Nghiên cứu tuyển chọn và định tên chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính probiotic ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đƣợc khóa luận này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận đƣợc ủng hộ, giúp đỡ hƣớng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trƣờng, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, với tập thể cán trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Văn Thắng – Bộ môn Công nghệ Gen, ThS Nguyễn Thị Hồng Nhung – Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh – Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp – trƣờng Đại học Lâm nghiệp tận tình định hƣớng, hƣớng dẫn cho tơi suốt thời gian thực tập để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ Tôi xin trân thành cảm ơn anh chị, bạn học viên sinh viên phịng thí nghiệm vi sinh - hóa sinh nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin cảm ơn trân thành tới gia đình, bạn bè ln bên tơi, động viên khuyến khích giúp tơi vƣợt qua khó khăn suốt q trình nghiên cứu Tuy nhiên kiến thức chun mơn cịn hạn chế thân thiếu nhiều kinh nghiệm thực tiễn nên nội dung báo cáo không tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận đƣợc góp ý, bảo q báu thầy để báo cáo đƣợc hồn thiện Tơi xin trân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên thực Lê Thị Thương i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Thành phần đặc điểm vi sinh vật 1.1.3 Cơ chế tác động 1.1.4 Vai trò probiotic 1.2 Tổng quan vi khuẩn Lactic 1.2.1 Lịch sử phát vi khuẩn Lactic 1.2.2 Đặc điểm chung vi khuẩn Lactic 1.2.3 Phân loại 10 1.2.4 Lên men Lactic 11 1.2.5 Nhu cầu dinh dƣỡng vi khuẩn Lactic 13 1.2.6 Một số đặc tính probiotic vi khuẩn Lactic 15 1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic gia súc, gia cầm 16 1.3.1 Trên giới 16 1.3.2 Tại Việt Nam 18 PHẦN 2: MỤC TIÊU – NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghiên cứu 19 2.3.1 Vật liệu địa điểm nghiên cứu 19 2.3.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 ii 2.4.1 Định lƣợng axit lactic phƣơng pháp chuẩn độ Therner 21 2.4.2 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào đếm khuẩn lạc 21 2.4.3 Tuyển chọn chủng Lactic có đặc tính probiotic 22 2.4.5 Định danh chủng Lactic sinh học phân tử 29 2.4.6 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 32 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic có đặc tính probiotic 35 3.1.1 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào 35 3.1.2 Xác định khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định phƣơng pháp khoan lỗ thạch 37 3.1.3 Khảo sát khả chống chịu pH thấp 38 3.1.4 Khảo sát khả chống chịu muối mật 40 3.1.5 Xác định khả đề kháng chất kháng sinh vi khuẩn Lactic 41 3.1.6 Đánh giá khả bám dính vào niêm mạc ruột chủng Lactic 43 3.2 Xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng probiotic 44 3.3 Định danh chủng Lactic sinh học phân tử 46 3.4 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn 49 3.4.1 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy 49 3.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy 50 3.4.3 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 52 3.4.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon 53 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ cacbon 54 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích CFU Colony-Forming Unit CMC Carboxymethiylcellulose BOD Biochemical Oxygen demand ĐC Đối chứng EMP Embden – Mayerhor – Panas FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations Tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc MRS NN&PTNT Man, Rogosa and Sharpe Nông nghiệp phát triển nông thôn MT Môi trƣờng VK Vi khuẩn PBS Dung dịch muối đệm photphat OD Optical Density