nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm multienzymes từ nấm mốc và đánh giá độ an toàn của chúng dùng cho chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian làm việc và học tập tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh tôi đã hoàn thành công trình: “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-    -

TỐNG THỊ MƠ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ

AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, Năm 2010

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-    -

TỐNG THỊ MƠ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ

AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.MAI THỊ HẰNG

Thái Nguyên, Năm 2010

LỜI CẢM ƠN

Qua một thời gian làm việc và học tập tại Phòng thí nghiệm Bộ

môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh tôi đã hoàn thành công trình: “Nghiên

cứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc và đánh giá độ an toàn của chúng dùng cho chăn nuôi”

Để hoàn thành được công trình này, tôi đã nhận được nhiều sự giúp

đỡ, chỉ bảo và đóng góp ý kiến quý báu từ các thầy cô, gia đình và các bạn đồng nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Tiến sĩ Mai Thị Hằng, người đã dạy dỗ tôi trong quá trình học tập, người đã dìu dắt những bước đi đầu tiên trong con đường khoa học và luôn sát cánh cùng tôi trong quá trình nghiên cứu!

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi em bộ môn Vệ sinh Thú y, Viện Thú y trung ương đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thí nghiệm tại Viện!

Tôi chân thành cảm ơn tất cả anh, chị em phòng Công nghệ Sinh học – Vi sinh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua!

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 09 năm 2010

Tống Thị Mơ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU i

1 Lý do chọn đề tài 1

2.Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Nội dung của đề tài: 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 Vai trò của enzyme trong chăn nuôi 4

1.1 Các enzyme tiêu hóa chủ yếu sử dụng trong chăn nuôi 4

1.1.1 a-Amylase 5

1.1.1.1 Đặc tính của enzym α-amylase 5

1.1.1.2 Cơ chế tác dộng của enzym α-amylase 7

1.1.2 Cellulase 9

1.1.2.1 Hệ enzyme phân giải cellulose 10

1.1.2.2 Endoglucanase (EC.3.2.1.4, b-Dglucan-glucanolhydrolase hay carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase) 10

1.1.2.3 Exoglucanase (EC.3.2.1.91 1,4 b - glucan – celobiohydrolase 11

1.1.2.4 b-1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 b-1,4 glucosidase hay cellobiase): 11

1.1.2.5 Exoglucohydrolase (EC.3.2.1.74): 1,4 b -D glucan – glucohydrolase) 12

1.1.3 Xylanase 12

1.1.3.1 Cấu trúc hoá học của xylan 12

1.1.3.2 Hệ thống enzyme phân giải xylan và sự hình thành tổ hợp xylanase ở vi sinh vật 14

1.1.4 Phytase 16

1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng enzyme trong chăn nuôi 17

2 Các phương pháp lên men enzyme vi sinh vật 21

2.1 phương pháp lên men chìm 21

2.2 Phương pháp lên men rắn 22

3 Ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp enzyme 23

3.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng 23

3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy 25

4 Tính an toàn của các chế phẩm enzyme từ Aspegillus 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1.Vật liệu 29

2.1.1.Chủng vi sinh vật 29

2.1.2 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 29

2.1.3 Hoá chất 29

2.1.4 Thiết bị 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp vi sinh 30

2.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase trên cơ chất bã sắn của chủng A oryzae NM1 31

2.2.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 31

2.2.1.3 Ảnh hưởng của nồng độ KNO 3 và KH 2 PO 4 lên khả năng sinh amylase 32

2.2.1.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 32

2.2.1.5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của amylase 32

2.2.1.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của amylase 33

2.2.1.7 Ảnh hưởng của lượng giống (bào tử/g) ban đầu đến khả năng sinh amylase 33

