nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm giàu astaxanthin từ nấm men xanthophyllomyces dendrorhous ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

Nội dung nghiên cứu - Xác định được môi trường nhân giống và lên men thích hợp cho nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous sinh trưởng, phát triển và có hàm lượng astaxanthin cao... - Xá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM GIÀU ASTAXANTHIN TỪ NẤM MEN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

GIÀU ASTAXANTHIN TỪ NẤM MEN XANTHOPHYLLOMYCES

DENDRORHOUS ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm./

Hà Nội, ngày 26 tháng 11 năm 2019

Tác giả

LÃ MẠNH TUÂN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

TS Bùi Kim Thúy, Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

- người đã định hướng, chỉ bảo những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ và động viên tôi vượt qua những trở ngại và khó khăn trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Ban Lãnh đạo và Thầy cô Khoa Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Mở

Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian, cơ sở vật chất và giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm học tập và nghiên cứu

Sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các cô chú, anh chị, các bạn đồng nghiệp đã

và đang làm việc tại Viện Cơ điện nông nghiệp và Công nghệ STH

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè - những người đã luôn bên cạnh, khuyến khích và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 26 tháng 11 năm 2019

Tác giả

LÃ MẠNH TUÂN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu chung về astaxanthin 4

1.1.1 Đặc điểm chung 4

1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin 5

1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men X dendrorhous 6

1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin 8

1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin 12

1.1.6 Đặc tính chống ô xy hóa của astaxanthin 13

1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin 13

1.2 Tổng quan về nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous 16

1.2.1 Phân loại 16

1.2.2 Phân bố 17

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 17

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men X dendrorhous 17

1.3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 17

1.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 18

1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng astaxanthin trên thế giới 19

1.4.1 Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy nấm men 19

1.4.2 Các nghiên cứu về quá trình lên men 22

1.4.3 Các nghiên cứu về quá trình tách chiết, thu hồi astaxanthin 25

1.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng astaxanthin tại Việt Nam 26

1.6 Kết luận tổng quan 27

PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Chủng vi sinh vật 28

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 29

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29

2.2.2 Phương pháp phân tích 34

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 35

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Kết quả nghiên cứu xác định môi trường nhân giống và môi trường lên men thích hợp cho nấm men X dendrorhous sinh trưởng, phát triển 36

3.1.1 Kết quả lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp 36

3.1.2 Kết quả lựa chọn môi trường lên men thích hợp 38

3.2 Kết quả nghiên cứu xác định các điều kiện lên men thích hợp cho quá trình lên men sản xuất astaxanthin từ nấm men X.dendrorhous 39

3.2.1 Kết quả nghiên cứu xác định nhiệt độ lên men thích hợp 39

3.2.2 Kết quả nghiên cứu xác định pH môi trường lên men 41

3.2.3 Kết quả nghiên cứu xác định ảnh hưởng của bổ sung cơ chất đến quá trình lên men 42

3.3 Kết quả nghiên cứu xác định kỹ thuật thu hồi, tạo chế phẩm giàu astaxanthin 44 3.3.1 Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi tách chiết astaxanthin 45

3.3.2 Xác định nồng độ dung môi thích hợp cho quá trình tách chiết astaxanthin 46

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết xuất astaxanthin 47

3.3.4 Lựa chọn dung môi phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous 48

3.3.5 Lựa chọn nồng độ axít thích hợp để phá vỡ tế bào nấm X dendrorhous 50

3.3.6 Xác định công suất sóng siêu âm thích hợp cho phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous 51

3.3.7 Xác định thời gian đánh sóng siêu âm thích hợp để phá vỡ tế bào nấm men X Dendrorhous 53

3.4 Kết quả nghiên cứu chế độ sấy chế phẩm astaxanthin 54

3.4.1 Xác định nhiệt độ sấy phù hợp 54

3.4.2 Xác định tốc độ bơm nhập liệu 55

3.5 Đề xuất quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm giàu astaxanthin từ nấm men X dendrorhous, quy mô 50 lit/mẻ 56

3.6 Phân tích, đánh giá chất lượng chế phẩm astaxanthin 60

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

4.1 Kết luận 61

4.2 Kiến nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 70

DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Nội dung

X dendrorhous Xanthophyllomyces dendrorhous

H pluvialis Haematococcus pluvialis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau 11

Bảng 3.1 Khả năng sinh trưởng và sinh astaxanthin của nấm men X.dendrorhous ở các môi trường lên men khác nhau 39

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sự phát triển của nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous và hàm lượng astaxanthin thu được 40

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến hàm lượng sinh khối và hàm lượng astaxanthin 41

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hiệu suất thu hồi và chất lượng chế phẩm astaxanthin 55

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến hiệu suất thu hồi và chất lượng chế phẩm astaxanthin 56

Bảng 3.6 Kết quả phân tích chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm 60

Bảng 3.7 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm 60

Bảng 3.8 Kết quả phân tích một số kim loại nặng của chế phẩm 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Astaxanthin 4

Hình 1.2 Cấu trúc của Astaxanthin 6

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men X dendrorhous 7

Hình 1.4 Phản ứng tổng hợp astaxanthin 9

Hình 1.5 Vị trí hoạt động của Astaxanthin trên màng tế bào 12

Hình 1.6 Tế bào nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous 16

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng phát triển của nấm men X.dendrorhous 36

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy chứa dịch chiết thực vật khác nhau đến khả năng phát triển của nấm men X.dendrorhous 37

Hình 3.3 Quá trình lên men không bổ sung glucose của nấm men X dendrorhous 43

Hình 3.4 Quá trình lên men có bổ sung glucose của nấm men X dendrorhous 44

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến khả năng trích ly astaxanthin 45

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất astaxanthin 47

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng chiết xuất astaxanthin 48

Hình 3.8 Ảnh hưởng của loại dung môi đến khả năng phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous để trích ly astaxanthin 49

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ axít lactic đến khả năng phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous để trích ly astaxanthin 50

Hình 3.10 Ảnh hưởng của công suất sóng siêu âm đến khả năng phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous để trích ly astaxanthin 52

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian đánh sóng siêu âm đến khả năng phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous để trích ly astaxanthin 53

Hình 3.12 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm astaxanthin 57

dù có đến hơn 600 loại carotenoid khác nhau đã được phát hiện là được sản sinh ra bởi vi sinh vật nhưng chỉ có 3 chất được quan tâm và sản xuất thương mại thông qua quá trình lên men vi sinh vật là β-carotene, lycopene và astaxanthin (Bhosale, 2004) Ba hợp chất này có nhiều chức năng sinh học như tạo màu sắc đặc trưng, kháng oxi hoá, chống lại tia tử ngoại và là chất tiền hóc môn Trong 3 hợp chất này thì astaxanthin là hợp chất mới được biết đến với nhiều chức năng sinh học đối với người và động vật Astaxanthin là một chất chống oxy hóa rất mạnh (gấp 11 lần so với β-carotene, hơn 500 lần so với vitamin E và 6000 lần so với vitamin C), có khả năng ngăn ngừa ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch của con người Nhiều nghiên cứu của Mỹ cho thấy ngoài lợi ích kháng oxi hóa, tăng khả năng miễn dịch, astaxanthin còn có khả năng bảo vệ nơron thần kinh, làm chậm lại tác động của tuổi tác, bảo vệ võng mạc, chống lại sự thoái hóa điểm vàng, giúp cải thiện tuần hoàn máu và giảm huyết áp, phục hồi thể lực… Một số nghiên cứu của Nhật cũng chứng minh rằng astaxanthin có tác dụng tích cực đối với da như giảm nếp nhăn, tăng độ

ẩm, độ đàn hồi cho da, bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím Là một chất chống ôxi hóa, astaxanthin đem lại những lợi ích kháng viêm cực mạnh

Từ lâu, astaxanthin được sử dụng nhiều trong các sản phẩm thức ăn chăn nuôi cho thủy sản và gia cầm Nhiều sản phẩm đã được thương mại hóa trên thị trường trong nhiều năm qua với thị phần tương đối lớn Hiện nay, nhiều sản phẩm thức ăn cho cá, tôm được làm từ astaxanthin tổng hợp bởi giá thành thấp hơn rất nhiều so với sản phẩm từ tự nhiên Tuy nhiên, những sản phẩm thực phẩm cho người chứa astaxanthin thì mới bắt đầu được quan tâm trong thời gian gần đây bởi những quy

