SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và basa (Pangasius bocourti) là 2 loài cá bản địa của Việt Nam và một số nước lân cận (Lào, Campuchia và Thái Lan). Cá basa là loài được nuôi truyền thống trong bè trên sông Mêkông của Việt Nam và Campuchia trong khi đó cá tra được nuôi nhiều trong ao cầu ở đồng bằng Nam bộ Việt Nam trước đây. Phân loại: Hai loài này thuộc bộ cá nheo (Siluriformes), họ cá tra (Pangasiidae). Hiện tại đã có 11 loài thuộc họ cá tra được tìm thấy ở Việt Nam, trong đó có 5 loài là đối tượng nuôi quan trọng trong ao và bè. Cá tra và basa có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, bụng cá basa to tròn vì có lá mỡ rất lớn (nên trước đây gọi là cá bụng), miệng rộng và có 2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10 phần ngàn), chịu đựng được nước phèn có pH > 4. Điều kiện sống: Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống được ở những ao hồ chật hẹp, thiếu O2, nên nuôi được mật độ rất cao. Thức ăn chủ yếu: Có tính ăn tạp, thích ăn mồi có nguồn gốc động vật và cũng dễ dàng chuyển đổi loại thức ăn. Khi phân tích thức ăn trong ruột của cá đánh bắt ngoài tự nhiên, thành phần thức ăn được tìm thấy như sau: Nhuyễn thể: 35,4% Cá: 31,8% Côn trùng: 18,2% Thực vật thượng đẳng: 10,7% Khi nuôi trong ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức như mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp và rất thích phân cầu.

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC (NHÓM 4) I/ Sơ lược về đối tượng sử dụng chế phẩm: Cá tra Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và basa (Pangasius bocourti) là 2 loài cá bản địa của Việt Nam và một số nước lân cận (Lào, Campuchia và Thái Lan). Cá basa là loài được nuôi truyền thống trong bè trên sông Mêkông của Việt Nam và Campuchia trong khi đó cá tra được nuôi nhiều trong ao cầu ở đồng bằng Nam bộ Việt Nam trước đây. Phân loại: Hai loài này thuộc bộ cá nheo (Siluriformes), họ cá tra (Pangasiidae). Hiện tại đã có 11 loài thuộc họ cá tra được tìm thấy ở Việt Nam, trong đó có 5 loài là đối tượng nuôi quan trọng trong ao và bè. Cá tra và basa có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, bụng cá basa to tròn vì có lá mỡ rất lớn (nên trước đây gọi là cá bụng), miệng rộng và có 2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới 10 phần ngàn), chịu đựng được nước phèn có pH > 4. Điều kiện sống: Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể sống được ở những ao hồ chật hẹp, thiếu O 2 , nên nuôi được mật độ rất cao. Thức ăn chủ yếu: Có tính ăn tạp, thích ăn mồi có nguồn gốc động vật và cũng dễ dàng chuyển đổi loại thức ăn. Khi phân tích thức ăn trong ruột của cá đánh bắt ngoài tự nhiên, thành phần thức ăn được tìm thấy như sau: Nhuyễn thể: 35,4% Cá: 31,8% Côn trùng: 18,2% Thực vật thượng đẳng: 10,7% Khi nuôi trong ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức như mùn bã hữu cơ, cám, rau, động vật đáy, thức ăn hỗn hợp và rất thích phân cầu. Quy trình chọn giống cho sản xuất: Sàn lọc vi sinh vật có hoạt tính Phân lập vi sinh vật mục tiêu Xây dựng đặc tính sản phẩm Xác định vi sinh vật tương ứng Xây dựng quá trình phân lập Lựa chọn nguồn phân lập Làm giàu vi sinh vật mục tiêu Sàn lọc thứ cấp Tối ưu hoá sản phẩm, quy trình Nâng công suấtSản xuất II/ Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sản suất chế phẩm hỗ trợ tiêu hoá và đối kháng sinh học cho cá tra Tổng quan: * Lịch sử phát hiện: - Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Ban đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. - Những năm 1949 – 1957, Henrry, Albot và các cộng sự đã tách được các chủng Bacillus subtilis thuần khiết. - Ngày nay, B. subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm năng ứng dụng hiệu quả trong y học, chăn nuôi, công nghiệp,… * Phân loại: Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis * Phân bố: - B. subtilis là vi khuẩn thường có mặt trong nước, đất, không khí, xác bã thực vật thối rửa và cả trong đường tiêu hóa của người và động vật. - B. subtilis hiện diện trong đất với số lượng từ 10 – 100 triệu CFU/g. - Có khả năng sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trường sống. * Hình thái: - B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương(G + ), kích thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. - Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ. - Là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi. Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 - 50 o C, tối đa khoảng 60 o C, bào tử chịu nhiệt khá cao. - Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15%. * Đặc điểm nuôi cấy: - Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37 0 C. - Nhu cầu O 2 : B. subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu O 2 . - Độ pH: B. subtilis thích hợp nhất với pH từ 7,0 – 7,4. - Môi trường: • Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. • Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, màu xám, rìa nhăn gợn sóng. • Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. • Môi trường thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. • Môi trường canh TSB: B. subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại ở đáy, lắc lên khó tan đều. * Đặc điểm sinh hóa: - Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. - Indol (-), VP (+), nitrat (+), H 2 S (-), NH 3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí. * Tác dụng hỗ trợ tiêu hóa: - Sản sinh nhiều enzyme như amylase, pectinase, protease, lipase, urease, mannase, Nhưng chủ yếu nghiên cứu về enzyme amylase và protease. * Tác dụng đối kháng sinh học: - Hình thức đối kháng chủ yếu của B. subtilis đối với vsv gây bệnh là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh. Biểu hiện ở 3 hướng: • Làm tan màng tế bào vi khuẩn dẫn đến phá hủy tính thẩm thấu của tế bào tế bào chết. • Ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. • Phá hủy sự trao đổi của DNA và RNA. - B. subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr-. Phân lập: * Nguồn phân lập: từ đất ao nuôi, từ một số chế phẩm cho cá tra được bán trên thị trường. * Cách phân lập: - Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý vô trùng. - Sau đó cấy trang vào môi trường thạch đĩa TSA. Ủ ở 37 0 C/24h. - Chọn khuẩn lạc điển hình rồi quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn. - Sau khi quan sát nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn B. subtilis thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hóa để khẳng định. - Sau đó dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng. Thử đối kháng invitro và invivo: * Vi khuẩn gây bệnh ở cá tra: - Aaromona hydrophila (trực khuẩn, gram âm): gây loét, thối vây, thối đuôi, xuất huyết nhiễm trùng máu, gây ra những tổn thương đến khuếch tán, xuất huyết trong mang và vùng hậu môn, loét và sưng bụng. - Edwardsiella tarda (trực khuẩn, gram âm): gây bệnh gan thận mũ, nhiễm khuẩn huyết. * Thử đối kháng invitro: Đổ môi trường vào đĩa petri vô trùng (môi trường thạch) ↓ Trải dịch nuôi cấy của vi khuẩn gây bệnh ↓ Đục lỗ trên thạch ↓ Bơm dịch cấy vào lỗ thạch ↓ Ủ đĩa ↓ Kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn * Thử đối kháng invivo: - Nuôi thử nghiệm quy mô nhỏ: (hai ao nhỏ với vài chục cá thể) • Cho Bacillus subtilis vào 1 trong 2 ao. • Tiếp tục theo dõi trong 1 khoảng thời gian để so sánh sự tăng trưởng giữa 2 ao (thử khả năng hỗ trợ tiêu hóa). • Chọn 1 vài cá thể ngẫu nhiên tiến hành kiểm tra xem có tồn tại chủng mong muốn trong hệ tiêu hóa hay không? • Cho đối tượng gây bệnh vào cả 2 ao (thử đối kháng). • Theo dõi tỉ lệ cá thể mắc bệnh ở cả hai ao. => Nếu ao có B. Subtilis cá phát triển tốt, đồng đều, ít bệnh, so sánh với các chủng đã có mặt trên thị trường nếu hoạt tính tốt hơn thì có thể tiến hành thử nghiệm trên quy mô lớn hơn. - Nuôi thử nghiệm ở quy mô lớn: • Tìm đến khu vực nuôi cá tra, liên hệ với 1 vài hộ để thử nghiệm. • Khảo sát, kiểm tra môi trường ao nuôi (pH, độ trong, mật độ vi sinh vật…đảm bảo đạt tiêu chuẩn ao nuôi). • Tiến hành đưa chủng thử nghiệm vào ao nuôi (xác định nồng độ). • Sau một thời gian kiểm tra lại mật độ vi sinh vật trong ao (xem chủng thí nghiệm có tồn tại và cạnh tranh được với các vi sinh vật khác trong ao không). • Bắt ngẫu nhiên vài cá thể và kiểm tra trong hệ tiêu hóa xem có tồn tại chủng thì nghiệm không. • Trong suốt quá trình nuôi phải thường xuyên kiểm chứng so sánh tốc độ tăng trưởng, tỉ lệ bệnh với các hộ xung quanh. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy: - Một số môi trường nuôi cấy, tăng sinh của Basillus subtilis trong quy mô công nghiệp lựa chọn những nguồn cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền: • Rỉ đường + 2% tinh bột. • Rỉ đường + 1% tinh bột. • Rỉ đường + 1% tinh bột + 0.5% pepton. • TSB + 1% tinh bột. → Sử dụng môi trường: Rỉ đường + 1% tinh bột + 0.5% pepton khả năng sinh enzyme amylase và protease tốt nhất. - Thêm vào một số khoáng : KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 - Điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis là ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ trong điều kiện sục khí liên tục thì khả năng phát triển và hoạt độ enzyme vi khuẩn tốt nhất. - Nhiệt độ 4 - 10 0 C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 37 0 C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. * Huấn luyện thích nghi và sàn lọc kiểu hình: Huấn luyện thích nghi của vi khuẩn trong điều kiện: Bè nuôi cá ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Nuôi cá bè là hình thức nuôi công nghiệp, chủ động và có tính tập trung. Tại các khu vực nuôi bè cá tra và basa tập trung hiện nay (chủ yếu ở An Giang và Đồng Tháp) nguồn nguyên liệu làm thức ăn cho cá rất phong phú. Khu vực tứ giác Long Xuyên, Đồng Tháp Mười, đất đai màu mỡ, thích hợp cho canh tác các loại nông sản và là nguồn cung cấp chủ yếu nguyên liệu nông sản để chế biến thức ăn cho cá nuôi bè (cám, tấm, đậu, bắp .). - Biện pháp xử lý trước khi huấn luyện thích nghi cho vi khuẩn: • Trước khi thả cá bè phải được dọn vệ sinh sạch sẽ, tẩy trùng toàn bộ trong bè, chú ý tất cả các ngóc ngách, góc cạnh của bè, nơi ẩn chứa vi khuẩn có hại và nguồn gây bệnh cho cá. • Kiểm tra và thay thế ngay các phần, các chi tiết bị mục, bị hư hại, tu sửa lại hệ thống dây neo, neo, phao và thay mới những phần đã bị hư, đứt. • Các sản phẩm chứa vi khuẩn hỗ trợ tiêu hoá và đối kháng sinh học cần thời gian 5 -10 ngày để có hiệu lực: thích nghi với điều kiện, hồi phục, gia tăng số lượng, phát huy tác dụng. - Khi cho cá tra vào bè cần khảo sát giữa bè cho chế phẩm, bè cho chế phẩm bán trên thị trường và bè không cho chế phẩm về các đặc tính như: Ly tâm Vikhuẩn Bacillus subtilis Nuôi cấy Lên men Thu nhận sinh khối Sấy phun, thêm phụ gia Sản phẩmBảo quản • Số lượng cá bệnh, tỉ lệ kích thước cá tra, hình thái và đặc tính sinh hoá cá tra, . giữa các bè khảo sát. • Thử sức đề kháng của cá tra trước các yếu tố gây bệnh trong các bè khảo sát, sự tăng trưởng và phát triển trong điều kiện như nhau. => Qua kết quả khảo sát thu được sàng lọc lấy kiểu vi khuẩn thích nghi và hiệu quả cao nhất (hiệu quả ngang bằng hoặc lớn hơn sản phẩm trên thị trường). * Nâng công suất: - Thêm chất phụ gia và một số chất giúp vi khuẩn có thể xâm nhập vào cá tra, tránh bị phân huỷ, bị kháng thể trong cơ thể cá đào thải, tăng sinh nhanh và tiết enzyme hỗ trợ hiệu quả. - Phối trộn vô một số loại thức ăn ưa thích của cá tra để dễ dàng xâm nhập cơ thể. Sản xuất chế phẩm: * Bảo quản chế phẩm sinh học: qua hai cách: - Đông khô: • Phương pháp đông khô giúp giữ nguyên được trạng thái mẫu và sinh khối. • Bảo quản thường từ 18-24 0 C. • Hạn sử dụng: 4-5 năm. • Ít dùng với quy mô công nghiệp, chủ yếu dùng trong phòng thí nghiệm để bảo quản vi khuẩn. - Sấy khô: vi khuẩn Gram dương tạo bào tử • Bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Pha loãng mẫu và bảo quản ở nhiệt độ thường. • Hạn sử dụng: trong vòng 1 năm. • Thường dùng ở quy mô công nghiệp để sản xuất, kinh doanh. * Một số chế phẩm probiotic có chứa B. subtilis hiện nay: - Enzymebiosub của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng để phòng và trị các bệnh tiêu chảy cấp, mãn tính, rối loạn đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm và cá, giúp tăng cường tiêu hóa, kích thích tăng trưởng. - Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2. - Vime - bactevit của công ty Vemedim Vietnam. DANH SÁCH THÀNH VIÊN 1. Trần Thanh Tùng 1053010920 2. Hồ Thanh Tùng 1053010915 3. Chu Đặng Nhật Đan 1053010138 4. Nguyễn Anh Hậu 1053010220 5. Dương Minh Tuấn 1053012880 6. Mai Yến Nhi 1053010533 7. Đặng Thị Kim Thoa 1053012736 8. Nguyễn Ngọc Kim 1053010353 9. Trần Thị Tố Hoa 1053012248 10. Nguyễn Thị Thúy Tài 1053010659 11. Trần Thị Kiều 1053012348 12. Trần Văn Thành 1053010695 13. Nguyễn Thành Trung 1053010856 14. Nguyễn Minh Trọng 1053012850 15. Phạm Duy Khải 1053010330 . SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC (NHÓM 4) I/ Sơ lược về đối tượng sử dụng chế phẩm: Cá tra Cá tra (Pangasianodon. trình Nâng công suấtSản xuất II/ Sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis sản suất chế phẩm hỗ trợ tiêu hoá và đối kháng sinh học cho cá tra Tổng quan: * Lịch