2.3 Xác định ảnh hưởng của H 2 O 2 đến hoạt động của amylase 33

2.4 Phương pháp nghiên cứu enzyme 34

2.4.1 Xác định hoạt tinh một số loại enzyme thuỷ phân ngoại bào 34

3 Đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme trên động vật 40

3.1 Đánh giá độ độc cấp tính 40

3.2 Đánh giá độc tính cấp khi sử dụng enzyme liều cao trong 7-14 ngày 43

3.3 Đánh giá độc tính chậm khi sử dụng enzyme liều cao trong 90 ngày 44

3.4 Tính toán và xử lý số liệu 44

3.5 Các phương pháp khác 45

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Ảnh hưởng các yếu tố dinh dưỡng đến sinh tổng hợp amylase 46

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase trên cơ chất bã sắn của chủng A oryzae NM1 46

3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 48

3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 49

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh amylase 51

3.1.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh amylase 52

3.1.6 Ảnh hưởng của nồng độ KNO 3 và KH 2 PO 4 đến khả năng sinh amylase 53

3.1.7 Ảnh hưởng của số lượng bào tử ban đầu đến khả năng sinh amylase 54

3.2 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô 56

3.3 Phối trộn enzyme thô từ chủng A niger ĐB106 và enzyme thô từ chủng A oryzae NM1 60

3.4 Đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme multienzyme trên động vật 62

3.4.1.Đánh giá cấp độ độc cấp tính 62

a Dị ứng da 62

b Dị ứng mắt 63

c Dị ứng đường thở 63

3.4.2 Đánh giá độc tính cấp chậm 14 ngày 64

3.4.3 Đánh giá độc tính 90 ngày 64

3.4.4 Kết quả kiểm tra mẫu máu: Kiểm tra tại Khoa huyết học của Bệnh

viện Bạch Mai Hà Nội (Bảng 3.4.4) 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

I KẾT LUẬN 68

II KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Hình 1 Cấu trúc hoá học của cellulose 9

Hình 3 Sơ đồ tác động của các loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt 15 Hình 4 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein 16 Hình 2.4

Hình 2.5 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS 37 Hình 2.6 Đồ thị chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS) 39 Hình 3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 49

Hình 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 50

Hình 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh amylase 52 Hình 3.1.5 Ảnh hưởng của pH dịch khoáng ban đầu đến khả năng sinh amylase 53 Hình 3.2 Quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô từ A oryzae NM1 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.4

Bảng 3.1.1 Ảnh hưởng của nguồn tinh bột đến khả năng sinh amylase 47 Bảng 3.1.2 Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh amylase 48 Bảng 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh amylase 50 Bảng 3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh amylase 51 Bảng 3.1.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh amylase 52 Bảng 3.1.6 Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 và KH2PO4 đến khả năng sinh amylase 54 Bảng 3.1.7 Ảnh hưởng của số lượng bào tử ban đầu đến khả năng sinh amylase 55 Bảng 3.2 Các loại enzyme thô từ chủng A oryzae NM1 sau khi đông khô -200C 60

Bảng 3.3.1 Thành phần các enzyme có mặt trong sinh khối lên men (10kg/mẻ) của

các chủng Aspergillus

61

Bảng 3.3.2 Thành phần chế phẩm mulltienzyme sử dụng trên động vật thí nghiệm 62

Bảng a Theo dõi trọng lượng trước và sau thí nghiệm (dị ứng trên da) 63 Bảng c Trọng lượng của các lô trước và sau thí nghiệm (dị ứng đường thở) 63

Bảng 3.4.2 Trọng lượng của các lô trước và sau thí nghiệm (14 ngày) 64 Bảng 3.4.3 Trọng lượng của các lô trước và sau thí nghiệm (90 ngày) 65 Bảng 3.4.4 Sự thay đổi của hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu dưới tác động E sau 90 ngày 66

loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca2+

trong phân tử và nồng độ Mg2+ Tất cả các amylase đều

bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+ Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase

Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspegillus như sau

(g/100 g protein): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6; valine = 6,9, leucine = 8,3; Isoleucine = 5,2; prolin = 4,2, phenylalanine = 4,2; tyrosine = 9,5; trytophan = 4,0; xetin = 6,5; trionin = 10,7, cystein + cystine = 1,6; glutamic acid = 6,9;

amide = 1,5 (Akabori et amiloza, 1954) Không giống các α-amylase khác, amylase của A oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide Polyose

này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme (Akabori et amiloza, 1965) Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ) Theo số liệu của Liphis,1989 pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế

phẩm amylase từ A oryzae trong vùng 5,6 -6,2 Còn theo số liệu của Fenixova

1991 thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0 Độ bền đối

với tác dụng của acid cũng khác khác nhau α-amylase của A oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis

Ở pH= 3,6 và 0o

C, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ) Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose maltotriose

và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%[28]

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

Việc phát hiện ra Amylase và sản xuất ở quy mô công nghiệp đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm Amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như từ thực vật, động vật và VSV Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường

Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch (malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất amylase là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ

sở cho nhiều ngành khác phát triển[14]

xylan trong các loại cỏ và các thực vật một năm chủ yếu là arabinoxylan Xylan dạng chuỗi không phân nhánh cũng đã được tìm thấy trong cỏ giấy (espato grass), cây thuốc lá và trong một số tảo nước mặn Những loại xylan này có chứa đuôi xylopyranosyl bao gồm cả liên kết 1,3-β và 1,4-β-glucoside Mức độ polyme hoá của xylan cũng thay đổi, chẳng hạn như xylan của gỗ cứng có chứa 150-200 gốc β-xylopyranosyl trong khi đó ở gỗ mềm là khoảng70-130 [37]

Dựa trên thành phần các nhóm thế phổ biến mà xylan được phân thành các loại sau: xylan đơn thuần mạch thẳng, arabinoxylan, glucuronoxylan, và glucuronoarabinoxylan Ngay trong mỗi loại xylan này cũng có một số sai khác nhỏ về mức độ và bản chất của nhánh bên Bộ khung chính và nhánh bên của xylan nói chung được thể hiện ở hình 2.Ở nhiều thực vật một phần nhỏ xylan là

ở dạng axetyl hóa (acetylate) Các nhóm O-acetyl có mặt ở các điểm C2 và C3 của vòng xylosyl Sự phân cắt hoàn toàn các acetylxylan bởi các xylanase là khó khăn, có lẽ là do sự cản trở bởi phân bố không gian của các phân từ này Để

có thể thuỷ phân hoàn toàn các acetylxylan cần sự phối hợp tác động của cả acetylxylanesterase và các endo-xylanase Sự có mặt của một lượng nhỏ các axit feruloyl và pcoumaroyl liên kết với các vòng α-L- arabinose trong cấu trúc của xylan cũng đã được thông báo trong một vài nghiên cứu Các axit hydrocinnamic này liên kết với C5 của vòng arabinose

Sự có mặt của các liên kết đồng hoá trị giữa lignin và cellulose thông qua mối liên kết với các nhóm thế của xylan trong nhiều trường hợp đã được chứng minh Những bằng chứng về liên kết ete giữa arabinose và lignin hay giữa axit glucuronic với lignin cũng đã được công bố Các nhóm feruloyl cũng có thể hình thành liên kết ngang giữa xylan và lignin Các chuỗi bề mặt (nhóm thế) quyết định khả năng hoà tan, cấu trúc vật lý và khả năng phản ứng

- α- Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) thuỷ phân các đầu chứa nhóm không khử α – L - arabinofuranosyl của arabinan, arabinoxylan

và arabinogalactan của các nhóm bên

- a-D-glucuronidase (EC 3.2.1.1) thuỷ phân các liên kết glycosidic giữa xylose và axit D- glucuronic, kể cả các liên kết với 4-O-methyl của các nhóm bên

α-1,2 Các acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6) bẻ gãy liên kết giữa xylose và axit axetic của các nhóm bên

Sơ đồ tác động của các loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt ở hình3

Hình.3

a/ Các vùng tác động của các enzyme thuỷ phân xylan (Ac - Nhóm acetyl; α-araf - alpha- arafinose; alpha- arabinofuranose; alpha-4-O-Me-GlcUA