DNA Deoxyribonucleic acid RNA Axit ribonucleic EtBr Ethidium Bromide SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris EDTA TB Tế bào WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới CS Cộng iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Chu trình phản ứng PCR 30 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 3.1: Hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật 35 Bảng 3.2 Kết vòng kháng vi sinh vật kiểm định 37 Bảng 3.3 Kết khảo sát khả chịu pH thấp chủng Lactic 39 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả chống chịu muối mật 40 Bảng 3.5 Kết khả đề kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 42 Bảng 3.6 Kết thử khả bám dính chủng C2 LT7 44 Bảng 3.7 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn 45 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ trình lên men glucose vi khuẩn Lactic 12 Hình 3.1 Khả sinh enzyme Amylase chủng vi khuẩn Lactic 36 Hình 3.2 Khả sinh enzyme Cellulose chủng vi khuẩn Lactic 36 Hình 3.3 Khả sinh enzyme Protease chủng vi khuẩn Lactic 36 Hình 3.4: Khả đối kháng với vi khuẩn kiểm định chủng Lactic 38 Hình 3.5 Khả kháng kháng sinh chủng C2 42 Hình 3.6 Khả kháng kháng sinh chủng LT7 43 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng C2 44 Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng LT7 45 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm DNA tổng số chủng LT7 46 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR chủng LT7 47 Hình 3.11 Cây phát sinh chủng loài LT7 đƣợc so sánh với loài ngân hàng gen 16s rRNA NCBI 49 Hình 3.12 Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến tạo thành axit lactic chủng LT7 50 Hình 3.13 Ảnh hƣởng nhiệt độ ni cấy đến tạo thành axit lactic chủng LT7 51 Hình 3.14 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng đến tạo thành axit lactic chủng LT7 52 Hình 3.15 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến tạo thành axit lactic chủng vi khuẩn LT7 54 Hình 3.16 Ảnh hƣởng nồng độ cacbon đến tạo thành axit lactic chủng LT7 55 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần ngành chăn nuôi đƣợc xem ngành chiếm tỷ trọng lớn nông nghiệp với vai trò nguồn cung cấp khối lƣợng thực phẩm lớn nay, ngành chăn nuôi gia súc gia cầm nƣớc ta ngày phát triển, trở thành nguồn thu nhập quan trọng với hộ nông dân góp phần chuyển dịch cấu kinh tế Nông nghiệp Tuy nhiên, với phát triển không ngừng kéo theo dịch bệnh vật nuôi phát sinh phát triển, đặc biệt bệnh đƣờng ruột Với phát khoa học hoạt chất có khả kháng khuẩn Alex Fleming năm 1929, việc sử dụng kháng sinh đƣợc xem phƣơng pháp phổ biến việc phòng trừ dịch bệnh, điều trị bệnh truyền nhiễm, nhanh chóng đƣợc áp dụng nhiều nƣớc giới Song, việc lạm dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi nảy sinh tính kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh, biến tính chủng vi sinh vật, dƣ lƣợng thuốc kháng sinh thực phẩm,… gây ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời cân sinh thái Probiotic đời đƣợc xem giải pháp hữu hiệu an toàn bƣớc thay cho kháng sinh phòng điều trị bệnh đƣờng ruột cho gia súc gia cầm Probiotic chất bổ sung thực phẩm chứa vi khuẩn sống, có tác động làm cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột, từ ảnh hƣởng tốt cho động vật Các sản phẩm probiotic nhập dùng chăn ni có thị trƣờng nƣớc ta nhiều nhƣng tác dụng tích cực cho vật nuôi chƣa đƣợc rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật đƣờng ruột vật chủ địa Vi khuẩn Lactic nhóm vi sinh vật có ƣu triển vọng để ứng dụng sản xuất probiotic Bởi vi khuẩn Lactic có khả tạo mơi trƣờng toan, sản sinh nhiều loại chất ức chế vi sinh vật (axit lactic, diacetyl, bacteriocin…) nên sinh trƣởng tốt mơi trƣờng có pH thấp Ngồi ra, chúng cịn làm giảm lƣợng cholesteron máu, chữa bệnh rối loạn đƣờng ruột chống lại tƣợng nhờn thuốc sau thời gian điều trị kháng sinh dài ngày, đồng thời tạo thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho vật ni, Chính lý trên, tiến hành thực đề tài “Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactic có hoạt tính probiotic ứng dụng tạo chế phẩm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi” PHẦN I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu probiotic 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Những nghiên cứu probiotic bắt đầu vào kỷ 20, Henry Tisser (1900), bác sỹ ngƣời Pháp quan sát thấy phân cuả đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có vi khuẩn lạ hình trứng hình chữ Y đứa trẻ khỏe mạnh Năm 1907, Elie Metchnikoff – ngƣời Nga chúng minh việc tiêu thụ Lactobacillus hạn chế nội độc tố hệ vi sinh vật đƣờng ruột Ơng giải thích đƣợc điều bí ẩn sức khỏe ngƣời Bulgary, họ sống khỏe mạnh, tuổi thọ lên đến 115 tuổi hơn, nguyên nhân họ tiêu thụ lớn sản phẩm sữa chua lên mẹn, điều đƣợc ông báo cáo sách “The Prologation of life” (1908) [12] Năm 1930, nhà khoa học ngƣời Nhật Minoru Shirota phân lập vi khuẩn Lactic từ phân em thiếu nhi khỏe mạnh Cùng năm đó, nhà nghiên cứu Hoa Kỳ chứng minh Lactobacillus acidophilus có khả làm giảm bệnh táo bón thƣờng xuyên Năm 1965, Lilly Stiwell định nghĩa thuật ngữ “probiotic” yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng vi sinh vật [12] Năm 1968, King nghiên cứu thành cơng việc kích thích tăng trƣởng heo thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [7] Năm 1989, Fuller (Anh) định nghĩa probiotic nhƣ thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến vật chủ nhờ khả trì cân hệ vi sinh vật đƣờng ruột [18] Theo định nghĩa FAO/WHO năm 2002: “Probiotic, vi sinh vật sống đƣợc kiểm sốt chặt chẽ, với lƣợng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ” Đây định nghĩa đƣợc chấp nhận nhiều [28] Ngày sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria Lactobacillus đƣợc tiêu thụ rộng rãi phổ biến khắp giới nhƣ nguồn thực phẩm giúp tăng cƣờng sức khỏe cho ngƣời nhƣ vật nuôi 1.1.2 Thành phần đặc điểm vi sinh vật Nhóm vi khuẩn Lactic [12]: Phân bố rộng rãi thƣờng gặp sản phẩm lên men chua nhƣ dƣa chua, cà muối, mắm chua, sữa chua, Lactic có khả sinh axit lactic, tổng hợp vitamin nhóm B cịn sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh đƣợc gọi chung bateriocin gồm nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin, Theo Lee cs (1999), chế phẩm probiotic đƣợc biết đến nhiều với chủng VK Lactic sau: L acidophilus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S faecalis, [18] Nhóm vi khuẩn Bacillus: Là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện, phân bố phổ biến tự nhiên, khoang miệng, đƣờng ruột Các loài bacillus có khả phân giải hợp chất hữu nhƣ protein, tinh bột, cenlulase sinh enzyme ngoại bào mạnh Trong chế phẩm probiotic, ngƣời ta thƣờng sử dụng chủng thuộc giống Bacillus sau: B subtilis, B mesentericus, B megathericum, B licheniformis, B clausii,…[5, 12] Nấm men Sccharomyces: Tế bào nấm men giàu protein, vitamin nhóm B khống chất nên thƣờng đƣợc bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối tế bào [12] Chúng hấp thụ thải độc tố ngồi, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic chất cho vi sinh vật có lợi hoạt động sinh sản [8,14] Để sản xuất probiotic, ngƣời ta thƣờng dùng chủng sau: S cerevisiae, S carlsbergensis, S vini S pombe, đặc biệt S Boulardii có tác dụng điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp [7] Nấm mốc: A.oryzae A.niger, có vai trò sản sinh enzym amylase, protease, cellulase,…nhằm tăng cƣờng khả tiêu hóa thức ăn ngƣời vật ni, đồng thời đƣợc bổ sung vào chế phẩm để hỗ thể ngƣời động vật nên có lợi sử dụng chúng để làm chế phẩm probiotic phòng trị bệnh đƣờng ruột 3.4.3 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng Điều kiện pH có ảnh hƣởng lớn đến hoạt động enzyme trao đổi chất vi sinh vật Với vi khuẩn Lactic, trị số pH ban đầu môi trƣờng có ảnh hƣởng quan trọng đến sinh tổng hợp axit lactic chúng Sau tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn LT7 môi trƣờng MRS lỏng dải pH khác nhau: pH = 4, pH = 5, pH = 6, pH = 7, pH = 8, nhiệt độ thích hợp 370C đƣợc khảo sát 48 Xác định hàm lƣợng axit lactic sinh theo phƣơng pháp 2.4.1, ta thu đƣợc kết đƣợc trình bày bảng P6 hình 3.14: Hình 3.14 Ảnh hưởng pH mơi trường đến tạo thành axit lactic chủng LT7 Qua bảng P6 hình 3.14 ta thấy, pH ban đầu mơi trƣờng ảnh hƣởng quan trọng đến khả sinh tổng hợp axit lactic chủng vi khuẩn Lactic Ở thời điểm nuôi cấy 48 giờ, hàm lƣợng axit đạt cao 3,13 mg/ml pH ban đầu môi trƣờng pH = 52 Khi tăng từ pH = lên pH = 6, trình lên men tạo axit lactic diễn mạnh, hàm lƣợng axit lactic sinh nhiều, pH = 3,13 mg/ml gấp 1,5 lần so với pH = 2,08 mg/ml Khi pH môi trƣờng ban đầu tăng lên trung tính kiềm, lƣợng axit tạo giảm dần pH = 7, lƣợng axit giảm 2,72 mg/ml pH = giảm xuống cịn 2,55 mg/ml Có thể kết luận độ pH môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến tạo thành axit lactic chủng vi khuẩn Lactic, chúng tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn giai đoạn đầu q trình đồng hóa tổng hợp lên men chất cần thiết Nhƣ pH thích hợp để chủng vi khuẩn LT7 sinh tổng hợp axit lactic pH = 3.4.4 Ảnh hƣởng nguồn cacbon Ngƣời ta thƣờng dùng đƣờng để làm nguồn thức ăn cacbon nuôi cấy phần lớn vi sinh vật dị dƣỡng, vi khuẩn Lactic đƣờng nguyên liệu cung cấp cho trình lên men, nên mục đích thí nghiệm nhằm xác định nguồn đƣờng thích hợp cho sinh trƣởng sản sinh axit lactic chủng vi khuẩn LT7 Chủng vi khuẩn LT7 đƣợc nuôi cấy với nguồn đƣờng nhƣ glucose, saccharose lactose điều kiện tối ƣu đƣợc khảo sát Xác định hàm lƣợng axit sinh phƣơng pháp 2.4.1, kết thu đƣợc bảng P7 hình 3.15 sau: 53 Hình 3.15 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến tạo thành axit lactic chủng vi khuẩn LT7 Kết bảng P7 hình 3.15 cho thấy nguồn cacbon có ảnh hƣởng đến lên men sinh axit lactic chủng vi khuẩn LT7 Ở nguồn cacbon glucose, hàm lƣợng axit lactic đạt mức cao 3,08 mg/ml Khi sử dụng nguồn cacbon saccharose, hàm lƣợng axit lactic sinh thấp 2,63 mg/ml đạt 85,38% so với sử dụng glucose Khi sử dụng nguồn cacbon lactose, hàm lƣợng axit sinh 2,84 mg/ml đạt 92,20% so với sử dụng glucose Nhƣ thay lactose thay cho glucose nuôi cấy chủng Lactic Tuy nhiên xét tiêu chí giảm giá thành glucose lựa chọn tốt Điều giải thích môi trƣờng MRS ngƣời ta sử dụng glucose để bổ sung nguồn cacbon cho vi khuẩn lactic sinh trƣởng phát triển 3.4.5 Ảnh hƣởng nồng độ cacbon Để lựa chọn nồng độ cacbon thích hợp, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn LT7 môi trƣờng MRS lỏng có thay đổi hàm lƣợng đƣờng glucose 0,5%, 1%, 54 2% 3% điều kiện 370C, pH = 48 Xác định hàm lƣợng axit sinh phƣơng pháp 2.4.1 Kết đƣợc thể bảng P8 hình 3.16 dƣới đây: Hình 3.16 Ảnh hưởng nồng độ cacbon đến tạo thành axit lactic chủng LT7 Từ bảng P8 hình 3.16 cho thấy chủng vi khuẩn LT7 có khả sinh trƣởng, phát triển sinh axit lactic từ nồng độ đƣờng g/l đến 30 g/l Nồng độ đƣờng tăng hàm lƣợng axit đƣợc tổng hợp tăng Ở nồng độ đƣờng g/l, sau 48 nuôi cấy lƣợng axit tạo thành thấp 2,16 mg/ml, lƣợng đƣờng đƣa vào đáp ứng đủ nhu cầu dinh dƣỡng cacbon cho chủng sinh trƣởng phát triển sinh tổng hợp axit tốt Ở môi trƣờng MRS có nồng độ đƣờng 30 g/l sau 48 nuôi cấy, lƣợng axit tạo thành đạt giá trị cực đại 3,42 mg/ml, giảm lƣợng đƣờng xuống 20 g/l lƣợng axit tạo thành 3,28 mg/ml, tức tăng lƣợng nhỏ 4,09% thay đổi nồng độ đƣờng từ 20 g/l lên 30 g/l, điều không mang lại hiệu kinh tế, gây lãng phí, thất đƣờng hàm lƣơng axit thu đƣợc khơng cao Vì vậy, nồng độ đƣờng thích hợp cho sinh trƣởng, phát triển sinh tổng hợp axit lactic chủng vi khuẩn LT7 20 g/l 55 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu ta rút đƣợc kết luận: - Từ 11 chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ nguồn khác tuyển chọn đƣợc chủng C2 LT7 - Chủng C2 LT7 có khả sinh enzyme amylase, protease, cenlulase phân cắt chất tinh bột, Casein, CMC thành mono đơn giản để sử dụng trình lên men, có khả chống chịu pH thấp (2 – 4) chống chịu muối mật (0,5% - 3%) khảo sát, có khả đối kháng với vi sinh vật kiểm định (E.coli, Salmonella, Shigella), đề kháng với chất kháng sinh (Gentamycin, Streptomycin, Tetracycline) có khả bám dính vào tế bào niêm mạc ruột - Định danh đến loài chủng vi khuẩn LT7 loài Lactobacillus plantarum LT7 - Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy tới khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn LT7 + Nhiệt độ: 370C + pH: + Nguồn đƣờng: Glucose + Nồng độ đƣờng: 20 g/l + Hàm lƣợng axit lớn thu đƣợc 3,28 mg/ml 4.2 Kiến nghị Từ nghiên cứu này, bƣớc đầu đạt đƣợc thành việc tuyển chọn định tên đƣợc chủng vi khuẩn Lactic có hoạt tính probiotic ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn ni Tơi mong muốn đề tài cịn đƣợc tiếp tục phát triển thời gian tới để ứng dụng thực tế Dƣới dây số kiến nghị cho đề tài: 56 + Tiếp tục tuyển chọn định tên thêm chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi + Tiếp tục khảo sát thêm số điều kiện nuôi cấy để tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho chủng vi khuẩn LT7 sinh trƣởng phát triển + Tiếp tục tạo chế phẩm thử chế nghiệm hoạt tính chế phẩm chăn ni 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Lân Dũng dịch (1980), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học Trung học chuyên nghiệp Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972, 1976, 1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, tr 224-230 Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thuỳ Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn Lactic probiotic”,Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 251255, Hội Nhi khoa Tp Hồ Chí Minh (2007), “Bacillus clausii vai trò probiotics điều trị tiêu chảy”, Báo cáo hội thảo chuyên đề probiotic Lê Tấn Hƣng, Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phƣợng, Trƣơng Thị Hồng Vân., Võ Minh Sơn (2003), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic BIO II kết thử nghiệm ao nuôi tôm”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc năm 2003, pp 75 - 79 Trần Thị Ái Liên (2011),“Nghiên cứu đặc điểm vai trò Lactobacillus acidophilus chế phẩm probiotic,” Trƣờng ĐH Sƣ phạm Tp HCM, pp - 9, 39 - 40 Trần Trƣờng Nhân (2009), “Phân lập VK Bacillus subtilis từ phân heo đối kháng với E.coli ứng dụng sản xuất probiotic”, Luận văn tốt nghiệp ngành Kỹ sƣ Chăn nuôi - Thú y, Trƣờng ĐH Nông Lâm Tp HCM Đỗ Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Văn Thành, Nguyễn Hữu Hiệp (2014), “Định danh xác định số đặc tính sinh hóa dòng vi khuẩn lactic sản phẩm mắm chua cá sặc”, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ 10 Nguyễn Đức Quỳnh Nhƣ (2008), “Phân lập sàng lọc số chủng Bacillus có hoạt tính probiotic ni trồng thủy sản”, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp.HCM, pp - 11, 17 - 19 11 Lê Khắc Quảng (2004), “Công nghệ EM - Một giải pháp phịng bệnh cho gia cầm có hiệu quả”, Báo cáo chuyên đề khoa học 12 PGS.TS Lƣơng Đức Phẩm (2008), Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 112 -152 13 PGS.TS Lƣơng Đức Phẩm (2010), Giáo trình cơng nghệ lên men, NXB Giáo dục Việt Nam 14 Nguyễn Thị Thu Thảo (2007), “Sản xuất thử nghiệm hiệu chế phẩm probiotic phòng tiêu chảy sinh trưởng heo sau cai sữa (21 đến 58 ngày tuổi)”, Luận văn tốt nghiệp ngành Bác sĩ thú ý, Trƣờng Đại học Nông lâm Tp HCM 15 Bạch Quốc Thắng, Đỗ Ngọc Thúy, Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Thiện (2010) “Khảo sát số đặc tính vi khuẩn Lactobacillus điều kiện in vitro”, Khoa học Công nghệ kỹ thuật thú y – tập XVII – số 16 Lê Ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzym vi sinh vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật 17 Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành Vi sinh vật học Nxb Giáo dục 18 Trần Thị Thanh Thủy (2003), “Khảo sát tác dụng thay Kháng sinh probiotic phòng ngừa tiêu chảy E.coli heo con,” Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp, Trƣờng ĐH Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh, pp 21 - 24 , 28 - 43 19 Văn Thị Thủy (2011), “Phân lập chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra”, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên Tp HCM, tr 36, 52-54 20 Trần Linh Thƣớc (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm, Nxb Giáo dục 21 Trần Quốc Việt, Bùi Thị Thu Huyền, Dƣơng Văn Hợp Vũ Thanh Lam (2009) “Phân lập, tuyển chọn đánh giá đặc tính probiotic số chủng vi sinh vật hữu ích để sản xuất chế phẩm probiotic dùng chăn nuôi”, Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia - Hà Nội 22 Đào Thị Thanh Xuân (2008), “Nghiên cứu sử dụng nhóm VK Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trường nước nuôi thủy sản”, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội, tr 15-27, 32-35, 47-53 Tài liệu tiếng anh 23 Apajalahti J.H.A, L.K Sarkilabti, B.R.E Maki, J.P Heikkinen, P.H Nurminen and W.E Holben (1998), “Effective recovery of bacteria DNA and percent-guanine-plus-cytosin-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens”, Appl Environ Microbiol: 64, pp 4084 - 4088 24 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2004), Williams & Wilkins, pp 158-168 25 Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL (1994), “Lactobacillus acidophilus LA binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria”, Gut 35: 483 - 489 26 Czerucka D and Rampal P (2002), “Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheeal pathogens,” Microbes and infection, 4, pp 733 - 739 27 Dai D., Nanthkumar N N., Newburg D S and Walker W.A (2002), “Role of oligosaccharides and glycol conjugates in intestinal host defense”, J Pediatric Gastroenterol Nutr: 30, pp S23–S33 28 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics, Food London, Ontario, Canada: April 30 and May 1, 2002 29 Fuller R (1989), “Probiotics in man and animals,” J Appl Bacteriol, 66, , p pp 65–78 30 Glick B (1995), “The immune system of poultry”, Poultry Production P Hunton, ed Elsevier Science, Amsterdam: pp 55-62 31 Gong J, Forster R J., Yu H., Chamber J.R., Sabour P.M., Wheatcroft R and Chen S (2002), “Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen”, FEMS Microbiol Lett: 208, pp – 32 Havenaar R and J.H.J Huis in't Veld, (1992) “Probiotics: A General View In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease”, Wood, B.J.B (Ed.) Chapman and Hall, New York, USA., pp: 209-224 33 Hershberg R.M and L F Mayer (2000), “Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells – polarity and complexity”, Immunol Today 21: pp 123–128 34 Jensen H., Grimmer S., Naterstad, K., Axelsson, L (2012), “In vitro testing of commercial and potential probiotic Lactic acid bacteria”, Int J Food Microbiol : 153: 216-222 35 Kenneth H Wilson and Fulvio Perin2, (1998) “Role of Competition for Nutrients in Suppression of Clostridum dijificile by