Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho cây chè shan (camellia sinensis var shan) ở yên bái

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN THỊ HUẾ NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN BỘ CHỦNG VI SINH VẬT HỮU HIỆU SỬ DỤNG CHO CÂY CHÈ SHAN (Camellia sinensis Var Shan) Ở YÊN BÁI Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 62.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2016 Công trình đƣợc công bố VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Nhƣ Kiểu PGS TS Tống Kim Thuần Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp Vào hồi ngày tháng .năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư Viện Quốc gia Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Cây chè Shan (Camellia sinensis var Shan) coi nguồn gen địa quý với nét đặc trưng hương thơm, vị đượm, giàu dinh dưỡng Nhiều công trình nghiên cứu giới cho rằng, chè Shan tỉnh Yên Bái nơi thủy tổ tiến hoá loài chè Shan Số liệu điều tra TUEBA (Dự án CPWF, 2006) cho thấy, vùng trồng chè Shan tỉnh Yên Bái vùng đất dốc, phân bố độ cao 600 m, đất đai vùng dễ bị xói mòn, thoái hóa, dẫn đến khả cung cấp chất dinh dưỡng đất cho chè Shan bị hạn chế, ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng chè Shan Phục hồi hệ sinh thái đất vùng đất dốc, đất đồi núi nhằm hạn chế xói mòn, rửa trôi thoái hóa đất việc làm quan trọng Đã có nhiều giải pháp đưa ra, giải pháp sử dụng sản phẩm vi sinh canh tác coi yếu tố quan trọng mang lại hiệu cao việc cải thiện độ phì đất, đồng thời có tác động tốt đến môi trường hệ sinh thái Theo nghiên cứu Nepolean et al (2012), sử dụng hỗn hợp chủng VSV đất trồng chè nâng cao suất chè, giảm lượng phân hóa học, giảm sâu bệnh hại cải thiện đáng kể độ phì đất Tuy nhiên, chè Shan Yên Bái, chưa có sản phẩm VSV nghiên cứu ứng dụng Chính vậy, để cải thiện tính chất đất, góp phần nâng cao suất, chất lượng sản phẩm chè Shan Yên Bái cần thiết phải tuyển chọn chủng VSV hữu hiệu, phù hợp với vùng đất đồi núi cao Yên Bái Do vậy, thực đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan (Camellia sinensis Var Shan) Yên Bái” Mục đích đề tài - Mục đích: Tuyển chọn chủng VSV hữu hiệu phù hợp để sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng cho chè Shan Yên Bái Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu đề tài luận án góp phần bổ sung liệu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất loại chế phẩm, phân bón VSV phân bón hữu VSV phục vụ cho vùng trồng chè Shan Yên Bái - Ý nghĩa thực tiễn: Kết nghiên cứu đề tài luận án sở để phổ biến, tuyên truyền khuyến cáo sản xuất chè Shan chất lượng cao tỉnh Yên Bái, thay đổi tập quán sản xuất người nông dân theo hướng nông nghiệp hữu (sử dụng loại phân bón VSV) Điểm luận án - Lựa chọn chủng VSV có khả phân giải phốt phát khó tan, cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng thực vật từ vùng đất trồng chè Shan Yên Bái - Chọn 01 chủng VSV phân giải phốt phát sắt 01 chủng VSV phân giải phốt phát nhôm từ đất trồng chè đánh giá có ảnh hưởng tốt đến sinh trưởng, phát triển chè Shan Yên Bái Cấu trúc luận án Luận án 148 trang với 41 bảng số liệu 20 hình Luận án gồm phần: - Mở đầu (4 trang) - Chương Tổng quan tài liệu (40 trang) - Chương Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (25 trang) - Chương Kết thảo luận (76 trang) - Kết luận kiến nghị (2 trang) Đã tham khảo 121 tài liệu Trong có 61 tài liệu Tiếng Việt, 60 tài liệu tiếng nước Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) công nghiệp chủ yếu nhiều nước giới Tại Việt Nam, năm gần đây, ngành sản xuất chè ngày tăng mạnh, đứng thứ tổng số nước sản xuất chè lớn giới (Hiệp hội Chè Việt Nam, 2012) Chè Shan bốn biến chủng chè giới, có khả cho suất cao, chất lượng tốt Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 40 nghìn chè Shan, chiếm 30% diện tích chè nước, tập trung vùng núi cao phía Bắc như: Yên Bái, Hà Giang, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu, Phú Thọ Theo nghiên cứu nhà khoa học, hầu hết vùng đất trồng chè giới có đặc điểm chua (pH 4,5-5,5) nghèo