- alpha-4-O-methylglucuronic; pcou- p-coumaric axit; fer - ferulic axit)

b/ Quá trình phân cắt xylo-oligosaccharide thành xylose bởi xylosidase

β-giảm khả năng hấp thu dinh dưỡng và gây tiêu chảy Nếu thêm một lượng enzyme phù hợp vào thức ăn có thành phần tối ưu có thể giải quyết được các vấn đề này Vì vậy người ta bổ sung chế phẩm enzyme chứa a-amylase, lipase và protease vào thức ăn để giúp lợn con tiêu hoá được tốt hơn

Thức ăn vật nuôi thường chứa nhiều hợp chất polysaccharide không phải tinh bột (Non-starch polysaccharides, NSP) Chúng là chất kháng dinh dưỡng (ANF-anti nutrient factor) do tạo độ nhớt trong ruột, ngăn cản sự hấp thu các chất, tạo điều kiện cho VSV có hại phát triển Xylanase, phytase, a-galactosidae là những enzyme chính khắc phục được nhược điểm này Bổ sung xylanase vào thức ăn vật nuôi có tác dụng nhiều mặt Như các enzyme tiêu hoá, xylanase cắt cơ chất phức tạp thành các phân tử nhỏ dễ tiêu nên tăng giá trị hữu dụng của thức ăn Đặc biệt xylanase làm giảm độ nhớt của ruột do đó kéo theo những tác dụng tích cực khác Sự hấp thụ các chất dinh dưỡng bị ngăn cản bởi hợp chất NSP được tăng cường khi có xylanase, ví dụ tiêu hoá của a m i n o acid tăng 1,7-7,9% Nó giúp cải

thiện hệ VSV đường ruột theo hướng có lợi như giảm Salmonella do vậy

giảm rối loạn tiêu hoá Đối với môi trường, xylanase làm giảm lượng phân thải ra, chất lượng phân khô hơn, góp phần giảm ô nhiễm môi trường [8]

Bổ sung xylanase làm tăng khả năng tiêu hoá NSP tổng số ở lợn có chế độ ăn chính là ngũ cốc bổ sung đậu tương Bổ sung chỉ xylanase hoặc hỗn hợp xylanase, α-galactosidase, protease làm tăng sự tiêu hoá carbohydrate, protein và chất béo Khi nghiên cứu ở lợn cai sữa giai đoạn sớm cũng thấy bổ sung xylanase cùng với β-glucanase và amylase làm tăng khả năng tiêu hoá tinh bột, protein và phân giải chất khô[7]

Phytase phân giải phytate có trong thức ăn, giải phóng Pvc, inulin, các muối khoáng (Mg, Ca, Fe, Cu…) Việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi động vật không những mang lại hiệu quả to lớn về mặt dinh dưỡng và

kinh tế mà còn góp phần bảo vệ môi trường Đó chính là nhờ hoạt động của phytase làm giảm mức độ kháng dinh dưỡng của axit phytic, tăng hiệu quả hấp thu chất dinh dưỡng của vật nuôi, giảm chi phí khẩu phần ăn vì không cần thiết bổ sung phốt pho vô cơ vào trong thức ăn, đồng thời làm giảm ô nhiễm môi trường do giảm lượng phytate dư thừa thải qua phân mà sau đó bị VSV phân giải thành Pvc gây ô nhiễm môi trường [Simell và CS, 1989]

Các alpha- a-glactosidase phân giải các mối liên kết a-galactosil trong galactan, galactomannans, galactolipid và galactoprotein có trong thức ăn của vật nuôi (đặc biệt là trong đậu tương), để giải phóng galactose, manose, protein

và lipit

Protease kết hợp với amylase và cellulase được bổ sung vào thức ăn làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn lên tới 10%, tăng trọng đàn gia súc trung bình 10-15% [9] Đối với lợn nái, muốn nâng cao khả năng sinh sữa và chất lượng sữa người ta cũng bổ sung amylase và protease vào khẩu phần thức ăn [60]