định ngặt nghèo và yêu cầu phải khai thác từ nguồn tự nhiên Con người không thể tự tổng hợp được astaxanthin mà phải sử dụng nó từ dinh dưỡng hàng ngày

Trên thế giới, astaxanthin được tìm thấy trong tự nhiên từ nhiều nguồn khác nhau như tảo, nấm men, cá hồi, tôm, vi khuẩn và lông của một số loài chim Hiện nay, đã bắt đầu có một số sản phẩm thực phẩm chức năng từ astaxanthin được lưu thông trên thị trường của Mỹ và một số nước Châu Âu Những sản phẩm astaxanthin này chủ yếu được chiết xuất từ tôm trắng Bắc Cực và vi tảo

Haematococcus pluvialis Việc sản xuất astaxanthin từ hai nguồn này phụ thuộc

nhiều vào nguồn nguyên liệu tự nhiên và đòi hỏi công nghệ phức tạp nên số lượng sản phẩm không nhiều với giá thành rất cao Cho đến nay, nấm men

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) là loài được biết đến có khả

năng sinh astaxanthin cao Mặc dù hàm lượng astaxanthin có trong tế bào nấm men thấp hơn ở tế bào vi tảo nhưng lượng sinh khối của nấm men lớn hơn và khả năng nuôi cấy nấm men đơn giản hơn so với vi tảo Astaxanthin được sản sinh ra bởi nấm men là loại astaxanthin tự do không bị este hóa nên dễ hấp thu mà không cần phải thủy phân trong hệ tiêu hóa của động vật Hơn nữa, so với astaxanthin tổng hợp và astaxanthin được sinh ra bởi vi khuẩn thì astaxanthin do nấm men sinh ra có cấu trúc dạng 3R và 3R’ là nguồn astaxanthin quan trọng trong tự nhiên và sở hữu những đặc tính sinh học có lợi

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu quy

trình công nghệ sản xuất chế phẩm giàu astaxanthin từ nấm men

Xanthophyllomyces dendrorhous ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng.”

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm giàu astaxanthin từ nấm

men Xanthophyllomyces dendrorhous ứng dụng cho sản xuất thực phẩm chức năng

Nội dung nghiên cứu

- Xác định được môi trường nhân giống và lên men thích hợp cho nấm men

Xanthophyllomyces dendrorhous sinh trưởng, phát triển và có hàm lượng

astaxanthin cao

- Xác định được các điều kiện lên men thích hợp cho nấm men

Xanthophyllomyces dendrorhous sinh trưởng, phát triển và có hàm lượng

astaxanthin cao

- Xác định được phương pháp và thông số kĩ thuật của quy trình tách chiết và thu hồi astaxanthin để tạo chế phẩm giàu astaxanthin ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về astaxanthin

1.1.1 Đặc điểm chung

Astaxanthin (3,3 -dihydroxy-P,P -carotene-4,4 -dione ) là một carotenoid có màu đỏ cam, là dẫn xuất của các hợp chất isoprenoid, chúng tạo thành các chất có màu sắc khác nhau trong tự nhiên và có chức năng sinh học thiết yếu đối với động vật Astaxanthin có thể được tìm thấy trong nhiều loại thuỷ hải sản như cá hồi, cá vền, tôm, cua, trứng cá, đôi khi astaxanthin cũng được phát hiện ở một số loài chim Động vật có vú không có khả năng tổng hợp astaxanthin và phải được cung cấp từ khẩu phần ăn (Higuera-Ciapara và cộng sự., 2006)

Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4 Công thức phân tử astaxanthin tương tự như của β-carotene nhưng nó phức tạp hơn nhiều Astaxanthin

có 13 nối đôi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đôi nên khả năng chống oxi hóa của

nó cũng cao hơn β-carotene

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Astaxanthin

Astaxanthin là hợp chất không phân cực nên rất ít tan trong nước, nó tan trong các dung môi hữu cơ như acetone, dimethyl-sulfoxide, pyridine, cồn, dietyester, ete, dầu mỏ, dầu thực vật…

Astaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu

đỏ cam rất đẹp Tính hấp thụ ánh sáng của astaxanthin có thể bị thay đổi khi astaxanthin liên kết với các chất khác Nhiệt độ nóng chảy của astaxanthin là

215°C÷216°C Hệ số tắt quan E1% 1cm (nồng độ astaxanthin 1% và cruvet dày 1cm):

- Trong dầu hướng dương ở bước sóng 487nm là 2290

- Trong dầu nành ở bước sóng 487nm là 2145

- Trong dầu phộng ở bước sóng 487nm là 2440

Trong phân tử astaxanthin có chuỗi polyen liên kết với các nhóm keto, hydroxyl gắn với các vòng ở đầu mạch nên astaxanthin rất nhạy với ánh sáng, nhiệt

độ cao và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Sự oxy hóa astaxanthin diễn ra nhanh khi có sự hiện diện của sunfit, ion kim loại, độ ẩm, oxy không khí

Astaxanthin ở dạng tự do rất dễ bị oxy hóa bởi tác nhân electrophil như oxy phân tử Nhưng khi astaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng este hóa thì chúng trở nên bền hơn Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin trong cơ thể được giải thích bởi khả năng bắt giữ gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng:

RCOO* + Ast RCOO-Ast Astaxanthin phản ứng với axít yếu làm dịch chuyển cực đại hấp thụ của phân

tử về phía bước sóng dài Khi trung hòa bằng bazơ yếu, cấu trúc phân tử astaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như: HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của astaxanthin làm nhạt màu đỏ cam Trong môi trường kiềm khi có mặt của không khí, astaxanthin bị oxy hóa nhanh chóng thành astacene có màu đỏ sẫm

1.1.2 Cấu trúc của astaxanthin

Phân tử astaxanthin có hai carbon không đối xứng ở vị trí 3 và 3 của vòng P- ionone Astaxanthin có ba dạng cấu hình là astaxanthin tự do, monoester và diester tùy thuộc vào sự kết hợp của 1 hoặc 2 gốc hydroxyl với các axít béo Nhóm ester tạo ra mối liên kết giữa astaxanthin và protein Vì vậy, astaxanthin không thể gắn kết với protein nếu liên kết ester không tồn tại Do cấu trúc của astaxanthin có 2 vị trí 3 và 3’ở dạng chiral, cho nên chúng có 3 dạng đồng phân hình học: 3R-3’R; 3R-

3’S và 3S-3’S (Hình 1.2) Trong đó, 3S-3’S là dạng astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hóa mạnh nhất, dạng 3R-3’S không có hoạt tính sinh học, dạng 3R-3’R có hoạt tính yếu (Ambati và cs, 2014)

Hình 1.2 Cấu trúc của Astaxanthin

(Dạng tự do (A), dạng monoester (B), dạng diester (C) và các đồng phân hình học (D) R là

các chuỗi axít béo bão hòa hoặc không bão hòa) (Nguồn: Mia và cộng sự., 2006)

1.1.3 Sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men X dendrorhous

Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men X dendrorhous được thể

hiện trong hình 1.3 dưới đây

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men X dendrorhous

Gen idi mã hóa enzym xúc tác quá trình đồng phân hóa isopentenyl

pyrophospate (IPP) thành dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) Quá trình chuyển hóa những chất tiền thân isoprenoid thành β-carotene được xúc tác bởi 4 enzyme:

(1) enzyme GGPP synthase (được mã hóa bởi gen crtE) xúc tác thêm 3 phân tử IPP

liên tiếp vào DMAPP thành chất tiền thân C20-GGPP (Niklitschek và cộng sự,

2008); (2) enzyme phytoene synthase (mã hóa bởi gen crtYB) liên kết hai phân tử GGPP thành phytoene; (3) enzyme phytoene desaturase (mã hóa bởi gen crtI) đưa 4

liên kết đôi vào phân tử phytoene để hình thành nên lycopene; (4) enzyme lycopene

cyclase (mã hóa bởi gen crtYB) chuyển hóa liên tục đuôi acrylic của lycopene thành

vòng β để hình thành nên γ-carotene và β-carotene (Alcaino và cộng sự 2007)

Hai enzyme khác chuyển hóa β-carotene thành astaxanthin thông qua một số chất sinh tổng hợp trung gian gồm: enzyme ketolase kết hợp 2 nhóm 4-keto trong phân tử β-carotene với nhau và enzyme hydroxylase ghép hai nhóm 3-hydroxy với nhau