dinh dưỡng Tính chất chua đất ảnh hưởng đến việc sử dụng dinh dưỡng Đặc biệt, phản ứng chua đất chứa lượng lớn Fe3+ Al3+, bón loại phân lân vào đất tạo thành dạng phốt phát sắt, nhôm khó tiêu, chè khó sử dụng Các nghiên cứu nước việc sử dụng loại phân bón có bổ sung thêm số chủng VSV có lợi giải pháp khoa học nhằm làm tăng suất chất lượng chè, đồng thời cải thiện tính chất đất, giảm ô nhiễm môi trường Tại Việt Nam, có số nghiên cứu phân bón vi sinh sử dụng cho chè Tuy nhiên, chè Shan Yên Bái, chưa có sản phẩm VSV nghiên cứu ứng dụng Chƣơng VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Các mẫu đất trồng chè thu thập thôn Pang Cáng thôn Bản Mới xã Suối Giàng, huyện Văn Chấn, tỉnh Yên Bái - Giống chè Shan Suối Giàng tuổi (dùng nghiên cứu chậu vại), chè Shan Suối Giàng tuổi (dùng nghiên cứu đồng ruộng) 2.2 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá số đặc điểm lý, hóa học VSV đất vùng trồng chè Shan Yên Bái - Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan Yên Bái - Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan Yên Bái - Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái - Nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm VSV đến sinh trưởng, phát triển chè Shan tuổi 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp đánh giá số đặc điểm lý, hóa học vi sinh vật đất vùng trồng chè Shan Yên Bái 2.3.1.1 Phương pháp lấy mẫu nghiên cứu Mẫu đất lấy theo phương pháp điểm, theo hướng dẫn Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, trồng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa (1998) 2.3.1.2 Phương pháp phân tích số tiêu lý, hóa học vi sinh vật đất - Độ ẩm đất theo TCVN 6648 : 2000; pH theo TCVN 5979 : 2007; OC (%) theo TCVN 8941 : 2011; Đạm tổng số (N%) theo TCVN 6498 : 1999; Lân tổng số (P2O5%) theo TCVN 8940 : 2011; Kali tổng số (K2O%) theo TCVN 8660 : 2011; Lân dễ tiêu theo TCVN 5256 : 2009; Kali dễ tiêu theo TCVN 8662 : 2011; Phành phần giới hạt theo TCVN 8567 : 2010; Phốt phát thành phần (Fe – P, Fe – Al, Ca - P) theo P R Hesse, Chang Jackson - Kiểm tra mật độ vi sinh vật (Nguyễn Xuân Thành, 2007) 2.3.2 Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan Yên Bái 2.3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật - Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật (tiến hành tương tự phần phương pháp phân tích tiêu VSV đất) - Hình thái khuẩn lạc gồm đặc điểm theo Nguyễn Xuân Thành (2007) - Nhuộm Gram tiến hành theo phương pháp Nguyễn Xuân Thành (2007) - Hình dạng tế bào theo Nguyễn Kim Giao (2004) 2.3.2.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu * Xác định khả phân giải phốt phát khó tan - Tuyển chọn theo hoạt tính sinh học + Dựa vào nồng độ PO43- theo phương pháp Xanh molipdate (Maiti, 2004) + Phương pháp định tính dựa vào khả cho vòng phân giải đĩa petri (TCVN 6167:1996) - Tuyển chọn theo khả thích nghi với nhiệt độ pH môi trường Xác định pH thích hợp: Các chủng VSV nuôi giá trị pH môi trường khác nhau: 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 6,0 Sau ngày nuôi, tiến hành xác định mật độ tế bào VSV theo TCVN 6167 : 1996, hoạt tính xác định theo Maiti (2004) Xác định nhiệt độ: Các chủng VSV nuôi môi trường đặc hiệu mốc nhiệt độ khác 200C, 250C, 300C, 350C, 400C - Tuyển chọn theo khả tác động lên lý, hóa sinh sinh trưởng + Thí nghiệm chậu vại 1: gồm công thức (Không bón phân + 20 ml dịch môi trường chứa Al – P; Không bón phân + 20 ml dịch vk PAl – chứa 108 CFU/ml Không bón phân + 20 ml dịch vk PAl – chứa 108 CFU/ml) với lần lặp lại (1 cây/1 chậu, lần lặp chậu) Các tiêu theo dõi: Chiều cao cây, đường kính gốc, khối lượng thân khô/cây, hàm lượng diệp lục + Thí nghiệm chậu vại 2: Tiến hành tương tự thí nghiệm thay chủng vk PAl – chủng vk PFe – 1, chủng vk PAl – thay chủng vk PFe – môi trường chứa Al – P môi trường chứa Fe – P * Xác định khả cố định nitơ tự - Tuyển chọn theo hoạt tính sinh học Xác định thông qua hàm lựng NH4+ có dịch nuôi cấy phương pháp Nessler (Jeffery et al, 1989) - Tuyển chọn theo khả thích nghi với nhiệt độ pH môi trường Các