Enzyme cũng được bổ sung vào thức ăn của trâu, bò Quá trình tiêu hoá thức ăn trong dạ cỏ trâu bò được gắn liền với hoạt động enzyme của các vi sinh vật sống ở đó Dùng chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase, pectinase, .đều thu được kết qủa tăng trọng của trâu bò có thể đạt đến 12-17% Ở Mỹ có nhiều thí nghiệm dùng chế phẩm amylase và protease từ nấm

mốc Aspergillus bổ sung vào thức ăn vỗ béo trâu bò tơ từ năm 1961, với liều

dùng 2-9g chế phẩm cho 1 đầu vật nuôi / 1 ngày thì tăng trọng so với đối chứng là 110g/ 1 ngày Trong trường hợp vỗ béo bò bằng chế phẩm trên với liều 3.5g/ 1 đầu vật nuôi/ 1 ngày cho tăng trọng sau 49 ngày nuôi là 12.8-14%

và sau 56 ngày nuôi có khi tới 20-23% so với đối chứng [30]

Nghiên cứu bổ sung xylanase vào khẩu phần ăn của gà cho kết quả tốt hơn lợn Nó có khả năng làm tăng tiêu hoá nitơ, axít amin, chuyển hóa chất

béo, tăng năng lượng chuyển hoá, tăng trọng lượng vật nuôi và phân thải ra khô hơn [Bedford, 1995; Hew, 1998; Hew, 1999; Danicke, 1999; Wu, 2004]

Như vậy, rõ ràng hiệu quả của các chế phẩm enzyme với chăn nuôi ở các nước phát triển là không thể nghi ngờ Với mọi đối tượng của ngành chăn nuôi, enzyme làm tăng tỉ lệ tiêu hoá, làm giảm chi phí thức ăn Tuy nhiên, tất

cả các chế phẩm enzyme được dùng ở nước ta hiện nay đều là enzyme nhập ngoại do đó giá thành còn cao, vì vậy việc nghiên cứu sản xuất các enzyme cho chăn nuôi trong nước là vấn đề cấp bách

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease, xylanase, cellulase ) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa [1] Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase và tổ hợp enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng tương ứng là 13.3% và 32% Nếu sử dụng phối hợp cả 2 chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50% [Trần Quốc Việt và Cs, 2005]

M.T.Hằng và CS, 2008 đã thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm Enzyme từ

các chủng Aspergillus phân lập từ Việt nam trên gà giò cho kết quả tăng trong từ

15-27% lượng thức ăn tiêu thụ/ kg tăng khối lượng cơ thể gà giảm tương ứng 11,2-112,7% Chế phẩm trên cũng đã được thử nghiệm trên lợn từ 8-72kg với hiệu quả tăng trọng cao (12%) và giảm lượng thức ăn /kg tăng trọng cơ thể 9-

16% (đặc biệt là đối với lợn 8-20 kg) tăng gần tương đương với chế phẩm SSF của Mỹ, đồng thời làm giảm đáng kể chi phí thức ăn cho vật nuôi [2]

Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm phytase thương mại (Natuphos, BASF) đến năng suất và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt Theo các tác giả, sử dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16,4% và giúp giảm chi phí thức ăn được 8% so với lô đối chứng Tương tự như vậy, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS

Đối với α- amylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > lactozơ > sacaroszơ

> galactozơ > manozơ > arabinozơ

Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > sacaroszơ > gluctozơ > lactozơ > arabinozơ > galactozơ > manozơ

Nộng độ nguồn cacbon trong môi trường cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzyme Mỗi loài VSV chỉ có thể tạo lượng amylase cao nhất ở một nồng độ hydratcacbon nhất định Ví dụ trên môi trường Czapek nồng độ tinh bột có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp amylase, nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α- amylase là 6%, còn đối với glucoamylase là 3%

* Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu trúc cũng như các enzyme Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ thường dùng là nitrat amôn, sunfat amôn, hay urê Các hợp chất hữu cơ có thể là nguyên liệu giàu đạm như cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đậu Ngoài ra một số axit amin, bazơ purin (adenin, guanin), pyrimidin cũng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy VSV[2] Các axit amin có tác dụng khác nhau đối với VSV cũng như đối với sinh tổng hợp enzyme, nhiều axit amin có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme, một số khác lại kìm hãm hoặc không có ảnh hưởng gì rõ rệt Nguyên nhân tăng cường là do hàm lượng của một số axit amin trong tế bào thấp hơn các axit amin khác, nếu thêm chúng vào môi trường dinh dưỡng chúng sẽ làm tăng hàm lượng axit amin cần thiết để sinh tổng hợp enzyme do vậy đã kích thích được sinh tổng hợp enzyme [3]