Trong nấm men X dendrorhous, cả hai hoạt động trên có thể diễn ra cùng

nhau nhờ enzyme đơn lẻ có tên là astaxanthin synthetase (CrtS) được mã hóa bởi

gen crtS xúc tác liên tiếp keton hóa nhóm 4-keto và hydroxy hóa nhóm 3-hydroxyl

của β-carotene Enzyme khử cytochrom P450 được mã hóa bởi gen crtS được phát

hiện là có vai trò bổ trợ cho enzyme CrtS ở nấm men X dendrorhous bằng cách

cung cấp những electron cần thiết cho quá trình oxy hóa cơ chất Việc biểu hiện của

gen crtS ở chủng sinh β-carotene là Saccharomyces cerevisiae đã không sản sinh astaxanthin nhưng biểu hiện gen tổ hợp của hai gen crtS và crtR thì lại sản sinh ra

được lượng nhỏ astaxanthin (Alcaino và cộng sự 2007)

Việc nghiên cứu sàng lọc, lựa chọn những chủng nấm men đột biến có khả năng sản sinh astaxanthin cao và tối ưu hóa khả năng nuôi cấy nấm men có thể đạt

được mục đích làm tăng hàm lượng astaxanthin trong nấm men X dendrorhous

1.1.4 Các nguồn cung cấp astaxanthin

Có hai nguồn astaxanthin chính là nguồn astaxanthin tổng hợp hóa học và tự nhiên

1.4.1.1 Nguồn tổng hợp hoá học

Hiện nay, astaxanthin tổng hợp là nguồn cung cấp chủ yếu cho nuôi trồng thuỷ sản Hơn 95% astaxanthin tổng hợp trên thị trường được sử dụng làm thức ăn

bổ sung nhằm tạo ra các mầu sắc của đối tượng nuôi khác nhau

Quá trình tổng hợp hóa học astaxanthin được sử dụng lâu đời và rộng rãi nhất liên quan đến phản ứng Wittig của muối photphat ở vị trí C15 với dialdehyde ở vị trí carbon C10 (Hình 1.4A) Các phương pháp khác bao gồm hydroxyl hóa canthaxanthin (Hình 1.4B) (Berhard và cs, 1984), một quá trình trùng hợp 3 mạch carbon có chiều dài 10, 20 và 30 nguyên tử carbon thông qua ngưng tụ dienolether và các đồng phân của lutein được chiết xuất từ hoa cúc vạn thọ để tạo thành zeaxanthin và sau đó chất này bị ôxy hóa để hình thành astaxanthin (Hình 1.4C) (Schloemer và Davis, 2001)

Trong các loài giáp xác thủy sản, astaxanthin chủ yếu được tập trung ở phần

vỏ ngoài, chiếm từ 58 đến 87% carotenoid tổng số Hàm lượng astaxanthin có trong

vỏ tôm, cua thay đổi đáng kể tùy thuộc vào loài, từ 10 đến 140 mg/kg khối lượng tươi và tồn tại ở dạng 3S - 3’S Chính vì vậy, vỏ tôm, cua chính là một nguồn astaxanthin đáng kể trong tự nhiên Tuy vậy, hàm lượng astaxanthin trong các nguyên liệu này tương đối thấp Trong khi đó, độ ẩm, hàm lượng tro và các chất dinh dưỡng khác trong vỏ tôm, cua lại rất cao đã gây ra một số khó khăn trong việc sản xuất đảm bảo ổn định chất lượng thức ăn cho động vật nuôi trồng (Higuera-Ciapara và cộng sự, 2006)

b) Nấm men

Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) là một loài nấm men

duy nhất được biết đến hiện nay có khả năng tổng hợp astaxanthin lên tới 0,5% sinh khối khô Một lợi thế của chủng này là có khả năng sinh trưởng nhanh và đạt mật độ

tế bào cao trong quá trình lên men Tích lũy astaxanthin ở nấm men thông qua con đường mevalonate (Schmidt và cộng sự, 2011) Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin tổng hợp được phụ thuộc nhiều vào đặc điểm sinh học của chủng, phương pháp và

điều kiện nuôi cấy Ngoài ra, do Ph rhodozyma có cấu tạo vách tế bào cứng, khó

tiêu hóa đối với các động vật nên trong quá trình sản xuất các chế phẩm sinh học

chứa astaxanthin từ loài nấm men này cần phải phá hủy thành tế bào bằng các phương pháp cơ học hay xử lý bằng enzyme khác nhau

c) Tảo

Astaxanthin có thể được sản xuất từ các loại tảo khác nhau như

Ankistrodesmus branuii, Chlorella zofingiensis, Dunaliella salina, Euglena rubida, Chlorococcum Tuy nhiên, hàm lượng astaxanthin ở các chủng tảo nêu trên tương đối thấp và không thích hợp để sản xuất ở quy mô lớn Trong khi đó, vi tảo lục H pluvialis đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học và sản xuất

ứng dụng vì chúng có khả năng tích luỹ một lượng lớn astaxanthin (7000 - 55000 µg/g tế bào, tương ứng 0,7 - 5,5% sinh khối khô) Astaxanthin từ tảo

Haematococcus chứa 5% dạng tự do và 95% dạng được ester hóa (75% monoester

Cá hồi cũng là một nguồn cung cấp astaxanthin tự nhiên Hàm lượng

astaxanthin trong cá hồi hoang dã Oncorhynchus dao động trong khoảng 26 - 38

mg/kg thịt cá Hàm lượng astaxanthin trong cá hồi Đại Tây Dương nuôi là 6 - 8 mg/kg thịt cá Với 165 g thịt cá hồi có thể cung cấp đến 3,6 mg astaxanthin cho khẩu phần ăn hàng ngày (Ambati và cs, 2014)

Các nguồn cung cấp astaxanthin và hàm lượng astaxanthin ở các cơ thể khác nhau được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Nguồn cung cấp astaxanthin khác nhau

So với astaxanthin tự nhiên từ nấm men hoặc vi tảo lục H pluvialis,

astaxanthin tổng hợp hóa học có chi phí nguyên vật liệu; năng lượng rẻ nhất (40 và

26 USD/kg astaxanthin) Chính vì vậy, giá thành sản xuất astaxanthin là thấp nhất

so với 2 nguồn còn lại Tuy nhiên, astaxanthin tổng hợp nhân tạo chứa hỗn hợp của

3 dạng đồng phân 3S-3’S; 3R- 3’S và 3R-3’R tương ứng với tỉ lệ là 1:2:1 Như vậy, chỉ có 25% astaxanthin tổng hợp nhân tạo có hoạt tính và hữu dụng Với sự hiện diện của các dạng đồng phân hình học khác trong khẩu phần thức ăn sẽ dẫn đến sự cạnh tranh cơ chất trong quá trình chuyển hóa astaxanthin trong cơ thể động vật

Nguồn cung cấp Hàm lượng astaxanthin

(% SKK) Chlorophyceae

Haematococcus pluvialis NIES - 144 7,7

Haematococcus pluvialis (K-0084) 3,8

Haematococcus pluvialis (Local isolation) 3,6

Haematococcus pluvialis (AQSE002) 3,4

nuôi Như vậy, khả năng hấp thụ astaxanthin tổng hợp thấp hơn rất nhiều so với astaxanthin có nguồn gốc tự nhiên

Astaxanthin trong các sản phẩm tự nhiên ở dạng ester hóa nên nó ổn định hơn trong việc ngăn ngừa quá trình ôxy hóa (Schmidt và cộng sự, 2011) Chỉ

có astaxanthin được tổng hợp từ tảo và nấm men mới được sử dụng cho con người, trong khi đó dạng tổng hợp nhân tạo được sử dụng chủ yếu cho thức ăn gia Do vậy,

khai thác astaxanthin từ nguồn tự nhiên, đặc biệt là từ tảo H pluvialis vẫn đang

được quan tâm và có nhiều cơ hội để phát triển ngày càng mạnh

1.1.5 Sinh hóa học của astaxanthin

Astaxanthin có chứa liên kết đôi xen kẽ, nhóm hydroxyl và nhóm keto Nó

có hai tính chất ưa mỡ và ưa nước Màu đỏ được tạo ra do sự liên kết đôi liên tiếp tại trung tâm của hợp chất Hoạt động sinh học của astaxanthin tốt hơn so với các chất chống ôxy hóa khác (-carotene, vitamin C) bởi vì nó có thể liên kết với màng lipít kép của tế bào từ bên trong đến bên ngoài (Hình 1.5) Vì vậy, tế bào được bảo

vệ toàn diện hơn (Ambati và cs, 2014)