chủng VSV nuôi môi trường Burk lỏng, ngưỡng pH môi trường khác nhau: pH4, pH4,5, pH5, pH5,5, pH6 Sau ngày nuôi, tiến hành xác định mật độ tế bào VSV theo TCVN 6166 : 2002 xác định hoạt tính chủng phương pháp Nessler Tiến hành tương tự để xác định khả thích nghi chủng VSV với nhiệt độ môi trường, chủng nuôi mốc nhiệt độ khác nhau: 200C, 250C, 300C, 350C, 400C - Tuyển chọn theo khả tác động lên lý, hóa sinh sinh trưởng Thí nghiệm tiến hành tương tự phương pháp đánh giá tác động chủng VSV phân giải phốt phát khó tan, công thức thí nghiệm bao gồm: Đ/C: Không bón phân + 20 ml dịch môi trường nuôi cấy; CT1: Không bón phân + 20 ml dịch vk D12 chứa 108 CFU/ml CT2: Không bón phân + 20 ml dịch vk C5 chứa 108 CFU/ml * Xác định khả sinh Indole axetic axit (IAA) - Tuyển chọn theo hoạt tính sinh học Nồng độ IAA xác định phương pháp so màu Salkowski bước sóng 530 nm (TCVN 2012), môi trường nuôi cấy VSV bổ sung Ltryptophan - Tuyển chọn theo khả thích nghi với nhiệt độ pH môi trường Các chủng VSV nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung Ltryptophan (100mg/l), nuôi lắc 200 vòng/phút máy lắc ủ nhiệt nhiệt độ 300C, với giá trị pH môi trường khác nhau: 4, 4,5, 5, 5,5 Sau ngày nuôi, xác định mật độ tế bào có dịch nuôi theo TCVN - 2012, xác định hoạt tính chủng phương pháp so màu Salkowski (TCVN 2012) Phương pháp xác định khả thích nghi chủng VSV với nhiệt độ môi trường tiến hành tương tự mốc nhiệt độ khác 200C; 250C; 300C; 350C; 400C - Tuyển chọn theo khả tác động lên lý, hóa sinh sinh trưởng Thí nghiệm tiến hành tương tự phương pháp đánh giá tác động chủng VSV phân giải phốt phát khó tan, công thức thí nghiệm bao gồm: Đ/C: Không bón phân + 20 ml dịch môi trường nuôi cấy; CT1: Không bón phân + 20 ml dịch vk TS1 chứa 108 CFU/ml; CT2: Không bón phân + 20 ml dịch vk TS4 chứa 108 CFU/ml 2.3.2.3 Phương pháp định danh đến loài xác định mức độ an toàn sinh học chủng vi sinh vật * Phƣơng pháp phân loại phƣơng pháp truyền thống Dựa vào đặc điểm hình thái như: nhuộm Gram, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào đặc điểm khác để sơ phân loại theo phương pháp truyền thống (nội dung phương pháp mục 2.3.2.1 phần Phân lập chủng vi sinh vật) * Phƣơng pháp phân loại kỹ thuật sinh học phân tử Dựa trình tự gen 16S chủng vi khuẩn đọc trực tiếp máy đọc trình tự tự động 3100 Avant Kết trình tự so sánh với trình tự nucleotit loài xác định ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Sau so sánh đối chiếu xử lý số liệu tất chuỗi chương trình GENDOC2.5 Tên VSV xác định với xác suất tương đồng cao * Phƣơng pháp xác định mức độ an toàn sinh học Dựa theo hướng dẫn Ủy ban tác nhân sinh học (The Committee for Biological Agents (ABAS), 2010) thuộc Viện Liên bang Đức theo hướng dẫn tổ chức WHO (2004) 2.3.3 Phương pháp lựa chọn tổ hợp chủng vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái 2.3.3.1 Phương pháp lựa chọn tổ hợp vi sinh vật phòng thí nghiệm Dựa vào phương pháp định tính định lượng để lựa chọn 2.3.3.2 Phương pháp lựa chọn tổ hợp vi sinh vật thông qua mức độ tác động đến sinh trưởng phát triển giống chè SG1 tuổi Thí nghiệm chậu vại gồm công thức (Không bón phân + 20 ml dịch môi trường nuôi cấy; Không bón phân + 20 ml hỗn hợp chủng VK (mật độ tế bào chủng 108 CFU/ml)) với lần lặp lại (1 cây/1 chậu, lần lặp chậu) Các tiêu theo dõi: Chiều cao cây, số cành cấp 1, cấp 2, chiều dài rễ, khối lượng rễ khô/cây, chiều dài, rộng lá, diện tích (cm2) 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm VSV sử dụng cho chè Shan Yên Bái 2.3.4.