Ngoài hai nhân tố cơ bản cacbon và nitơ trong môi trường dinh dưỡng của VSV sinh enzyme nói chung cần phải có mặt nhiều nguyên tố khoáng ở dạng muối magiê, photpho, kali, cũng như cần các vết mang iôn mangan, kẽm

sắc Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rõi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới

Enzyme từ Aspegillus niger đã được sử dụng trong sản xuất thực phẩm

từ nhiều thập kỷ trước (AMFEP, 1997) Protease enzyme có nguồn gốc từ A

niger thường chứa một loạt các peptidases để cho phép các sinh vật phân hủy

protein trong thực vật Thí nghiệm đã cho thấy một trong những peptidases này thuộc nhóm amin peptidases và đóng vai trò quan trọng trong làm bánh mì và

pho mát Vì vậy, chủng A niger có khả năng sản xuất enzym đặc biệt này đã

được tuyển chọn

Các sản phẩm từ A niger đã được sử dụng từ nhiều thập kỷ trước,

nhưng không có bằng chứng rằng chủng công nghiệp được sử dụng có thể gây

độc Các tiền enzyme không độc của A niger đã được kiểm tra trong rất nhiều

thử nghiệm độc tính, tương tự các thử nghiệm độc tính với các sản phẩm cuối khác Những nghiên cứu độc tính xác định trên nhiều tiền enzyme khác nhau

từ A niger cung cấp cơ sở cho sự đánh giá an toàn của các chuyên gia Uỷ ban

hỗn hợp trên Phụ gia thực phẩm (JECFA) của FAO / WHO (FAO / WHO,

1975, 1987 và 1990) Mặc dù các kết quả của nghiên cứu gây độc không chính thức, JECFA lần đầu tiên phân bổ 1 số ADI tới tiền enzyme của

A.niger, dựa trên những lo sợ rằng một số chủng có thể sản xuất các độc tính

chưa rõ (FAO / WHO, 1987) Tuy nhiên, 1 thời gian dài sử dụng A niger như

1 nguồn enzyme thực phẩm, đã có số lượng đáng kể các nghiên cứu về an toàn, giống như các báo cáo khoa học tại JECFA cho thấy, sản phẩm có độc rất hiếm gặp Vì vậy, JECFA đã xem xét lại quyết định của mình vào năm

1990 và thay đổi ADI cho tách tiền enzym từ A niger thành `` không

độc''(FAO /WHO, 1990) Ngoài một đánh giá tích cực của JECFA, hầu hết các nước quy định việc sử dụng enzym, như Mỹ, Pháp, Đan Mạch, Úc và

Canada, đã chấp nhận việc sử dụng enzym từ A niger trong một số thực

phẩm

Để đánh giá được độ an toàn của chế phẩm Multienzyme trước hết chúng ta phải biết được các thành phần có trong enzyme Sau đó chúng ta mới thử các độc tính của enzyme với đối tượng là chuột và thỏ Trên thế giới người ta cũng dựa vào các tiêu chuẩn để đánh giá độ an toàn của chế phẩm enzyme như tiêu chuẩn của FAO [45]

*Lập đồ thị chuẩn: Pha loãng dung dịch 1% tinh bột đã chuẩn bị ở trên

sao cho đạt nồng độ 2, 4 , 6, 8 và 10mg trong 1ml Lấy 0.1ml dung dịch tinh bột đã chuẩn bị như trên, thêm 0,1ml dung dịch 1% NaCl ; 0,2ml dung dịch đệm Na-acetat 0.01 M; 0,4ml nước cất; 0,2ml dung dịch 15% axit trichloroacetic lắc đều, thêm 9ml dung dịch I2 đã pha loãng 150 lần, so màu ở bước sóng 560nm, sau đó dựng đồ thị chuẩn giống như dựng đồ thị đường chuẩn Kết quả được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.4