Hình 1.5 Vị trí hoạt động của Astaxanthin trên màng tế bào

(Nguồn: Ambati và cộng sự, 2014)

1.1.6 Đặc tính chống ô xy hóa của astaxanthin

Astaxanthin có vai trò là chất chống ôxy hoá mạnh Sự trao đổi chất bình thường ở sinh vật hiếu khí tạo ra các gốc tự do như hydroxyl, peroxide và phân tử ôxy có hoạt tính (reactive oxygen species - ROS) cần thiết để duy trì sự sống Tuy nhiên, khi hàm lượng các chất này quá cao sẽ gây nguy hiểm bởi chúng có thể ôxy

hoá với các thành phần của tế bào như protein, lipit, carbohydrate và ADN in vivo

Để kiểm soát và làm giảm quá trình này, cơ thể con người sản sinh ra các chất chống ôxy hoá như super oxide dismutase (SOD), catalase, peroxidase, Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, những hợp chất này lại không đủ để bảo vệ cơ thể chống lại stress ôxy hoá

Các nghiên cứu cho thấy, astaxanthin có hoạt tính chống ôxy hoá cao gấp 10 lần so với các carotenoid khác như Zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, ß-carotene và cao hơn 100 lần so với a - tocopherol Vì vậy, astaxanthin được gọi là một “supper vitamin E” Astaxanthin thực hiện các hoạt động chống ôxy hóa bằng cách loại bỏ các gốc tự do (chúng phản ứng với các gốc này để tạo ra các hợp chất không độc khác) hoặc dập tắt các phản ứng ôxy hoá Đặc tính này của astaxanthin có thể do sự tương tác vật lý và hóa học của astaxanthin với các màng tế bào (Ambati và cs, 2014)

1.1.7 Ứng dụng của astaxanthin

Chất màu tự nhiên astaxanthin với hoạt tính chống ôxy hóa cao đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như làm thức ăn bổ sung cho người, thuốc điều trị trong y học, thức ăn bổ sung cho chăn nuôi

1.1.7.1 Astaxanthin trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS)

a) Trong nuôi cá hồi

Màu sắc của cá hồi và các loại giáp xác được xem là một chỉ tiêu về chất lượng Màu đỏ của những sinh vật này bắt nguồn từ màu sắc của các carotenoid được chúng thu nhận từ thức ăn Loại carotenoid chiếm ưu thế trong hầu hết các loài giáp xác và cá hồi là astaxanthin Mặc dù trên thực tế, astaxanthin được sử

dụng rộng rãi với mục đích duy nhất là tạo màu cho các động vật trong NTTS, tuy nhiên astaxanthin còn có nhiều vai trò quan trọng khác như thúc đẩy sự thành thục, tăng tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ sống sót của trứng, cải thiện sự phát triển của phôi

Một nghiên cứu gần đây ở Na Uy đã chứng minh rằng cá hồi Đại Tây Dương ở giai đoạn còn non sẽ phát triển tốt khi được cung cấp đầy đủ astaxanthin trong khẩu phần ăn Astaxanthin được xem như một loại dinh dưỡng thiết yếu với hàm lượng cần thiết tối thiểu là 5,1 mg/kg Tuy nhiên, nếu hàm lượng astaxanthin trong khẩu phần ăn đạt 13,7 mg/kg thì hàm lượng lipít trong thịt cá sẽ tăng lên 20%

và sự phát triển của cơ thể sẽ đầy đủ hơn so với mức 5,3 mg/kg astaxanthin (Lorenz

và Cysewski, 2000)

b) Trong nuôi cá cảnh

Cá cảnh không tự tổng hợp được carotenoid mà lấy từ nguồn thức ăn như vi tảo, san hô hoặc con mồi có chứa loại chất màu này Khi bổ sung astaxanthin vào chế độ ăn, cá sẽ chuyển hóa astaxanthin có trong thức ăn thành tuaxanthin và tích lũy chúng trong da và làm cho cá có màu sắc rực rỡ Cá có khả năng hấp thụ các loại carotenoid tốt theo thứ tự như sau: zeaxanthin (không phổ biến) > astaxanthin > lutein (có nhiều trong các loại thực vật như ngô )

Như vậy, việc sử dụng astaxanthin trong NTTS không chỉ quan trọng khi đứng trên phương diện tạo sắc tố mà astaxanthin còn được xem như là một chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh sản đầy đủ của các loài thuỷ hải sản

có giá trị thương mại

1.1.7.2 Astaxanthin làm thức ăn bổ sung cho con người

Astaxanthin có tác dụng trong việc bảo vệ võng mạc khỏi bị ôxy hóa, cải thiện những tổn thương võng mạc, bảo vệ các tế bào tiếp nhận ánh sáng khỏi thoái hóa, chống lại sự thoái hóa điểm vàng do tuổi tác - nguyên nhân gây mù loà (Palozza và cộng sự, 2009) Chúng giúp bảo vệ nơ ron thần kinh và có thể làm chậm lại tác động của tuổi tác (giảm các triệu chứng như giảm trí nhớ, suy giảm chức năng thần kinh) Con người sử dụng astaxanthin thường xuyên sẽ giảm đáng

kể sự tích tụ hydroperoxide phospholipid, một hợp chất được chứng minh là đã được tích tụ nhiều ở những người bị bệnh mất trí nhớ, hay quên ở người lớn tuổi

Do đó, nó có thể chống lại bệnh Alzheimer Ngoài ra, astaxanthin giúp cải thiện tuần hoàn máu và giảm huyết áp Nó rất có lợi cho màng tim, có tác động tốt lên máu, tăng lượng HDL (high density lipoprotein - cholesterol, cholesterol có lợi) và giảm triglycerides (Iwamoto và cs, 2001) Do có khả năng bắt giữ các gốc tự do được hình thành trong quá trình quang hoá nên astaxanthin có tác dụng tích cực đối với da như giảm nếp nhăn, tăng độ ẩm, độ đàn hồi,

Astaxanthin có thể bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím bằng cách vô hiệu hóa hoặc phá hủy các gốc tự do được hình thành do tia cực tím và ngăn chặn những tác hại như cháy nắng hoặc viêm da Chúng còn có chức năng bảo vệ chống tác hại của tia tử ngoại (Rao và cộng sự, 2013) Một đặc điểm đặc biệt quan trọng của astaxanthin là chúng không có hoạt tính của một tiền vitamin A Vì vậy, trong các

cơ thể đã không xảy ra nguy cơ ngộ độc cấp tính do có sự tích lũy quá nhiều astaxanthin Kết quả thực nghiệm trên chuột đã cho thấy không có một tác dụng nguy hại nào khi sử dụng liều astaxanthin 400 mg/kg trong 41 ngày (Nishikawa và

cs, 2005)

Astaxanthin tách chiết từ tảo, nấm men đã được chứng minh là an toàn, không có tác dụng phụ và được sử dụng rộng rãi như là một thực phẩm chức năng Đối với người, liều dùng an toàn có thể đạt đến 14,4 mg astaxanthin/ngày trong vòng 2 tuần (Miki và cs, 1998)

1.1.7.3 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi gia cầm

Astaxanthin đã được dùng làm phụ gia trong chế biến thức ăn nuôi gia súc, gia cầm, làm tăng màu vàng cam cho lòng đỏ trứng, tăng tỷ lệ nở con, giảm khả

năng nhiễm khuẩn Salmonella (Lorenz & Cysewski, 2000) Khi bổ sung astaxanthin

vào thức ăn của gà đã cho thấy màu sắc của lòng đỏ trứng gà được tăng cường, tăng khả năng sinh sản ở gà mái, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và giảm tỷ lệ tử vong (Lignell & Inborr, 2000)

1.2 Tổng quan về nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous

- Loài : Phaffia rhdozyma

Hình 1.6 Tế bào nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous

Xanthophyllomyces dendrorhous ban đầu được phân lập vào cuối những năm

1960, bởi Phaff và cộng sự Nhóm tác giả đã thu thập được 10 chủng

Xanthophyllomyces dendrorhous từ nhiều loại cây lá rộng khác nhau ở vùng núi của

Nhật Bản và Alaska Những chủng này có màu đỏ đến màu da cam và có thể lên men glucose và tạo ra các hợp chất amyloid Phaff gọi những chủng này

là Rhodozyma montanae, nhưng do chẩn đoán Latin không được cung cấp, tên này không hợp lệ Sau đó, nấm men đơn bào này được mô tả là Phaffia rhodozyma (nay

là Xanthophyllomyces dendrorhous) và 67 chủng khác được phân lập từ nhựa cây Bạch Dương (Betula verrucosa) ở Nga Nấm men đỏ Xanthophyllomyces dendrorhous là một loại nấm men duy nhất được biết đến là có khả năng sản sinh

astaxanthin - một chất chống oxy hoá mạnh được ứng dụng rộng rãi trong ngành nuôi trồng thủy sản, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm

1.2.2 Phân bố

X dendrorhous ban đầu được phân lập từ nhiều loại cây lá rộng khác nhau ở các vùng miền núi của Nhật Bản và Alaska Cho tới gần đây X dendrorhous chỉ được tìm

thấy trong các dòng nhựa của một số cây lá rộng ở Bắc bán cầu Nhựa cây này có chứa

nhiều đường và các carbohydrate khác và nấm men X dendrorhous đã tận dụng khả năng lên men của nó để sử dụng các chất nền này để tồn tại và phát triển

Tuy nhiên một giả thiết nghiên cứu mới cho thấy X dendrorhous có phân bố

sinh thái rộng hơn so với hiện tại và sự xuất hiện của nó ở Nam bán cầu được liên kết với các hệ sinh thái tương tự ở Bắc bán cầu

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Tế bào nấm men X dendrorhous có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước tương đối nhỏ, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Nguồn dinh dưỡng chủ yếu của chúng là sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, maltose như nguồn cacbon, chúng sử dụng axit amin và muối amoni là nguồn cung cấp nito

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men X

dendrorhous

1.3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

a) Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

Các nguồn Cacbon thúc đẩy sự tổng hợp astaxanthin trong các loại nấm men

khác nhau của X dendrorhous: Các disaccharides, maltose và sucrose khác thúc đẩy

sự tổng hợp sắc tố cao cho nấm X dendrorhous Sucrose và glucose thúc đẩy nấm

men tăng trưởng nhanh hơn các nguồn cacbon khác Tuy nhiên khi tăng nồng độ glucose trong môi trường lên men thì năng suất tạo astaxathin lại giảm đáng kể Mặc dù succinate và glucono-δ-lactone (GDL) có hỗ trợ sự tăng trưởng từ từ của nấm men, nhưng các hợp chất này cũng có vai trò giúp tăng cao nồng độ

astaxanthin trong tế bào nấm men Đường D-mannitol cũng có vai trò giúp cho nấm men sinh trưởng và tổng hợp sắc tố.

b) Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 trong phạm vi từ 0-25 đến 5 mg/l có ảnh hưởng

nhỏ đến tốc độ tăng trưởng và khả năng sản xuất carotenoid của nấm men X dendrorhous Khi thay thế của (NH4)2HPO4 hoặc peptone cho (NH4)2SO4 ở nồng

độ khác nhau cũng không ảnh hưởng đến các giá trị trên

c) Ảnh hưởng của muối

Hàm lượng astaxanthin trong tế bào sẽ tăng khi giảm hàm lượng amoni xuống, tương tự hàm lượng và nồng độ astaxanthin sẽ tăng lên khi giảm lượng phosphate xuống Nồng độ amoni hoặc phosphate thấp cũng làm tăng hàm lượng axit béo trong tế bào

1.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

a) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của nấm men X dendrorhous,

đặc biệt là sản lượng của nấm men có sự thay đổi: Tại nhiệt độ 22°C sản lượng nấm men lúc này tương đối ổn định Sau đó trên 22°C sản lượng nấm men có hiện tượng giảm đáng kể Ở nhiệt độ 27,5°C nấm men X dendrorhous lại có sự tăng trưởng mạnh, khối lượng của nó tăng gấp hai lần và sau đó sẽ ngừng phát triển

b) Ảnh hưởng của pH

Độ pH ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra

astaxanthin của nấm men X dendrorhous Một số công trình nghiên cứu trên thế

giới đã chỉ ra rằng pH tối thích cho sự sinh trưởng của nấm men X dendrorhous là

6 và tối ưu cho sự sản sinh astaxanthin là 4 Một chiến lược điều khiển pH trong quá trình lên men mẻ có bổ sung cơ chất đã được thực hiện bởi Hu và cộng sự như sau: trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (từ bắt đầu lên men cho tới giờ thứ 80)

pH của môi trường lên men được duy trì ở 6 và bắt đầu từ giờ thứ 80 trở đi, pH

được giữ ở 4

c) Ảnh hưởng của ánh sáng

Ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tăng trưởng và tổng hợp carotenoid của

X dendrorhous Sự tiếp xúc của nấm men với cường độ ánh sáng cao dẫn đến sự ức

chế tăng trưởng và giảm tổng hợp carotenoid Các thành phần của carotenoid trong nấm men cũng thay đổi: β-zeacarotene tăng, β-carotene giảm và xanthophylls bao gồm astaxanthin, phoenicoxanthin và HDCO (3-hydroxy-3′-4′-didehydro-β-Ψ-caroten-4-one) cũng giảm theo

d) Ảnh hưởng của oxy

Oxy là một chất nền quan trọng cho quá trình lên men sản xuất astaxanthin

của nấm men X dendrorhous

1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng astaxanthin trên thế giới 1.4.1 Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy nấm men

Việc sử dụng những nguyên vật liệu rẻ tiền từ sản xuất công nghiệp cho quá

trình lên men của X dendrorhous tạo ra astaxanthin vẫn đang được các nhà nghiên

cứu thử nghiệm Những loại cơ chất như rỉ đường, nước ép quả, phụ phẩm của công nghiệp chế biến,… đã từng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm Chất thủy phân, phế phụ phẩm của quá trình xử lý hạt cải để thu hương liệu, cũng đươc sử dụng cho lên men đã tạo ra sinh khối nấm men và astaxanthin đạt 19,6 g/l và 25,8 mg/l tương ứng, tăng lượng astaxanthin gấp 11 lần so với sản lượng thu được trên môi trường YM thông thường (Tinoi và cộng sự, 2006) Rỉ đường và men thải của quy trình sản xuất bia được phối hợp sử dụng đúng cách rất phù hợp cho sự sinh trưởng và tạo màu của nấm men (Okagbue and Levis 1984)

Sản phẩm astaxanthin sản xuất bằng phương pháp lên men X dendrorhous quy mô

20 lít từ phụ phẩm của bia được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư vú (Teo và cộng sự, 2005)

Phế phụ phẩm nông nghiệp là nguồn nguyên liệu tiềm năng phong phú cho chuyển hóa sinh học để sản xuất nhiên liệu công nghiệp và hóa học Chẳng hạn như,

cứ 25 kg ngô sử dụng để chế biến chất làm ngọt, dầu, hay etanol thì thải ra 7 kg phụ phẩm giàu protein và xơ Đường thu được từ ngô (chủ yếu là glucose, xylose, và

arabinose) được thử nghiệm nuôi cấy 5 chủng X dendrorhous để sản xuất

astaxanthin Kết quả là cả 5 chủng này đều chuyển hóa cả ba loại đường và arabinose cho sản lượng astaxanthin cao nhất, trong khi đó nếu hàm lượng glucose cao thì sẽ làm giảm sự sử dụng của hai loại đường kia Chất xơ thủy phân của ngô pha loãng có thể thu được lượng astaxanthin là 0,8 mg/g tổng lượng đường tiêu thụ (Nghiem và cộng sự, 2009) Hơn nữa, có tới 6 sản phẩm phụ rẻ tiền thu được từ khâu nghiền ướt ngô cho sản xuất nhiên liệu etanol được sử dụng làm nguồn cacbon

cho nhân nuôi X dendrorhous sản xuất astaxanthin Ba trong số chúng (bã cặn, chất

tan cô đặc và gluten ngô) có thể sử dụng tạo ra sản lượng lên tới 65%, 148% và 104% carotenoid cho 1 lít môi trường YM, tương ứng Điều này chỉ cho thấy những chất này khi sử dụng ở nồng độ thích hợp có thể là nguồn cơ chất hiệu quả và kinh

tế để nuôi cấy và sản xuất astaxanthin (Hayman và cộng sự, 1995)

Những nguồn cacbon tự nhiên như rỉ đường, nước nho ép, nước cốt dừa, nước dứa ép, và dịch chiết thực vật cũng có vai trò làm thúc đẩy sự tổng hợp

astaxanthin của X dendrorhous Bên cạnh bã dừa ép được sử dụng nhiều trong sản

xuất dầu gội đầu, bánh kẹo, thực phẩm,… thì nước côt dừa lại có thể được sử dụng

để tăng sản lượng astaxanthin Sản lượng astaxanthin có thể lên tới 1,8 mg/g, cao hơn lượng astaxanthin thu được khi sử dụng các nguồn cacbon tự nhiên khác (Dominguez-Bocanegra và cộng sự, 2012)

Nước dứa ép pha loãng cũng được sử dụng làm môi trường nuôi cấy thử nghiệm nấm men cho sinh astaxanthin và cho kết quả thành công Chủng nấm men

X.dendrorhous đột biến được nuôi cấy trên môi trường nước dứa ép pha loãng ở

nồng độ 10% đã cho sản lượng astaxanthin tăng 66% so với nuôi trên môi trường

YM thông thường (Jirasripongpun và cộng sự, 2008)

X dendrorhous cũng có thể lên men trên môi trường nước nho ép (Meyer và

Preez, 1994) Mặc dù sự có mặt của đường glucose làm hạn chế khả năng chuyển hóa đường fructose nhưng một phần đường này vẫn được sử dụng trước khi chuyển hóa hết đường glucose Lượng carotenoid và astaxanthin tạo ra cùng với sự sinh trưởng của nấm men đạt 2,1 và 1,3 mg/g, tương ứng Bổ sung thêm cao nấm men vào môi trường chứa ít nước nho ép làm tăng đáng kể tốc độ sinh trưởng của nấm men, chất màu tổng

số và hàm lượng astaxanthin của tế bào

Môi trường sử dụng những nguồn dinh dưỡng rẻ tiền như nước mía pha

loãng, ure và muối natri phốt phát cũng đã được thực nghiệm trong nhân nuôi X dendrorhous Hàm lượng astaxanthin được cải thiện cùng với sản lượng tế bào

(>1,3 mg/g và >5 g/l, tương ứng) (Fontana và cộng sự., 1996) Dịch chiết ngô được chứng minh là nguồn bổ sung có giá trị làm tăng sinh khối nấm men (9,2 g/l) và astaxanthin (1,3 mg/g)

Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến quá trình sinh tổng hợp

astaxanthin ở nấm men X dendrorhous đã được nghiên cứu nhiều Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 11 chủng nấm men X dendrorhous đã được kiểm chứng khi

sử dụng nhiều hợp chất là nguồn cacbon tiềm năng Kết quả đã chỉ cho thấy rằng có

sự biến đổi màu sắc của các chủng so với chủng nuôi trên môi trường glucose Thực nghiệm thống kê được tiến hành để tối ưu hóa thành phần môi trường lên men đã chỉ ra rằng 3,89% glucose, 0,29% cao nấm men là hai thành phần quan trọng nhất ảnh hưởng đến sản xuất astaxanthin với sản lượng đạt 36 mg/l (Kim và cộng sự., 2005) Trong khi đó, nguồn nitơ tối thích là 0,28 g/l (NH4)2SO4, 0,49 g/l KNO3 và 1,19 g/l nước chiết thịt bò, sản lượng astaxanthin đạt 7,7 mg/l và 1,0 mg/g (Ni và cộng sự, 2007)

Ảnh hưởng của muối amôn, phốt phát và xitrat đến quá trình sản xuất astaxanthin cũng được quan tâm khảo sát Hàm lượng astaxanthin và axit béo trong

tế bào tăng lên khi sử dụng nồng độ muối amôn và phốt phát thấp Cụ thể, khi sử dụng môi trường chứa 12,9 mM muối amôn thì hàm lượng astaxanthin đạt 0,23 mg/g (2,3 mg/l) và khi sử dụng 0,65mM phốt phát thì hàm lượng astaxanthin đạt

0,21 mg/g (2,4 mg/l) (Flores-Cotera và cộng sự., 2001) Cũng giống như sự tổng hợp chất béo ở những loài nấm men chứa dầu khác, muối xitrat có thể là nguồn cacbon cho quá trình sinh tổng hợp chất béo và carotenoid Thực tế là, việc bổ sung thêm muối xitrat làm tăng đáng kể hàm lượng astaxanthin sau quá trình lên men Việc thúc đẩy sự sinh tổng hợp carotenoid ở nồng độ muối amôn hay phốt phát thấp

và xitrat cao cùng diễn ra đồng thời với sự tổng hợp protein giảm cho thấy rằng việc hạn chế sinh tổng hợp protein có thể đóng vai trò quan trọng trong sản xuất carotenoid (Flores-Cotera và cộng sự., 2001)

1.4.2 Các nghiên cứu về quá trình lên men

Trong sản xuất astaxanthin từ nấm men, việc áp dụng công nghệ lên men tối

ưu cũng là điểm mấu chốt quan trọng quyết định sản lượng astaxanthin tạo ra Thiết

kế thực nghiệm và phương pháp luận về hiệu ứng bề mặt sử dụng trên hai môi trường là YM và Yucca (giảm thiểu chủ yếu sử dụng dịch chà là) để đánh giá 5 thông số lên men gồm nhiệt độ, pH, tỷ lệ tiếp giống, hàm lượng cacbon và nitơ Kết quả là hàm lượng cacbon và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sản xuất astaxanthin Thiết kế hiệu ứng bề mặt bậc hai đã xác định được điều kiện tối ưu đạt sản lượng astaxanthin cao nhất là nhiệt độ đạt 19,7ºC, 11,25 g/l cacbon, 0,5 g/l nito, pH=6,0 và tỷ lệ tiếp giống là 5% Quá trình lên men ở điều kiện này lượng astaxanthin thu được là 8,1 mg/l, tăng 92% so với sản lượng astaxanthin thu được ở điều kiện ban đầu (Ramirez và cộng sự, 2001)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng glucose và oxy là hai yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trao đổi sơ cấp và sản sinh astaxanthin Lên men ở điều kiện nồng độ glucose cao hoặc ít oxy thì tốc độ sản sinh astaxanthin bị giảm đi đáng kể Công nghệ lên men sản xuất astaxanthin sản lượng cao tối ưu gồm hai bước chính: đầu tiên, hàm lượng glucose được kiểm soát ở 25 g/l ở pha lag và đầu pha lũy thừa để đạt được lượng sinh khối cao nhất, tiếp đến, hàm lượng glucose được điều chỉnh xuống thấp tới 5 g/l ở cuối pha lũy thừa và pha tĩnh Công nghệ này có thể thu được lượng sinh khối tới 24 g/l và lượng astaxanthin là 29 mg/l, tăng 53% và 109% so với công nghệ lên men mẻ (Lu và cộng sự, 2008) Một quá trình lên men mẻ có bổ

sung dưỡng chất sử dụng môi trường Yuca cũng được tiến hành thu được lượng sinh khối đạt 39 g/l và lượng astaxanthin đạt 24 mg/l (Ramirez và cộng sự., 2006)

Cung cấp oxy được coi như là một thông số quan trọng tác động đến sự sinh

trưởng của nấm men X dendrorhous và tích lũy astaxanthin Cung cấp lượng oxy

nhiều tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp astaxanthin Sản lượng sinh khối tế bào nấm men đạt cao nhất (19 g/l), lượng carotenoids tối ưu (18 mg/l)

và lượng astaxanthin cao nhất (14 mg/l; 0,8 mg/g) tại giá trị hệ số truyền thể tích oxy ban đầu (KLa) là 148,5/h Sự sinh trưởng của tế bào nấm men X.dendrorhous bị

ức chế đáng kể khi điện thế oxy hòa tan (DOT) kiểm soát ở mức xấp xỉ 20% không khí bão hòa do lượng oxy thấp trong môi trường Hàm lượng astaxanthin tạo ra trong điều kiện 50% DOT cao hơn điều kiện 20% DOT (Wang và Yu, 2009)

Sự khác biệt về các gốc peroxyl và nguyên tử ô xy đơn lẻ hoạt tính có ảnh

hưởng đến thành phần carotenoid và quá trình sinh tổng hợp trong X dendrorhous

Nguyên tử ô xy đơn gây ra sự tích tụ carotenoid và các gốc peroxyl làm giảm lượng

astaxanthin và làm tăng lượng β-caroten Sản lượng astaxanthin sản sinh bởi X dendrorhous tăng lên đáng kể khi có mặt H2O2 đạt 10,4 mg/l, tăng 65% so với đối chứng không có H2O2 Hoạt tính của enzyme catalase nội bào cũng tăng lên chỉ cho thấy rằng sự sinh tổng hợp astaxanthin có thể được thúc đẩy bởi H2O2 với vai trò chất kháng ô xy hóa (Liu và Wu, 2006)

Một quy trình nuôi cấy bán liên tục (tái thiết lập môi trường nuôi cấy bằng cách duy trì tế bào) được đánh giá cùng với những quy trình lên men theo mẻ và lên men mẻ có bổ sung dưỡng chất nhiều lần để sản xuất astaxanthin Một quy trình với môi trường được bổ sung mới 25% cứ 12 giờ một lần trong 10 ngày liên tục đã cho sản lượng sinh khối là 65,6 g/l và hiệu suất sản xuất astaxanthin đạt 4,38 mg/l/ngày, tăng gấp 2,3 lần so với sản lượng ở quy trình sản xuất mẻ thông thường (Liu và

Wu, 2007)

Sản xuất astaxanthin được nâng cao khi môi trường nuôi cấy ban đầu có tỷ lệ C/N cao, nhưng sự sinh trưởng của tế bào lại bị ức chế khi hàm lượng glucose trong môi trường cao Phân tích lượng thức hóa học cho thấy sản xuất astaxanthin được

thúc đẩy do sự giảm về NADP sử dụng cho đồng hóa bởi quá trình sinh tổng hợp protein bị ức chế khi tỷ lệ C/N cao Trên cơ sở này, một quy trình nuôi cấy mẻ bổ sung dinh dưỡng hai pha được thực nghiệm, trong đó sự sinh trưởng của tế bào tăng lên nhờ vào tỷ lệ C/N thấp ở pha đầu và sản xuất astaxanthin tăng nhờ vào tỷ lệ C/N cao ở pha tiếp theo, đạt 16 mg/l astaxanthin (Yamane và cộng sự., 1997)

X dendrorhous bị ảnh hưởng nồng độ glucose trong quá trình lên men: khi

nồng độ glucose cao làm sản sinh ra etanol nhiều hơn là sinh khối trong pha sinh trưởng động là kết quả của sự trao đổi quá dư thừa hay lên men glucose, dẫn đến sự giảm đi đáng kể hàm lượng astaxanthin và sinh khối Dựa trên đặc tính nuôi cấy này, mô hình động học được thiết lập dựa trên sự kết nối giữa cơ chất (glucose) và sản phẩm (etanol) ức chế Mô hình này thể hiện mối tương quan giữa tốc độ sinh trưởng của tế bào và nồng độ etanol Mô hình được áp dụng để nuôi cấy mẻ có bổ sung dưỡng chất đã đưa ra được quy trình bổ sung dưỡng chất tối ưu cho sản xuất astaxanthin cho sản lượng đạt 28,6 mg/l và hiệu suất đạt 5,36 mg/l/ngày (Liu và

Wu, 2008) Trên cơ sở mô hình ức chế cơ chất, một chiến lược sản xuất astaxanthin lên men mật độ tế bào lớn có bổ sung cơ chất hai pha được tối ưu hóa: nồng độ glucose ban đầu đưa vào được kiểm soát ở 25 g/l trong pha lag và bắt đầu pha sinh trưởng động để lượng sinh khối đạt giá trị cao nhất và tiếp đến hàm lượng glucose 5 g/l ở cuối pha động và pha tĩnh Chiến lược bổ sung này cho phép thu được sản lượng sinh khối cao (24 g/l) và astaxanthin (29 mg/l), tăng lên đáng kể so với quy trình lên men mẻ (Lu và cộng sự, 2008)

Cung cấp ô xy là một thông số quan trọng tác động đến sự sinh trưởng của X dendrorhous và sản sinh astaxanthin Bổ sung lượng ô xy cao làm tăng lượng

astaxanthin và tỷ lệ astaxanthin trong nhóm carotenoid Hàm lượng sinh khối tế bào đạt cao nhất (19 g/l), lượng carotenoid tối ưu (18 mg/l) và lượng astaxanthin cao (14 mg/l; 0,8 mg/g) khi hệ số chuyển đổi ô xy ban đầu (KLa) là 148,5/h Sự sinh trưởng của tế bào bị ức chế đáng kể khi ứng suất ô xy hòa tan (DOT) được duy trì ở 20% không khí bão hòa, do mức độ hạn chế ô xy trong môi trường Hàm lượng astaxanthin ở 50% DOT cao hơn là ở 20% DOT (Wang và Yu, 2009)

Cường độ chiếu sáng cũng ảnh hưởng đến sự tổng hợp carotenoid của các

chủng Xanthophyllomyces dendrorhous Khi được nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng, Xanthophyllomyces dendrorhous tổng hợp được lượng carotenoid cao hơn rõ

rệt so với điều kiện tối (Vázquez M., 2001) Sản lượng astaxanthin cao nhất khi

Xanthophyllomyces dendrorhous được nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng ở mức

600 lx Người ta đã tính toán rằng việc áp dụng các giá trị chiếu sáng đầy đủ, có thể cải thiện sản xuất astaxanthin khoảng 5% 15%, tùy thuộc vào chủng (Stachowiak B., 2013)

1.4.3 Các nghiên cứu về quá trình tách chiết, thu hồi astaxanthin

Đối với nấm men X dendrorhou, tế bào bắt đầu tích tụ astaxanthin vào cuối

pha sinh trưởng Astaxanthin là sản phẩm nội bào nên việc phá vỡ tế bào là một khâu quan trọng nhất trong quá trình thu hồi Nấm men có thành tế bào tương đối dày nên việc phá vỡ tế bào là vấn đề khó khăn chính liên quan tới hiệu quả thu hồi astaxanthin từ nấm men Hiện tại, dimethyl sulphoxit (DMSO) được sử dụng làm dung môi để phá vỡ tế bào nấm men nhưng việc tồn dư DMSO trong sản phẩm cuối cùng lại không được FDA (Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) chấp thuận cho phép sử dụng ở người Mặt khác, DMSO có giá thành rất cao nên rất khó được sử dụng trong thực tiễn quy mô thương mại Astaxanthin dễ bị oxi hóa nên việc áp dụng phương pháp phá vỡ tế cũng phải ít gây tổn thất nhất về hoạt tính của sản phẩm sau cùng Bởi vậy, việc tìm ra một phương pháp thu hồi hiệu quả astaxanthin để thu được sản phẩm sau cùng an toàn hơn cho người sử dụng là thực

sự cần thiết

Việc sử dụng những phương pháp phá vỡ tế bào an toàn hơn (greener) chẳng hạn như xử lý axit hữu cơ đã được công bố trong nhiều nghiên cứu nhưng tỷ lệ thu hồi lại tương đối thấp (Ducrey Sanpietro L.M., Kula, 1998) Năm 1997, Fontana và cộng sự đã sử dụng phương pháp thu hồi astaxanthin sử dụng thiết bị nghiền hạt để

phá vỡ tế bào nấm men P rhodozyma rồi tách chiết lỏng CO2 siêu tới hạn Phương

pháp nghiền này đi kèm với yêu cầu áp suất cao cho tách chiết siêu tới hạn làm tăng chi phí và không an toàn cho sử dụng ở quy mô lớn

Sóng siêu âm có thể được áp dụng làm tăng cường sự phá vỡ tế bào và cũng

có thể sử dụng kết hợp với xử lý hóa học như axit để đạt được mục tiêu là nâng cao hiệu quả xử lý Cơ chế của việc làm tăng khả năng phá vỡ tế bào khi sử dụng sóng siêu âm kết hợp với hiện tượng tạo bong bóng gây nhiễu loạn đáng kể và tạo ra ứng suất cắt từ những sóng va chạm nhau sản sinh ra do quá trình nổ của bong bóng Năm 2015, Gogate và cộng sự đã phát hiện ra rằng chiết xuất siêu âm kết hợp với axit

lactic làm tăng sự phá vỡ tế bào và làm cho việc chiết xuất astaxanthin từ P rhodozyma

có hiệu quả cao và thân thiện với môi trường Họ đã sử dụng axit lactic làm môi trường

để phá vỡ và ethanol làm dung môi để chiết xuất Hiệu suất tối đa của astaxanthin (90%) thu được cho phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm dựa trên việc sử dụng axit lactic 3M, công suất siêu âm 80W trong thời gian 15 phút