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối * Xác định môi trƣờng thích hợp cho nuôi cấy vi sinh vật Đánh giá khả phát triển chủng VSV môi trường khác để xác môi trường nuôi cấy thích hợp * Xác định pH môi trƣờng thích hợp cho nhân giống 04 chủng vi khuẩn nuôi giá trị pH 4,5 - 8,0 Tiến hành kiểm tra mật độ VSV để xác định pH thích hợp * Xác định nhiệt độ môi trƣờng thích hợp cho nhân giống Nhiệt độ điều chỉnh từ 200C - 400C Sau thời gian nuôi cấy thích hợp, xác định mật độ tế bào chủng vk để xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp * Xác định thời gian thích hợp cho nhân giống chủng vk nuôi điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp tiến hành kiểm tra mật độ tế bào VSV sau nuôi cấy từ 12-108 để lựa chọn thời gian thích hợp * Xác định tốc độ khuấy thích hợp cho nhân giống 04 chủng vk nuôi riêng rẽ, tiến hành khảo sát tốc độ khuấy: 250 - 400 vòng/phút Sau khoảng thời gian thích hợp tiến hành đếm mật độ tế bào VSV để xác định tốc độ khấy * Xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp cho nhân giống Nghiên cứu tiếp giống chủng vk tỷ lệ - 7%, kết thúc thời gian nuôi cấy tiến hành đánh giá mật độ tế bào VSV để xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp 2.3.4.2 Phương pháp nghiên cứu lựa chọn chất mang cho sản xuất chế phẩm Dịch lên men 04 chủng vk trộn vào than bùn hỗn hợp than bùn : cám gạo : rỉ đường với tỉ lệ 10:2:0,1 Mật độ hoạt tính chủng vk kiểm tra bắt đầu bảo quản, định kì sau bảo quản tháng, tháng tháng 2.3.4.3 Phương pháp xác định tỷ lệ phối trộn dịch vi sinh vật với chất mang Dịch lên men chủng vk phối trộn với chất mang tỷ lệ khác từ 2-10%, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào VSV để lựa chọn tỷ lệ thích hợp 2.3.4.4 Phương pháp sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật Tổng hợp thông số kỹ thuật thích hợp cho trình nhân sinh khối 04 chủng vk đề tài tiến hành sản xuất thử nghiệm 200 kg chế phẩm Sau tháng bảo quản, tiến hành đánh giá số tiêu chế phẩm như: Độ ẩm theo TCVN 9297 : 2012, pH theo TCVN 5779 : 2007, mật độ tế bào VSV cố định nitơ theo TCVN 6166 : 2002, mật độ tế bào VSV phân giải phốt phát khó tan theo TCVN 6167 : 1996, mật độ tế bào VSV kích thích sinh trưởng theo TCVN 2012 2.3.4.5 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái Tổng hợp kết nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm VSV sử dụng cho chè Shan Yên Bái 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm vi sinh vật đến sinh trưởng, phát triển chè Shan SG1 tuổi Thí nghiệm đồng ruộng gồm công thức (Nền + Không bổ sung chế phẩm VSV; Nền + 15 kg chế phẩm/ha; CT3: Nền + 20 kg chế phẩm/ha) với lần lặp lại, diện tích ô thí nghiệm: 45 m2 Các tiêu theo dõi: Mật độ tế bào VSV cố định nitơ (TCVN 6166 : 2002); VSV phân giải phốt phát khó tan (TCVN 6167 : 1996), VSV kích thích sinh trưởng thực vật (TCVN 2012) trước sau thí nghiệm; Phân tích số tiêu hóa tính đất độ sâu - 20 cm 20 - 40 cm trước sau thí nghiệm (phương pháp phần 2.3.1.2); Chiều cao cây; Sinh trưởng búp; Rộng tán; Đường kính thân; CSDTL; Số lứa hái; Số búp cây; Năng suất búp/cây; Năng suất ô thí nghiệm; Hàm lượng tanin; Hàm lượng chất hoà tan; Hàm lượng axit amin; Hàm lượng đường khử chất lượng chè thành phẩm (TCVN 32182012) 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Kết thí nghiệm tổng hợp xử lý, vẽ đồ thị, biểu đồ Microsoft Excel - 2007 Số liệu xử lý theo chương trình xử lý thống kê sinh học phần mềm STATISTIX 10.0 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá số đặc điểm lý, hóa học vi sinh vật đất vùng trồng chè Shan Yên Bái * Chỉ tiêu lý, hóa học đất Tiến hành lấy mẫu đất nghiên cứu độ cao tương ứng 600 m, 900 m 1.200m Kết phân tích thành phần lý, hóa học mẫu đất thể bảng 3.1 Kết bảng 3.1 cho thấy: Đất có thành phần giới nặng, thành phần cấp hạt sét dao động 40,5% - 50,3%, thành phần cấp hạt limon chiếm 39,5% đến 49,9% thành phần cấp hạt cát chiếm khoảng 9,6% - 13,7% Đất có phản ứng chua, pHKCl dao động từ 4,58 đến 4,84 độ chua có xu hướng tăng dần theo độ cao Tỉ lệ bon hữu thấp, dao động khoảng 1,08 - 1,33% Đạm, kali tổng số kali dễ tiêu mức trung bình, lân tổng số cao, đạt khoảng 0,15%, lân dễ tiêu lại mức thấp, đạt khoảng 0,16 - 0,28 mg/100g đất Lân khoáng dạng phốt phát sắt đạt từ 24,61 đến 27,03 mg/100g đất phốt phát nhôm 16,56 - 21,22 mg/100g đất (chiếm ưu thế) phốt phát canxi mức thấp hơn, đạt 6,67 - 10,21 mg/100g đất Bảng 3.1 Kết phân tích số tiêu lý, hóa học đất trồng chè Shan Suối Giàng, Yên Bái độ cao khác Độ cao Độ cao Độ cao Các tiêu phân tích 600 m 900 m 1.200 m pHKCl 4,84±0,12 4,71±0,12 