Bảng 2.4 Kết quả thực nghiệm khi đo OD ở bước sóng 560nm

2 4 6 8 10

OD(560nm)

Hình 2.4 Đồ thị tinh bột chuẩn

Phương trình hồi quy tuyến tính giữa tinh bột và độ hấp thụ ở 560nm là: y=16.94x-0.2655, trong đó x là độ hấp phụ của dung dịch tinh bột ở bước sóng (560nm), y là hà m lượng tinh bột (mg/ml)

*Cách tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng tinh bột bị phân giải

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch 1% NaCl, 1ml dung dịch 1% tinh bột, 2ml dung dịch đệm phù hợp 0.05M Na-acetate, pH 5,5 ,3ml nước cất Lắc đều và giữ ở nhiệt độ 300C trong 10 phút, sau đó cho vào hỗn hợp này 1ml enzyme ở độ pha loãng thích hợp đã giữ ở 30oC Lắc đều, tiếp tục giữ ở

30oC trong 30 phút Thêm ngay 2ml dung dịch 15% axit trichloroacetic để làm ngừng phản ứng, giữ vài phút sau đó li tâm 4000v/phút loại bỏ cặn

Song song với mẫu thí nghiệm ta làm mẫu đối chứng cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch axit trichloacetic vào trước rồi mới cho dung dịch enzyme

Lấy 1ml dịch lọc ở mẫu thí nghiệm cũng như ở mẫu đối chứng cho vào ống nghiệm, thêm 9ml dung dịch iôt đã chuẩn bị ở trên So màu ở bước sóng 560nm

Tính số mg tinh bột bị phân hủy dựa vào đồ thị chuẩn đã thu được ở trên

Quy ước: Đơn vị hoạt độ của enzim (1 IU) là lượng enzim cần thiết để phân giải hết 1mg tinh bột trong một phút ở điều kiện thí nghiệm

b Xác đinh hoạt tính Cacboxymethylcellulase (CMC-ase)[41]

- Nguyên lý: CMC-ase phân cắt cacboxymethylcellulose (CMC) thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng

+ Pha dung dịch cơ chất: dung dịch 0.5% CMC trong đệm 50mM axetat

Na-+ Thuốc thử DNS: Hoà tan 2g phenol và 10g NaOH trong 300ml nước cất, sau đó thêm tiếp 0,5g Na2SO3, 200g KNaC4H4O6.4H2O, 10g DNS, khuấy đều cho các hoá chất tan hoàn toàn Bổ sung thêm nước cất để đạt 1000ml

+ Dựng đường chuẩn glucose: Pha dung dịch mẹ 10µmol/ml glucose trong đệm 50 mM Na-axetat Từ đó pha loãng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (µmol/ml) Lấy 50 µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450µl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750µl dịch thuốc thử DNS Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (Hình 2.5)

D-Hình 2.5 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm thu được là là y = 15,759x+0,5181

Trong đó: y là hàm lượng D- glucose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng Hệ số tương quan R2

= 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ

♦ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tính của CMC-ase và amylase

- Thí nghiệm: 450 µl dung dịch 1% tinh bột ngô (hoặc 0,5% CMC ) +

50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp Ủ ở điều kiện 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750 µl dung dịch DNS để dừng phản ứng

- 450 µl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750 µl dung dịch DNS

+ 50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp Ủ ở điều kiện 50oC trong 30 phút

Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm Từ giá trị OD ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn đã xác định ở trên

Quy ước: Một đơn vị hoạt tính của CMC-ase (IU) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1µmol đường khử trong một phút ở điều kiện thí nghiệm, với glucose là dường chuẩn

c/Xác định hoạt tính Xylanase (Bailey và Cs, 1992) [19]

• Nguyên lý: Xylanase (endo-xylanase 1,4-β xylanase) phân cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và xylose có tính khử, có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng