Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (+PA) sử dụng trong điều trị

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ Mã số K10.28/06-10 Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi 8672 HÀ NỘI - 2010 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC KC10/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ Mã số K10.28/06-10 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì PGS. TS. Quyền Đình Thi Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ Hà nội, 2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nghiên cứu này, chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn: 9 Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban chủ nhiệm chương trình KC.10/06-10, Văn phòng các chương trình trọng điểm cấp Nhà nước đã cấp kinh phí. 9 Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt để đề tài thực hiện đúng tiến độ. 9 Các đơn v ị phối hợp: Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sản phẩm y tế; Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương; Trung tâm phòng chống độc – Học viện Quân y; Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gene và Phòng Hóa sinh protein – Viện Công nghệ sinh học 9 Các cán bộ tham gia đề tài và một số cộng sự khác. DANH SÁCH CÁN BỘ THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI TT Họ và tên Cơ quan Trách nhiệm trong đề tài 1. PGS. TS. Quyền Đình Thi Phòng CNSH Enzyme Chủ nhiệm đề tài 2. PGS. TS. Nông Văn Hải Phòng CN ADN ứng dụng Chủ nhiệm đề tài nhánh 3. PGS. TS. Hoàng Văn Lương Học viện Quân y Chủ nhiệm đề tài nhánh 4. ThS. Vũ Hồng Diệp Bộ KH&CN Thành viên 5. ThS. Nguyễn Sỹ Lê Thanh Phòng CNSH Enzyme Thành viên 6. ThS. Nguyễn Thị Thảo -nt- Thành viên 7. CN. Nguyễn Thị Hiền Trang -nt- Thành viên 8. CN. Đào Thị Tuyết -nt- Thành viên 9. TS. Nguyễn Hải Hà Phòng CN ADN ứng dụng Thành viên 10. CN. Nguyễn Văn Phòng -nt- Thành viên 11. và một số cộng sự khác Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Quyền Đình Thi MỤC LỤC BÁO CÁO TỔNG HỢP 1 MỞ ĐẦU 1 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị 2 1.1.1 Bệnh nghẽn mạch 2 1.1.2 Điều trị bệnh nghẽn mạch 3 Các thuốc điều trị thế hệ 1 3 Các thuốc điều trị thế hệ 2 4 Các thuốc điều trị thế hệ 3 4 1.2 Thuốc điều trị bệnh nghẽn mạch có bản chất enzyme 6 1.3 Tình hình nghiên cứu SK 9 1.3.1 Giới thiệu chung về SK 9 1.3.2 Tình hình nghiên cứu SK tái tổ hợp trên thế giới 12 Nhân dòng và biểu hiện trong E. coli 12 Nhân dòng và biểu hiện trong Pichia pastoris 14 Nhân dòng và biểu hiện trong Bacillus 15 Nhân dòng và biểu hiện trong các tế bào chủ khác 15 1.3.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 16 1.4 Tình hình nghiên cứu biểu hiện tPA 17 1.4.1 Chất hoạt hóa plasminogen mô người 18 1.4.2 Vai trò của tPA trong quá trình làm tan máu đông 20 1.4.3 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 21 1.4.4 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 22 1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài 22 2 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu và hóa chất 24 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24 Các chủng liên cầu khuẩn 24 Các chủng vi sinh vật chủ, vector nhân dòng và biểu hiện 24 Mẫu mô và máu 24 Các dòng tế bào động vật chủ, vector biểu hiện 24 2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25 Hóa chất 25 Thiết bị 26 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 27 2.1.4 Dung dịch và đệm 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 28 2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật 28 Nuôi cấy 28 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 29 Tinh sạch protein tái tổ hợp 29 Định tính SK 30 Đinh lượng SK bằng phương pháp so màu 30 Xây dựng đường nồng độ SK chuẩn 31 Loại bỏ và kiểm tra nội độc tố vi khuẩn 31 Điện di SDS-PAGE 31 Western blot 32 Nhận dạng protein 32 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hoạt tính và độ bền SK 33 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 33 Phân tích gene 33 Phản ứng PCR khuếch đại và dung hợp 34 Tách chiết DNA tổng số 34 Đọc trình tự và phân tích gene 34 Tinh sạch plasmid 35 Tinh sạch phân đoạn DNA 35 Điện di agarose 36 Biến nạp plasmid 36 2.2.4 Lên men và tạo chế phẩm SK thô và SK tinh sạch 37 2.2.5 Các phương pháp biểu hiện tPA ở tế bào động vật 38 Tách chiết RNA tổng số 38 RT-PCR để nhân cDNA 38 Tạo dòng và xác định trình tự gene 39 Thiết kế plasmid biểu hiện 39 Tinh chế vector biểu hiện (Kit Qiagen for maxi-prep) 40 Phần mềm phân tích DNA 40 Nuôi cấy tế bào CHO-S 41 Biểu hiện tPA ở tế bào CHO-S 41 Tinh sạch sơ bộ tPA từ E. coli 42 Xác định hoạt tính tPA 42 Sơ chế tPA 42 Tinh chế tPA 43 2.2.6 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 44 2.2.7 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu huyết học, chức năng gan thận và các tác dụng phụ 47 3 NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 48 A. NỘI DUNG (1+3+4): NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SK TÁI TỔ HỢP 48 3.1 Phân lập chủng gây tan huyết 48 3.2 Nhân dòng, phân tích gene sk từ S. pyogenes và S. equisimilis 52 3.3 Thiết kế, biểu hiện gene sk từ S. pyogenes DT17 ở E. coli 55 3.3.1 Thiết kế, biểu hiện gene sk trong pET22b + 55 Biểu hiện SK ở E. coli BL21 55 Biểu hiện SK ở E. coli BL21 (DE3) plysE và plysS 56 3.3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp SK 58 Nhiệt độ sinh trưởng 59 Nhiệt độ sinh tổng hợp SK tối ưu 59 pH môi trường ban đầu tối ưu 60 Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 60 3.3.3 Tinh sạch và nhận dạng SK tái tổ hợp 61 Tinh sạch SK 61 Nhận dạng SK 61 3.3.4 Đánh giá tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp 65 Nhiệt độ phản ứng tối ưu và độ bền nhiệt độ 65 pH tối ưu và độ bền pH 66 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ lên độ bền của SK tái tổ hợp 67 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa lên độ bền của SK tái tổ hợp 68 Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính của SK tái tổ hợp 69 Hoạt hóa SK 69 3.4 Biểu hiện đoạn msk từ S. pyogenes trong E. coli 70 3.4.1 Thiết kế vector biểu hiện msk 70 3.4.2 Biểu hiện và tinh sạch mSK 71 Biểu hiện và tinh sạch mSK có đuôi 6xhis 71 Biểu hiện và tinh sạch mSK không có đuôi 6xhis 72 3.5 Biểu hiện gene msk từ S. pyogenes DT17 ở B. subtilis 73 3.5.1 Thiết kế cấu trúc biểu hiện acoAamyE-sk-T7 73 3.5.2 Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện msk 73 3.5.3 Biểu hiện và tinh sạch SK từ chủng B. subtilis tái tổ hợp 74 3.5.4 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ B. subtilis 75 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền SK 75 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính SK 76 Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính SK 77 3.6 Biểu hiện gene sk từ S. pyogenes DT17 ở Pichia pastoris 77 3.6.1 Nhân dòng phụ sk 77 3.6.2 Thiết kế plasmid pPSK 78 3.6.3 Biểu hiện SK ở P. pastoris 79 3.6.4 Tối ưu các điều kiện biểu hiện 80 Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy tối ưu 80 pH môi trường nuôi cấy tối ưu 81 Nồng độ chất cảm ứng tối ưu 81 3.6.5 Tinh sạch SK từ P. pastoris 81 3.6.6 Đánh giá tính chất của SK tái tổ hợp từ P. pastoris 83 Độ bền nhiệt độ 83 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền 83 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 84 Ảnh hưởng của ion kim loại 85 3.7 Sản xuất chế phẩm SK 85 3.7.1 Lên men chủng E. coli BL21 tái tổ hợp BLSK.2 85 3.7.2 Sản xuất SK-his + tái tổ hợp sạch 85 Thu dịch SK và loại bỏ nội độc tố 85 Tinh sạch SK 87 3.8 So sánh một số tính chất hóa lý của SK tái tổ hợp với SK thương phẩm 89 So sánh hoạt tính riêng 89 So sánh độ bền nhiệt 89 B. NỘI DUNG 2+3+4: NGHIÊN CỨU QTCN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM TPA TÁI TỔ HỢP 91 3.9 Nhân dòng và xác định trình tự gene mã hóa tPA người 91 3.9.1 Nhân dòng và phân tích trình tự gene mã hóa tPA người 91 RNA tổng số 91 cDNA mã hóa tPA 91 Tạo plasmid nhân dòng 91 Phân tích trình tự tPA 92 3.9.2 Sản xuất chế phẩm tPA tái tổ hợp 95 Chọn vector và dòng tế bào thích hợp 95 Quy trình nuôi cấy tế bào 96 Các plasmid biểu hiện tPA ở tế bào động vật 97 Dòng tế bào biểu hiện tPA 99 3.9.3 Sản xuất và tinh chế tPA ở quy mô phòng thí nghiệm 100 Nuôi cấy tế bào CHO-S để sản xuất tPA 100 tPA sơ chế 100 Tinh chế tPA 101 3.10 Thử nghiệm tác dụng phân giải huyết khối của tPA trên động vật thí nghiệm 102 3.10.1 Mô hình đột quỵ não thực nghiệm và so sánh tác dụng của tPA 102 Cho điểm thần kinh 102 Thời gian chuột vận động tự do trong vòng 5 phút 103 Thời gian chuột vận động trên trục quay Rota-rod 103 Đánh giá trí nhớ không gian kết hợp vận động bằng mê lộ nước 104 3.10.2 Đánh giá các ảnh hưởng của tPA tới một số chỉ tiêu toàn thân, huyết học, chức năng gan thận và các tác dụng phụ 105 Chỉ tiêu toàn thân 106 Các chỉ số huyết học và sinh hóa máu 106 4 KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 107 4.1 Kết quả nổi bật 107 4.2 Công bố 111 Bài báo 111 Trình tự gene đã đăng ký GenBank 111 Đăng ký bản quyền 112 4.3 Đánh giá chung 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 119 PHỤ LỤC 124 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate B. subtilis Bacillus subtilis DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IU International unit kb Kilobase kDa KiloDalton LB Luria and Bertani OD Optical density P. pastoris Pichia pastoris PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis sak Gene mã hóa staphylokinase SDS Sodium dodecyl sulfate sk Gene mã hóa streptokinase SK Streptokinase SOC Super Optimal broth with Catabolite repression Taq Thermus aquaticus polymerase rpm Round per minute v/v Volume/volume w/v Weight/volume 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP MỞ ĐẦU Hiện nay, bệnh tim mạch là nguyên nhân số một gây tử vong tại nhiều quốc gia trên thế giới. Một trong những nguyên nhân quan trọng của bệnh tim mạch là tắc nghẽn mạch máu, với tình trạng ứ đọng mạch máu với cục máu đông, có thể dẫn tới nhồi máu cơ tim cấp tính và đột quỵ do thiếu máu cục bộ và cả hai đều dẫn đến t ử vong. Trước đây, để ngăn chặn các cơn đau tim do nghẽn mạch, người ta thường sử dụng một số thuốc có bản chất hóa học như aspirin, ticlopidine, hoặc phẫu thuật để lấy hoặc thông tắc nghẽn, hoặc tạo ra mạch phụ để cấp mới máu. Nhưng trong những năm gần đây, đã có một cuộc cách mạng trong liệu pháp điều trị làm tan khối huyết do những rối loạn tuần hoàn máu khác nhau (như nghẽn mạch phổi, nghẽn tĩnh mạch sâu, nhồi máu cơ tim) là sử dụng các yếu tố phân giải fibrin. Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng các yếu tố phân giải sự nghẽn mạch là có khả năng duy nhất hoạt hóa các thành phần bên trong hệ thống thủy phân fibrin để phá vỡ cục máu đông, khôi phục lại sự lưu thông dòng máu trong hệ mạch đã bị nghẽn [1]. Các yếu tố này không trực tiếp phân giải fibrin mà hoạt hóa plasminogen có mặt trong máu thành plasmin và chính plasmin sẽ trực tiếp phân giải fibrin. Các yếu tố hoạt hóa plasminogen thường được sử dụng như streptokinase (SK), staphylokinase (Sak), urokinase (uPA) và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA). Trong số đó tPA rất được quan tâm bởi khả năng hoạt hóa plasminogen đặc hiệu và không gây phản ứng phụ. Bên cạnh đó hai yếu tố SK và Sak cũng là sự l ựa chọn thích hợp vì những kết quả so sánh trong việc thử nghiệm điều trị và hiệu quả giá thành cũng như không bị hạn chế về mặt khai thác lâm sàng của nó so với các yếu tố hoạt hóa khác. Mặt khác, ở Việt Nam hiện nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu sản xuất dược phẩm còn nhiều hạn chế, nguồn nguyên liệu vẫn chủ yếu d ựa vào việc nhập khẩu. Do đó, việc áp dụng công nghệ sinh học, sinh học phân tử trong nghiên cứu tạo các chế phẩm y dược là một nhiệm vụ thiết yếu và có tính khả thi cao đối với tình hình thực tiễn ở nước ta. Xuất phát từ thực tế đó, Phòng CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học với sự hỗ trợ kinh phí nghiên cứu của Bộ KH&CN, chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nướ c KC10-06/10 đã tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị. 2 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh nghẽn mạch và hướng điều trị 1.1.1 Bệnh nghẽn mạch Bệnh nghẽn mạch xảy ra khi huyết khối làm tắc tĩnh mạch hoặc động mạch. Tùy thuộc vị trí nghẽn mạch, bệnh được chia thành hai thể là tắc động mạch và tắc tĩnh mạch. Bệnh tắc tĩnh mạch do yếu tố V: Yếu tố nguy cơ thông thường của tắc nghẽn tĩnh mạch là xuất hiện yếu tố V Leiden, một biến thể củ a yếu tố V của quá trình đông máu. Biến thể này bị bất hoạt rất chậm, giảm 10 lần so với nguyên thể. Điều này làm cho nó tồn tại lâu hơn trong máu và làm cho máu ở tình trạng quá đông. Một copy của gene mã hóa yếu tố V Leiden sẽ làm tăng nguy cơ nghẽn mạch lên 4-8 lần, trong khi đó với 2 copy của gene này nguy cơ sẽ tăng tới 80 lần. Tỷ lệ đột biến gene của yếu tố V Leiden chiếm 20-40% các bệnh nghẽn mạch và tần suất bệnh là 5% trong quần thể dân cư [2]. Bệnh nghẽn mạch do thiếu antithrombin: Antithrombin có chức năng ức chế hoạt động của một số các yếu tố đông máu như thrombin, các yếu tố IXa, Xa thông qua hình thành phức hợp bền vững với rất nhiều yếu tố khác nhau. Heparin và heparan sulfat làm tăng hoạt tính của antithrombin lên gấp 1000 lần. Sự thiếu hụt antithrombin là một trong nh ững nguyên nhân gây nên bệnh tắc nghẽn mạch. Khoảng 2% số người bị chứng tắc nghẽn mạch được ghi nhận là thiếu antithrombin. Tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng là 1/2000 đến 1/5000. Bệnh mang yếu tố di truyền thể trội trên nhiễm sắc thể thông thường. Khiếm khuyết do đột biến gene tác động tới quá trình tổng hợp hoặc ổn định yếu tố này. Bệnh thường gặ p là nghẽn mạch phổi và tĩnh mạch, ít thấy tắc nghẽn động mạch. Chứng nghẽn mạch có thể xảy ra một cách tự phát hoặc liên quan với phẫu thuật, chấn thương và thai nghén [2]. Tắc nghẽn động mạch: nguyên nhân có thể do xơ vỡ động mạch gây ra khi tăng lượng mỡ máu. Bệnh thường gặp ở người lớn tuổi. Khi mỡ và canxi lắng đọng làm dầy thành mạ ch, lúc này hình thành máu đông trên bề mặt của thành mạch bị biến dạng. Đây là yếu tố kích hoạt cho con đường đông máu nội sinh. Con đường nội sinh được kích hoạt khi các yếu tố đông máu tiếp xúc với bề mặt điện tích âm. Đây được gọi là pha tiếp xúc, là kết quả của tương tác với phospholipid của phần tử lipoprotein tuần hoàn như chylomicron và lipid phân tử thấp trong máu. Đây là nền tảng của sự ti ền nghẽn mạch do tăng mỡ máu gây nên và làm tiến triển xơ 3 vữa động mạch. Sự tiếp xúc làm hoạt hóa con đường nội sinh gây ra quá trình đông máu [3]. Khi nghẽn động mạch xảy ra tại động mạch vành là hai mạch máu từ động mạch chủ cung cấp máu cho cơ tim thì sẽ gây ra nhồi máu cơ tim. Khi chúng xảy ra tại hệ tuần hoàn não, có thể gây nên đột quỵ hoặc thiếu oxi cho các cơ quan khác. 1.1.2 Điều trị bệnh nghẽn mạch Trước đây, bệnh nghẽn mạch được kiểm soát bằng sử dụng các chất kháng đông như heparin và coumarin để kìm hãm sự tạo thành fibrin. Mặc dù có các chất kháng đông hóa học và các phương pháp phẫu thuật, bệnh tắc nghẽn mạch cấp tính vẫn còn là nguyên nhân gây tử vong ở lứa tuổi trung niên và tuổi già. Khi nhận ra rằng sự phân giải fibrin có thể được thực hiện trong cơ thể sống bởi một quá trình bao gồm s ự chuyển hóa plasminogen không hoạt động thành plasmin, một enzyme hoạt động, người ta đã nghĩ đến cách điều trị mới là sử dụng các chất hoạt hóa plasminogen (PA). Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng cách tiếp cận tốt nhất để điều trị chứng nghẽn mạch (hòa tan huyết khối) là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch một enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme thường được sử dụng nhất trong cách điều trị này là streptokinase từ vi khuẩn và urokinase (uPA) từ nước tiểu của người. Trong 20 năm gần đây, người ta còn sử dụng 3 enzyme phân giải cục nghẽn mới trong một số trường hợp là arvin (từ một loài rắn độc ở Mã Lai), reptilase (từ một loài rắn ở Nam Mỹ) và brinase (từ một loài nấm mốc Aspergillus oryzae) [4]. Việc sử dụng và nghiên cứu thuốc làm tan huyết khối để điề u trị các rối loạn huyết khối gây tắc mạch bắt đầu vào nǎm 1933. Các nghiên cứu tập trung vào tác dụng phân hủy fibrin của các chất phân lập từ cầu khuẩn tan huyết beta. Tuy nhiên do số liệu về hiệu quả sử dụng thuốc thời gian đó không đầy đủ, nên việc dùng thuốc làm tan huyết khối bị hạn chế. Dẫn liệu đầu tiên sử dụng trị liệu làm tan huyết kh ối để điều trị nhồi máu cơ tim (AMI) bắt đầu vào nǎm 1958 khi Fletcher sử dụng trị liệu streptokinase liều cao, kéo dài [5]. Việc sử dụng các chất có bản chất protein để điều trị AMI có thể được phân thành 3 giai đoạn theo Bachmann [6] như sau: Các thuốc điều trị thế hệ 1 Việc thử nghiệm điều trị AMI bằng SK lần đầu tiên được nhóm nghiên cứu của tr ường đại học St. Louis, Mỹ thực hiện vào những năm cuối của thập kỷ 60 [5, 7, 8]. Một vài năm sau, UK được phát hiện là một chất gây tan huyết và được chính Fletcher và sau đó là Sasahara et al. (1967) dùng điều trị tắc mạch phổi [9]. Mối quan tâm về sử [...]... sau: - Tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp SK với năng suất cao và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất SK sạch đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam; - Tạo dòng tế bào sinh tổng hợp tPA cao và xây dựng quy trình công nghệ sản xuất tPA sạch đạt tiêu chuẩn dược điển Việt Nam 23 2 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và hóa chất 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng liên cầu khuẩn Các... nghiệm Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công bố nào về nghiên cứu sản xuất h-tPA tái tổ hợp ở nước ta, vì vậy đề tài này sẽ làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất chất hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp 1.5 Mục đích và sản phẩm cần đạt của đề tài 22 Trên cơ sở thu thập, phân tích và đánh giá các kết quả đã làm được của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, cũng như nhu cầu thực tiễn, đề tài... trường hợp thiếu máu não cấp tại bệnh viện Nhân dân Gia Định” của Phan Công Tân, Nguyễn Cảnh Nam và Nguyễn Văn Mừng Lê Thị Thu Hiền et al (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ bản (mã số 614206, Số: 1851/QĐBKHCN) Nghiên cứu tạo chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue plasminogen activator, TPA) tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y-dược” trong. .. nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu gene/protein có giá trị sử dụng trong y dược, tiến tới biểu hiện sản xuất protein tái tổ hợp là rất cần thiết và mới được tiếp cận nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành phân lập, xác định trình tự một số gene từ các nguồn sinh vật khác nhau, trong đó có cả gene người để nghiên cứu ứng dụng sản xuất dược phẩm. .. vào tĩnh mạch Do đó, enzyme này được lựa chọn sử dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn tĩnh mạch sâu và tắc mạch phổi [29] tPA, yếu tố hoạt hóa của tổ chức, được sản xuất bằng con đường tái tổ hợp cũng rất hiệu quả nhưng lại rất đắt Nó không có vấn đề miễn dịch như đối với streptokinase Đầu tiên nó gắn với fibrin, sau đó phức này bán vào plasminogen tạo nên phức 3 và từ đó hoạt hóa plasminogen để phân... đây Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về SK tái tổ hợp ở Việt Nam Trước đây, đã có một số đề tài nghiên cứu trong nước về việc đánh giá hiệu quả sử dụng thuốc SK để điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cấp Năm 2001-2002, Bệnh viện Hữu nghị Việt Tiệp Hải Phòng đã thực hiện một nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ hằng năm của Sở Khoa học, mã số 240: Nghiên cứu ứng dụng điều trị bệnh nhồi... đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về sản xuất tPA Nhóm nghiên cứu của PGS Nguyễn Thị Ngọc Dao (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm tương tự như Lumbrokinase (sản phẩm tách từ giun đất Nhật Bản có tên khoc học Lumbricus rubellus) từ giun quế Việt Nam (tên khoa học Perionyx escavatus) có tác dụng làm tan cục máu đông trong nghẽn mạch... bằng streptokinase trong nghiên cứu này có tỷ lệ thành công là 63% Theo dõi trong 30 ngày, bệnh nhân phục hồi tốt, ít bị biến chứng, chi phí điều trị chấp nhận được Các nghiên cứu khác liên quan tới các enzyme tương tự như tPA, nattokinase, urokinase, lumbrokinase cũng rất hạn chế Đa số là các nghiên cứu sử dụng các 16 enzyme này như thế nào trong điều trị bệnh nhồi máu như “Áp dụng thuốc rTPA trị liệu... dược phẩm CNSH Trong đó, Viện CNSH đã thành công trong nghiên cứu tổng hợp Trihobakin, protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư cũng như thành công trong việc tinh chế protein bất hoạt ribosome (RIP) phân lập từ cây mướp đắng [91, 92] Cũng tại Viện CNSH, gene mã hóa interleukin-2 của người, tác nhân điều biến miễn dịch, được sử dụng trong điều trị ung thư, HIV,... bằng streptokinase tại bệnh viện Việt Tiệp Hải Phòng” (Sở khoa học và Công nghệ Hải Phòng) Lê Văn Nam và Lê Thị Cẩm Dung (2003) đã nghiên cứu cách điều trị huyết khối trong tai biến mạch máu não Trong nghiên cứu này, các tác giả đã đưa ra công thức và phác đồ điều trị huyết khối Các thuốc làm phân hủy huyết khối đã được thành lập trong lòng mạch máu, các thuốc này đa số tác động qua cơ chế kích hoạt . CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG. hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme tái tổ hợp streptokinase và yếu tố hoạt hóa plasminogen mô (tPA) sử dụng trong điều trị. 2 1 CHƯƠNG 1. TỔNG. ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME TÁI TỔ HỢP STREPTOKINASE VÀ YẾU TỐ HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ (tPA) SỬ DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ Mã số K10.28/06-10