4,58±0,25 OC (%) 1,33±0,07 1,19±0,14 1,08±0,04 Độ ẩm đất (%) (tháng 4/2012) 25,14±0,76 23,82±1,23 24,20±1,13 Thành phần Cấp hạt cát 10,21±1,43 9,64±1,59 13,70±0,69 giới đất (%) Cấp hạt limon 39,48±0,62 49,94±2,18 45,71±1,60 Cấp hạt sét 50,29±2,50 40,52±2,21 40,58±1,70 N 0,18±0,01 0,14±0,02 0,11±0,02 Tổng số (%) P2O5 0,15±0,01 0,15±0,02 0,15±0,02 K2O 0,46±0,06 0,46±0,06 0,43±0,03 Dễ tiêu P2O5 0,28±0,05 0,21±0,03 0,16±0,02 (mg/100g đất) K2O 8,65±0,34 8,70±0,73 8,66±0,28 Ca – P 10,21±0,45 7,84±0,57 6,67±0,31 Lân thành phần Al – P 16,56±0,83 20,01±1,15 21,22±1,30 (mg/100g đất) Fe – P 27,03±1,28 25,67±1,08 24,61±0,51 * Chỉ tiêu vi sinh vật Kết hình 3.1 cho thấy, mật độ tế bào VSV tổng số đạt khoảng 106 CFU/g Theo độ cao địa hình mật độ tế bào VSV tổng số có xu hướng giảm nhẹ Hình 3.1 Biểu đồ mật độ tế bào VSV đất trồng chè Shan Yên Bái theo độ cao địa hình 3.2 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan Yên Bái 3.2.1 Phân lập chủng vi sinh vật hữu hiệu đất trồng chè Shan Yên Bái 11 Bảng 3.6 Ảnh hưởng hai chủng vi khuẩn PA-1 PAl- đến số tiêu sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè SG1 tuổi Công thức Đ/C CT1 CT2 LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu Hàm lượng N (%) 1,50c 1,75a 1,62b 0,11 3,04 b a ab Hàm lượng P205 (%) 0,20 0,22 0,21 0,02 4,56 b a ab Hàm lượng K20 (%) 0,23 0,26 0,25 0,03 4,84 c a b Chlorophylla (mg/g lá) 0,40 0,51 0,45 0,03 3,27 b a a Chlorophyllb (mg/g lá) 0,36 0,54 0,49 0,06 6,02 c a b Tổng diệp lục (mg/g lá) 0,76 1,05 0,94 0,07 3,56 c a b Carotenoit (mg/g lá) 0,23 0,32 0,28 0,02 3,49 b a ab Chiều cao (cm) 25,57 28,60 27,23 3,01 4,90 b a ab Đường kính thân (cm) 0,37 0,42 0,38 0,04 4,29 Khối lượng chất khô 19,34c 25,31a 21,57b 1,63 3,25 (g/cây) Các chủng vk phân giải phốt phát nhôm có ảnh hưởng tích cực rõ đến sinh lý, sinh hóa sinh trưởng Đặc biệt, CT1 - chủng vi khuẩn PAl - có tác động lớn đến khả tích lũy N, P chè, làm tăng rõ rệt hàm lượng chlorophyll thành phần (chlorophylla, carotenoit) diệp lục tổng số Khi bón bổ sung dịch vi khuẩn PAl - 1, chè Shan SG1 tuổi sinh trưởng tốt Bảng 3.7 Ảnh hưởng chủng vi sinh vật phân giải phốt phát sắt đến số tiêu sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè SG1 tuổi Công thức Đ/C CT1 CT2 LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu Hàm lượng N (%) 1,49c 1,75a 1,62b 0,12 3,2 b a ab Hàm lượng P205 (%) 0,20 0,22 0,21 0,02 4,1 b a ab Hàm lượng K20 (%) 0,22 0,24 0,23 0,02 3,7 b a ab Chlorophylla (mg/g lá) 0,40 0,50 0,44 0,07 6,6 c a b Chlorophyllb (mg/g lá) 0,42 0,54 0,49 0,05 4,3 c a b Tổng diệp lục (mg/g lá) 0,82 1,04 0,93 0,11 5,2 c a b Carotenoit (mg/g lá) 0,20 0,28 0,25 0,03 4,7 b a ab Chiều cao (cm) 26,93 28,93 28,27 1,93 3,0 b a ab Đường kính thân (cm) 0,37 0,43 0,39 0,06 6,5 c a b Khối lượng chất khô (g/cây) 19,45 25,59 22,29 2,17 4,3 Tất tiêu theo dõi có xu tăng công thức bón dịch chủng vk so với công thức đối chứng (không bón dịch vk) Ở công thức bón dịch vi khuẩn PFe – 1, tiêu sinh trưởng, khả tích lũy N, P, K chè, hàm lượng chlorophyll thành phần (chlorophyllb, carotenoit) diệp lục tổng số đạt cao Như vậy, chủng vk phân giải phốt phát nhôm PAl - phân giải phốt phát sắt PFe - lựa chọn cho nghiên cứu 12 3.2.2.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật cố định nitơ tự * Tuyển chọn theo hoạt tính sinh học Hoạt tính cố định nitơ chủng VSV xác định dựa vào hàm lượng NH4+ tổng hợp dịch nuôi cấy Kết nghiên cứu trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả tổng hợp NH4+ 37 chủng vi sinh vật có hoạt tính cố định nitơ sau ngày nuô cấy, pH4,5 T T 10 11 12 13 Hoạt tính cố định nitơ (mgNH4+/l) 0,61 0,64 1,63 1,46 0,68 0,38 1,52 0,85 1,31 0,20 0,43 2,06 0,62 Kí hiệu chủng D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 S1 Hoạt tính cố địnhnitơ (mgNH4+/l) 14 S2 0,43 15 S3 1,20 16 S4 0,70 17 S5 0,82 18 S6 1,43 19 S7 1,28 20 S8 0,25 21 C1 1,61 22 C2 1,10 23 C3 1,30 24 C4 0,52 25 C5 2,15 26 C6 0,23 LSD0,05 = 0,04; CV(%) = 2,79 TT Kí hiệu chủng TT Kí hiệu chủng 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 Hoạt tính cố định nitơ (mgNH4+/l) 0,70 1,42 0,35 1,67 0,28 1,15 1,03 0,27 0,23 1,58 37 C17 1,04 Bảng 3.8 cho thấy, 37 chủng vk nghiên cứu có chủng (kí hiệu D12 C5) có hoạt tính cố định nitơ cao nhất, chủng D12 (2,06 mg NH4+/l) chủng C5 (2,15 mg NH4+/l) * Đánh giá khả thích nghi chủng vi sinh vật với môi trường đất trồng chè Shan Yên Bái Kết đánh giá giá khả thích nghi với độ chua nhiệt độ môi trường hai chủng vk D12 C5 thể hình 3.8 3.9 6 4 3 2 + Nồng độ NH4 (mg/l) Mật độ tế bào (log10xCFU/ml) 1 0 pH (4,0) pH (4,5) pH (5,0) pH (5,5) pH (6,0) pH (4,0) pH (4,5) Chủng D12 pH (5,0) pH (5,5) pH (6,0) Chủng C5 pH môi trƣờng Mật độ Hoạt tính Hình 3.8 Khả thích nghi chủng vi khuẩn D12 C5 với độ chua môi trƣờng khác Kết hình 3.8 cho thấy, dải pH từ 4,0-6,0 chủng vi khuẩn phát triển bình thường đến tốt (mật độ tế bào đạt 10 5-107 CFU/ml) Hoạt tính cố 13 định nitơ chủng vi khuẩn mức trung bình đến mạnh (1,25-6,09 mg NH4+/l) Trong điều kiện môi trường chua (pH4,5) hai chủng vi khuẩn phát triển tốt 300C (mật độ tế bào VSV đạt 106 - 107 CFU/ml), đồng thời hoạt tính sinh học cao nhất: chủng D12 (1,98 mg NH4+/l) chủng C5 (2,15 mg NH4+/l) Nhiệt độ thích hợp cho phát triển chủng D12 25 - 35oC chủng C5 25 - 30oC (Hình 3.9) 2.5 1.5 0.5 Nồng độ NH4+(mg/l) Mật độ tế bào (log10xCFU/ml) 0 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 20oC 25oC Chủng D12 30oC 35oC 40oC Chủng C5 Nhiệt độ Mật độ Hoạt tính Hình 3.9 Khả thích nghi chủng vi khuẩn D12 C5 với nhiệt độ môi trƣờng khác (pH4,5) * Đánh giá tác động chủng VSV lên sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan tuổi Tiến hành đánh giá mức độ tác động chủng vi khuẩn D12 C5 đến trồng Kết theo dõi tổng hợp bảng 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn D12 C5 đến số tiêu sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan SG1 tuổi Công thức Chỉ tiêu Hàm lượng N (%) Hàm lượng P205 (%) Hàm lượng K20 (%) Chlorophylla (mg/g lá) Chlorophyllb (mg/g lá) Tổng diệp lục (mg/g lá) Carotenoit (mg/g lá) Chiều cao (cm) Đường kính thân (cm) Khối lượng chất khô (g/cây) Đ/C CT1 CT2 LSD0,05 CV(%) 1,36c 0,21b 0,24b 0,44c 0,37c 0,81c 0,20c 25,30b 0,39b 19,64c 1,53b 0,22ab 0,26ab 0,50b 0,43b 0,93b 0,23b 26,20ab 0,41ab 22,48b 1,70a 0,23a 0,27a 0,56a 0,51a 1,06a 0,27a 27,93a 0,47a 24,28a 0,14 0,02 0,03 0,04 0,04 0,05 0,03 2,54 0,06 1,79 4,12 3,81 4,60 3,49 3,59 2,46 5,45 4,23 6,62 3,57 Kết bảng 3.9 cho thấy, chủng vi khuẩn cố định nitơ có tác động tích cực đến sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan SG1 tuổi Tuy nhiên, chủng vi khuẩn C5 có tác động rõ rệt tiêu theo dõi như: hàm lượng nitơ tổng số, chlorophylla, chlorophyllb, carotenoit, diệp lục tổng số khối lượng chất khô) 3.2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật * Tuyển chọn theo hoạt tính sinh học Hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật chủng VSV xác định thông qua khả sinh tổng hợp IAA dịch nuôi cấy Kết 14 trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Khả kích thích sinh trưởng thực vật 16 chủng vi khuẩn sau ngày nuôi cấy, pH4,5 TT 10 11 12 13 14 15 16 Kí hiệu chủng TD1 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6 TS1 TS2 TS3 TS4 TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 Độ cao lấy mẫu (m) 1200 1200 1200 1200 1200 1200 900 900 900 900 600 600 600 600 600 600 Khả sinh tổng hợp IAA (µgIAA/ml) 9,35 6,16 13,88 4,36 6,39 1,29 16,18 8,30 5,65 16,53 8,77 14,24 2,37 10,93 4,33 13,32 LSD0,05 CV(%) 0,27 1,82 10 25 20 15 10 Nồng độ IAA (µg/ml) Mật độ tế bào (log10xCFU/ml) Kết bảng 3.10 cho thấy, chủng vk phân lập độ cao 900 m có khả tổng hợp IAA cao TS1 (16,18 µg IAA/ml) TS4 (16,53 µg IAA/ml) * Đánh giá khả thích nghi chủng VSV với môi trường đất trồng chè Shan Yên Bái Đánh giá thích nghi chủng VSV với điều kiện nhiệt độ pH môi trường khác Kết tổng hợp hình 3.10 3.11 pH (4,0) pH (4,5) pH (5,0) pH (5,5) pH (6,0) pH (4,0) pH (4,5) Chủng TS1 pH (5,0) pH (5,5) pH (6,0) Chủng TS4 pH môi trƣờng Mật độ Hoạt tính Hình 3.10 Khả thích nghi vi khuẩn TS1 TS4 với độ chua môi trƣờng khác Nhìn chung, dải pH 4,0 - 6,0 chủng vk TS4 sinh trưởng tốt chủng TS1 pH 6,0 phù hợp cho chủng phát triển Kết hình 3.11 cho thấy, môi trường pH4,5 chủng vk có mật độ tế bào đạt 104 - 107CFU/ml Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp IAA 15 20 18 16 14 12 10 Nồng độ IAA (µg/ml) Mật độ tế bào (log10xCFU/ml) chủng đạt mức trung bình đến tốt (8,41 - 17,61 µg IAA/ml) Do vậy, chủng vk lựa chọn để tiếp tục thử nghiệm trồng 0 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 20oC 25oC Chủng TS1 30oC 35oC 40oC Chủng TS4 Nhiệt độ môi trƣờng Mật độ Hoạt tính Hình 3.11 Khả thích nghi vk TS1, TS4 với nhiệt độ môi trƣờng khác (pH4,5) * Đánh giá tác động chủng VSV lên sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan tuổi Đánh giá tác động chủng vk TS1 TS4 đến số tiêu sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè nghiên cứu Kết tổng hợp bảng 3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn TS1 TS4 đến số tiêu sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè SG1 tuổi Công thức Đ/C CT1 CT2 LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu Hàm lượng N (%) 1,52b 1,83a 1,85a 0,26 6,72 b ab ab Hàm lượng P205 (%) 0,21 0,23 0,23 0,02 4,42 b a a Hàm lượng K20 (%) 0,26 0,30 0,30 0,03 4,37 b ab a Chlorophylla (mg/g lá) 0,50 0,55 0,56 0,05 4,20 b ab a Chlorophyllb (mg/g lá) 0,48 0,51 0,53 0,04 3,48 b ab a Tổng diệp lục (mg/g lá) 0,98 1,06 1,09 0,08 3,25 b a a Carotenoit (mg/g lá) 0,22 0,24 0,25 0,02 4,35 b a a Chiều cao (cm) 27,67 31,40 32,47 2,53 3,65 b a a Đường kính thân (cm) 0,37 0,47 0,48 0,06 6,00 b a a KL chất khô (g/cây) 20,49 26,77 27,19 2,22 3,95 Kết bảng 3.11 cho thấy, chủng vk nghiên cứu có tác động tích cực đến trồng, khả tích lũy N tổng số tăng từ 20,39 - 21,71% so với đối chứng (không bổ sung vk), làm tăng chiều cao 3,73 - 4,79 cm đặc biệt làm tăng khả tích lũy chất khô 6,28 - 6,7 g/cây 3.2.2.4 Định tên đến loài xác định độ an toàn sinh học chủng vi sinh vật * Định tên đến loài chủng vi sinh vật tuyển chọn Phân loại phƣơng pháp truyền thống Kết đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình ảnh tế bào chủng vi khuẩn cho thấy, với đặc điểm khuẩn lạc tế bào vi khuẩn PAl – 1, TS1, C5, TS4 mang nhiều đặc điểm chi Bacillus Vi khuẩn 16 PFe - mang nhiều đặc điểm thuộc họ Enterobacteriaceae Phân loại kỹ thuật sinh học phân tử Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen 16S riboxom 05 chủng vk cho thấy, chủng PFe - có quan hệ họ hàng gần với loài vk Enterobacter ludwigii, chủng PAl - với loài Bacillus subtilis, chủng C5 với loài Bacillus megaterium, chủng TS1 với loài Bacillus cereus chủng TS4 với loài Bacillus amyloliquefaciens 3.2.2.5 Mức độ an toàn sinh học chủng vi sinh vật tuyển chọn Kết đánh giá mức độ an toàn sinh học cho thấy 05 chủng vk nghiên cứu cấp độ an toàn Tuy nhiên, loài vi khuẩn Bacillus cereus (cấp độ an toàn 2) biết đến nhiều với nguy gây ngô độc thực phẩm Mặt khác, khả sinh IAA chủng Bacillus cereus TS1 không cao so với chủng TS4 Do vậy, để đảm bảo an toàn sản xuất sử dụng định loại bỏ chủng Bacillus cereus TS1 3.3 Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho chè Shan Yên Bái 3.3.1 Nghiên cứu khả tổ hợp chủng vi sinh vật phương pháp định tính C vị trí tiếp xúc 3.3.2 Nghiên cứu khả tổ hợp chủng vi sinh vật phương pháp định lượng Mật độ tế bào chủng vk dạng phối trộn đơn lẻ dạng hỗn hợp khác biệt đáng kể theo thời gian bảo quản Mật độ tế bào vk trì suốt thời gian tháng bảo quản đạt >108 CFU/g Hoạt tính sinh học chủng vk nghiên cứu suy giảm không đáng kể điều kiện riêng lẻ hỗn hợp suốt thời gian tháng bảo quản 3.3.3 Đánh giá tác động hỗn hợp chủng vi sinh vật lên sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan SG1 tuổi * Ảnh hƣởng đến số tiêu sinh lý, sinh hóa chè Sau năm theo dõi tiến hành phân tích số tiêu sinh lý, sinh hóa chè Kết tổng hợp bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng VSV đến số tiêu sinh lý, sinh hóa chè tuổi Công thức Đ/C TN LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu Hàm lượng N (%) 1,7 2,37 0,07 1,04 Hàm lượng P205 (%) 0,24 0,32 