1.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng astaxanthin tại Việt Nam

Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu, tìm kiếm astaxanthin từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên còn rất ít Một vài nghiên cứu của các nhà khoa học chỉ dừng ở việc trích ly astaxanthin từ phế liệu loài giáp xác quy mô nhỏ KS Nguyễn Văn Ngoan đã xây dựng quy trình công nghệ sử dụng tổng hợp astaxanthin, chitin và protein từ phế liệu trong sản xuất tôm đông lạnh ThS Hoàng Thị Huệ Anh (2003)

đã nghiên cứu và xây dựng được quy trình chiết suất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm bằng dung môi ethanol 96° với hiệu suất cao nhất đạt 34,5% Công trình nghiên cứu

đầu tiên ở Việt Nam về nấm men đỏ Phaffia đến từ nhóm tác nghiên cứu của

PGS.TS Tống Kim Thuần (Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Kết quả là đã phân loại đến loài được 02 chủng nấm men NT5 và NT8 có khả năng sinh tổng hợp astaxanthin Nghiên cứu đã đưa ra được quy trình trích ly astaxanthin ổn định với các thông số kỹ thuật gồm: sử dụng dung môi axeton và este dầu mỏ (tỷ lệ 1:1), phá vỡ tế bào nấm men bằng bi thủy tinh trong 30 phút Nghiên cứu cũng đã xây dựng được hai quy trình sản xuất sinh khối nấm men giàu astaxanthin trên nồi lên men 5 lít và thùng nhựa 20 lít với các thông

số ổn định gồm: nhiệt độ nuôi cấy 22°C, pH ban đầu 5,0, tỷ lệ giống ban đầu 8 và 15%, tốc độ khuấy 200 v/ph, lên men trong 120 giờ, ly tâm thu sinh khối, giết chết

tế bào bằng nhiệt (80-85°C) trong 5 phút, bổ sung chất chống oxy hóa (vitamin E, C

100 mg/kg, butyl hydroxytoluen 200 mg/kg) và đông khô Chế phẩm nấm men sản xuất ra có hàm lượng astaxanthin khoảng 246-330 µg/g, được thử nghiệm bổ sung vào thức ăn cho cá kiếm cảnh với liều lượng 200 g/kg Kết quả thử nghiệm cho thấy

cá kiếm cảnh được ăn thức ăn bổ sung 3 lần/ngày liên tục trong 10 ngày thì hàm lượng astaxanthin trong da, vảy và vây của cá đã tăng gấp 2,8 lần và màu sắc rực rỡ của cá tăng lên rõ rệt

Sản phẩm thực phẩm chức năng chứa astaxanthin duy nhất sản xuất trong nước của công ty Hoa Thiên Phú hiện đang lưu hành trên thị trường là sản phẩm Sắc Ngọc Khang chứa 6 mg astaxanthin trong một viên nang có giá 240.000 đồng/lọ (60 viên) Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu astaxanthin hiện không có trong nước nên công ty phải nhập nguyên liệu từ Nhật Bản

1.6 Kết luận tổng quan

Từ các kết quả nghiên cứu tài liệu tổng quan về nấm men X dendrorhous và

astaxanthin, chúng tôi rút ra một số kết luận để làm định hướng nghiên cứu cho đề tài như sau:

- Astaxanthin là chất chống ô xy hóa mạnh đang được ứng dụng ngày càng nhiều trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm và có giá trị kinh tế cao

- Nấm men X dendrorhous là nguồn sinh tổng hợp astaxanthin tự nhiên lớn do

chúng có khả năng lên men tăng sinh khối nhanh

- Đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về môi trường và chế độ nuôi cấy

và lên men thích hợp cho nấm men X dendrorhous sinh trưởng và sản sinh

astaxanthin, một số thành phần chính của môi trường như glucose, cao nấm men, pepton, cao malt, nước nho ép, nước cốt dừa, nước dứa ép, dịch chiết lá tía tô,…

Chế độ nuôi cấy cho nấm men X dendrorhous là: nhiệt độ 20-250C, pH4 - pH6, tốc

độ khuấy 200-250 vòng/phút, có chiếu sáng, có bổ sung cơ chất và cấp khí,…

- Một số phương pháp phá vỡ tế bào nấm men X dendrorhous hiệu quả như sử

dụng axit hữu cơ kết hợp với sóng siêu âm, sử dụng lò vi sóng, CO2 siêu tới hạn

- Dung môi có khả năng tách chiết astaxanthin từ nấm men X dendrorhous như

ethanol, methanol, aceton, petroleum ether

PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng nấm men đột biến Xanthophyllomyces dendrorhous DT1 được mua

của Biological Resource Center (NBRC), National Institute of Technology and

Evaluation, Nhật Bản

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

❖ Thiết bị, dụng cụ

- Cân phân tích

- Máy đo quang phổ

- Máy khuấy từ có gia nhiệt

- Máy đo PH, nhiệt độ

- Tủ lạnh, tủ sấy

- Nồi hấp áp suất autoclave

- Máy nghiền

- Hệ thống lên men 50 lit/mẻ

- Hệ thống tách chiết bằng sóng siêu âm

- Tủ ấm nuôi cấy vi sinh

- Máy ly tâm, máy lắc

- Máy sấy phun (năng suất 6-8 kg/h, Công suất điện: 30 kW; Tốc độ quay 15.000-30.000 rpm)

- Và một số thiết bị phân tích,…

❖ Hóa chất: Pepton; cao nấm men; cao malt; thạch; bột hạt bông; glucose;

glycerol; Na2HPO4.3H2O;H2PO4; MgSO4; Na2HPO4;(NH4)2SO4; KH2PO4; MgSO4.7H2O; NaCl; FeSO4.7H20; H2SO4; axít xitric; axit lactic; axit acetic; ZnSO4; CuSO4; MnSO4; H3BO3; Na2MoO4; KI; Vitamin B3; Vitamin B5; Vitamin B1; B6, β-cyclodextrin, Astaxanthin chuẩn (Sigma), ethanol, aceton, methanol, petrolium

ether,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.2.1.1 Bố trí thí nghiệm Nội dung 1

Nghiên cứu xác định môi trường nhân giống và môi trường lên men thích hợp cho

nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous sinh trưởng, phát triển

a) Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định môi trường nhân giống

Chủng nấm men được nuôi cấy trên 03 loại môi trường khác nhau M1, M2, M3 có thành phần như sau:

Công thức Thành phần môi

trường

Hàm lượng (g/l) Nguồn tham khảo

Môi trường M1 Glucose 10 Kim và cộng sự, 2005

Tiếp tục bổ sung 3 loại dịch chiết thực vật khác nhau (10% nước dứa ép, 10% nước cốt dừa và 5% dịch chiết lá tía tô) vào môi trường nhân giống tốt nhất được lựa chọn ở trên Các điều kiện nuôi cấy được thực hiện như trên

b) Thí nghiệm 2: Xác định môi trường lên men

- Có 4 loại môi trường lên men khác nhau với các thành phần như sau:

Công thức thí

nghiệm

Thành phần môi trường Nguồn tham

khảo Môi trường LM1: Nước dứa 10%; Glucose 38,9 g/l; Cao

nấm men 2,9 g/l, KH2PO4 2,5 g/l, MgSO4 0,5g/l, MnSO4 0,2 g/l và CaCl2 0,1g/l

Kim J.H và CS,

2005

Môi trường LM2: Nước dứa 10%; Glucose 30 g/l; KH2PO4

3g/l; MgSO4 3 g/l; Na2HPO4 1 g/l; Cao nấm men 5 g/l

Ramirez và cộng

sự, 2006

Môi trường LM3 Nước dứa 10%; Glucose 40 g/l; Cao nấm

men 8 g/l; (NH4)2SO4 8 g/l; MgSO4.7H2O 0,1 g/l; KNO3 0,3 g/l; K2HPO4 0,5 g/l

(100 ml dung dịch vi lượng gồm: 1ml

H 2 SO 4 2M; 0,5g axít xitric; 0,167g ZnSO 4 ; 0,025g CuSO 4 ; 0,02g MnSO 4 ; 0,02g H 3 BO 3 ; 0,02g Na 2 MoO 4 ; 0,05g KI

và dung dịch vitamin = 0,325ml H 2 SO 4

4N; 0,02g Vitamin B 3 , 0,03g Vitamin B 5 , 0,02g Vitamin B 1 , 0,002g vitamin B 6)

Schewe và cộng

sự, 2017