thái Chất mang xử lý chặt chẽ, bảo đảm đạt tiêu kỹ thuật độ ẩm, pH, bao gói túi PE khử trùng xạ nhiệt Nguồn nguyên liệu sản xuất chất mang: - Than bùn hoạt hố - Rác phế thải có nguồn gốc từ thực vật - Quặng apatit hay phosphorit nghiền nhỏ - Phân chuồng ủ diệt trứng ký sinh trùng 15 - Giai đoạn 1: Nghiền nhỏ quặng, hoạt hoá than bùn để đảm bảo pH thích hợp xử lý phân chuồng, rác phế thải với vôi để diệt trứng ký sinh trùng - Giai đoạn 2: Bao gồm từ chủng giống đến thành phẩm tiến hành qua bước sau: * Bước1: Bảo quản chủng giống cách đông khô Đây phương pháp bảo quản tương đối ưu việt giữ chủng lâu dài mà hoạt tính chủng bảo đảm, sản xuất giống nhân qua môi trường đặc hiệu * Bước 2: Tạo nguồn nguyên liệu nhân giống - Tạo nguồn nguyên liệu - Nhân giống: Giống nhân lên qua mơi trường rỉ đường có bổ sung số ngun tố thích hợp ni cấy máy lắc, sau nhân tiếp qua hệ thống sục khí nhiệt độ 37 - 45oC/72 (giống C2) * Bước 3: Lên men Trong trình sản suất phân vi sinh hiên người ta sử dụng chủng giống vi sinh lựa chọn (chủng gốc) tiến hành nhân sinh khối, xử lý sinh khối tạo sản phẩm phân vi sinh 16 Quy trình chung cho sản xuất phân vi sinh vật từ vi khuẩn theo phương pháp lên men chìm Yêu cầu chất lượng công tác kiểm tra chất lượng  Yêu cầu chất lượng phân VSV có đầy đủ hoạt tính: cố định đạm, phân giải lân, kích thích tăng trưởng, kháng nấm bệnh cao có ảnh hưởng tốt trồng với mật độ 108-109 tế bào VSV/g hay ml phân bón loại phân bón chất mang khử trùng 106 tế bào VSV/gam hay ml phân bón chất mang khơng khử trùng  Để phân bón vi sinh vật đạt chất lượng cao sau công đoạn sản xuất cần tiến hành kiểm tra chất lượng sản phẩm tạo Tài liệu tham khảo: Đỗ Kim Nhung, Vũ Thành Công Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA cố định đạm vi khuẩn Gluconacetobacter sp Azospirillum sp phân lập từ mía Tạp 17 chí khoa học 2011: 18a 161-167 Mikio Shimizu Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77 Zen-noh Institute of Animal Health, Sakura, Chiba 285, Japan Lãng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Cao Ngọc Diệp Khả cố định đạm, hoà tan lân sinh tổng hợp IAA vi khuẩn Azospirillum lipoferum Trung tâm Giống Nộng nghiệp, Thành phố Cần Thơ Viện công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ Trần Tú Thuỷ, Vũ Thuý Nga, Phạm Văn Toản, Nguyễn Ngọc Quyên, Lê Văn Nhương, Nguyễn Lan Hương Sử dụng vi sinh vật cố định nitơ, phân giải lân để sản xuất phân hữu Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam, Viện công nghệ sinh học-CNTP, Đại học Bách khoa Hà Nội Mónica Fulchieri, Carlos Lucangeli, Rubén Bottini Inoculation with Azospirillum lipoferum Affects Growth and Gibberellin Status of Corn Seedling Roots Plant & Cell Physiology Oxfordjournals.org HẾT 18 ... trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học phân lập nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm số VSV phân giải lân Phân bón vi sinh vật sản xuất cách nhân sinh khối VSV mơi trường điều kiện thích. .. nitơ, phân vi sinh vật phân giải lân, phân vi sinh vật hỗn hợp cố định nitơ phân giải lân Sản phẩm phân bón VSV hội đồng khoa học nghiệm thu, đánh giá công nhận tiến kỹ thuật Để sản xuất phân vi sinh. .. nghiệm lúc chủng vi sinh vật - Dấu hiệu kháng: xuất vòng trịn xung quanh giếng - Quy trình sản xuất phân Một yếu tố quan trọng sản phẩm phân vi sinh đa chức vi? ??c nghiên cứu chọn lựa chất mang Đối với