0,05 5,26 Hàm lượng K20 (%) 0,30 0,39 0,02 1,68 Chlorophylla (mg/g lá) 0,45 1,79 0,14 3,47 Chlorophyllb (mg/g lá) 0,51 0,74 0,11 5,09 Tổng diệp lục (mg/g lá) 0,96 2,53 0,19 3,07 Carotenoit (mg/g lá) 0,28 0,67 0,04 2,28 Kết bảng 3.18 cho thấy: 17 Bổ sung chủng vi khuẩn làm tăng rõ rệt khả tích lũy N, P2O5 K2O chè so với đối chứng không bổ sung VSV Hàm lượng N đạt 2,37%, tăng 39,41%, hàm lượng P205 đạt 0,32%, tăng 33,3% hàm lượng K20 đạt 0,39%, tăng 30% so với đối chứng Hàm lượng diệp lục thành phần (chlorophylla, chlorophyllb, carotenoit) diệp lục tổng số cao rõ rệt so với ĐC Hàm lượng chlorophyll tổng số đạt 2,53 mg/g lá, tăng 1,57 mg/g lá, lượng chlorophyll a đạt 1,79 mg/g lá, tăng 1,34 mg/g lượng carotenoit đạt 0,67 mg/g lá, tăng 0,33 mg/g so với ĐC * Ảnh hƣởng đến phát triển rễ chè Số rễ công thức bón hỗn hợp chủng vi khuẩn nhiều rõ rệt so với đối chứng không bón chiều dài rễ dài so với công thức không bón VSV Khối lượng thân khối lượng rễ công thức thí nghiệm cao so với công thức đối chứng Tỷ lệ khối lượng rễ/thân khô công thức bón hỗn hợp vi khuẩn đạt 0,73, công thức đối chứng thấp hơn, đạt 0,68 Bảng 3.19 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng vi sinh vật đến phát triển rễ chè SG1 tuổi Công thức Đ/C TN LSD0,05 CV(%) Số rễ chính/cây (cái) 5,36 6,24 0,82 4,05 Chiều dài rễ (cm) 23,63 27,36 1,34 1,50 Khối lượng thân khô (g/cây) 133,00 163,33 Khối lượng rễ khô (g/cây) 89,72 119,73 Tỷ lệ khối lượng rễ/thân 0,68 0,73 * Ảnh hƣởng đến sinh trƣởng chè Theo dõi ảnh hưởng chúng đến sinh trưởng thông qua chiều cao, đường kính thân cây, chiều rộng tán, số cành cấp Kết thể bảng 3.20 Bảng 3.20 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng VSV đến sinh trưởng chè SG1 tuổi Công thức Đ/C TN LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu Trước TN 24,51 24,47 0,88 1,02 Cao (cm) Sau TN 35,83 47,40 1,62 1,11 Tốc độ tăng 11,20 23,06 Trước TN 0,31 0,30 0,02 2,32 Đường kính Sau TN 0,56 0,66 0,14 6,38 thân (cm) Tốc độ tăng 0,25 0,36 Đường kính tán (cm) 32,19 34,39 1,75 1,49 Số cành cấp (cành) 3,39 4,80 0,45 3,15 Số cành cấp (cành) 1,75 2,59 0,32 4,26 Kết bảng 3.20 cho thấy, chiều cao cây, số cành cấp số cành cấp tăng rõ rệt công thức bón hỗn hợp chủng vi khuẩn so với công thức đối chứng Tốc độ tăng chiều cao công thức thí nghiệm đạt 23,06 cm, công thức đối chứng đạt 11,20 cm 18 * Ảnh hƣởng đến phát triển búp chè Đánh giá ảnh hưởng hỗn hợp chủng vi khuẩn lựa chọn đến phát phát triển búp chè SG1 tuổi trình bày bảng 3.21 Bảng 3.21 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng vi sinh vật đến phát triển búp chè SG tuổi Chỉ tiêu Công thức Dài (cm) Rộng (cm) Diện tích (cm2) Khối lượng búp (1 tôm lá) (g) KL búp/cây/năm (g) Đ/C TN LSD0,05 CV(%) 10,20 5,50 39,27 0,60 12,13 10,41 5,63 41,03 0,74 14,00 0,40 0,55 0,16 1,17 1,11 2,83 6,99 2,55 Kết thí nghiệm bón hỗn hợp chủng vi khuẩn (bảng 3.21) cho thấy, chè có xu hướng dài rộng hơn, diện tích chè đạt 41,03 cm2, cao so với công thức đối chứng 4,48% Khối lượng búp chè công thức thí nghiệm đạt 0,74 g, cao so với đối chứng 23,3% Khi xác định tiêu khối lượng búp/cây/năm cho kết tương tự 3.4 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái * Thông số kỹ thuật cho trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật Tổng hợp kết nghiên cứu điều kiện nhân sinh khối chủng vi sinh vật Kết tổng hợp bảng 3.29 Bảng 3.29 Các thông số kỹ thuật nhân sinh khối chủng vi khuẩn TT Thông số kĩ thuật Môi trường pH thích hợp t0 lên men thích hợp (oC) Tốc độ khuấy (vòng/phút) Lưu lượng cấp khí (lít không khí/lít môi trường/phút) Thời gian (giờ) Tỷ lệ cấp giống (%) PFe - SX1 7,0 30 350 Ký hiệu chủng VSV PAl -1 C5 SX1 SX1 7,0 6,5 30 30 350 350 TS4 SX1 6,5 35 350 0,75 0,75 0,75 0,75 72 48 48 48 * Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái Tiến hành tổng hợp kết nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái (Sơ đồ 1) 19 Sơ đồ 1: Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho chè Shan Yên Bái Nguyên liệu - Than bùn - Cám gạo - Rỉ đường Xử lý nguyên liệu - Than bùn kích thước