the Colonic Microflora” INFECTION AND IMMUNITY, Oct 1988, p 2610 – 2614 36 McCracken V J and R G Lorenz (2001), “The gastrointestinal ecosystem: Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota”, Cell Microbiol: 3, pp 1–11 37 Mishra, C and J Lambert, (1996) “Production of anti – microbial substances by probiotics” Asia Pacific J Clin Nutr 5, pp 20 – 24 38 Netherwood T, Gilbert H.J., Parker D.S and O’Donnell A.G (1999), “Probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract”, Appl Environ Microbiol: 65, pp 5134-5138 39 Nguyen Thi Hue Linh, Kentaro Sakai, Yousuke Taoka, (2017), “Screening of lactic acid bacteria isolated from fermented food as potential probiotics for aquacultured carp and amberjack”, Japanese Society of Fisheries Science 2017 40 Patterson J.A and Burkholder K.M (2003), “Application of prebiotics and probiotics in poultry production”, J Animal Science: 82, pp 627-631 41 Prieur, G., Nicolas, J.L., Plusquellee, A., Vigneulle M., (1990) “Interactions between bivalves mollscs and bacteria in the marine environment”.Oceanogr, Mả Biol Annu Rev 28, pp 227 – 352 42 Saeedi M, Shahidi F, Mortazavi SA, Milani E, Yazdi FT (2015) Isolation and identification of lactic acid bacteria in winter salad (Local Pickle) during fermentation using 16S rRNA gene sequence analysis J Food Saf 35:287–294 43 Saitou N, Nei M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol 4:406–425 44 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009), “Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam”, Int J Syst Evol Microbiol: 59, pp 550-554 45 Saurabh S., Choudhary AK and Sushma GS (2005), Concept of probiotics in aquaculture, Fishing Chimes 25 46 Todar, K Ph D (2008), Bacillus and related endospore-forming bacteria, Todar’s online textbook of bacteriology 47 Vural HC., Ozgun D (2011), “An improving DNA isolation method for identification of anaerobic bacteria in human colostrum and faeces samples”, J Med Genet Genom : 3:95–100 48 Zhu S.Y., Zhong T., Pandya Y and Joerger R D (2002), “16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens”, Appl Microbiol: 68, pp 124 – 137 PHỤ LỤC Bảng P1: Kết khảo sát khả chịu pH thấp chủng vi khuẩn Ký Thời gian hiệu xử lý (giờ) chủng LT7 C2 Mật độ tế bào sống sót mức pH khác pH=2 pH=3 pH=4 9 2,43 x 10 1,87 x 10 1,29 x 109 1,86 x 109 1,65 x 109 1,21 x 109 1,24 x 109 1,31 x 109 1,11 x 109 1,09 x 109 1,29 x 109 1,02 x 109 2,01 x 109 1,61 x 109 1,45 x 109 1,59 x 109 1,42 x 109 1,33 x 109 1,21 x 109 1,20 x 109 1,17 x 109 1,00 x 109 1,07 x 109 1,06 x 109 Bảng P2: Kết khảo sát khả chịu muối mật chủng vi khuẩn Ký hiệu Thời gian chủng xử lý (giờ) LT7 C2 Mật độ tế bào sống sót nồng độ muối mật khác 0,5% 1% 2% 2,45 x 109 2,21 x 109 2,27 x 109 1,44 x 109 2,21 x 109 1,84 x 109 1,62 x 109 0,97 x 109 2,31 x 109 1,69 x 109 1,55 x 109 0,84 x 109 2,39 x 109 1,47 x 109 1,23 x 109 0,61 x 109 2,11 x 109 2,09 x 109 1,99 x 109 2,01 x 109 1,89 x 109 1,74 x 109 1,51 x 109 1,51 x 109 1,99 x 109 1,61 x 109 1,38 x 109 1,03 x 109 2,01 x 109 1,27 x 109 1,05 x 109 0,82 x 109 Bảng P3 Kết thử nghiệm hoạt tính catalase 3% Bảng P4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến tạo thành axit lactic chủng LT7 Thời gian (giờ) Hàm lƣợng axit (mg/ml) 24 2,22 ± 0,034 36 2,38 ± 0,010 48 2,73 ± 0,024 Bảng P5 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến tạo thành axit lactic chủng LT7 Nhiệt độ (0C) 25 30 37 40 Hàm lƣợng axit (mg/ml) 2,16 ± 0,022 2,33 ± 0,016 2,83 ± 0,010 2,72 ± 0,014 Bảng P6 Ảnh hưởng pH môi trường đến tạo thành axit lactic chủng LT7 pH pH = pH = pH = pH = pH = Hàm lƣợng axit (mg/ml) 2,08 ± 0,014 2.86 ± 0,014 3,13 ± 0,012 2,72 ± 0,010 2,55 ± 0,016 Bảng P7 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến tạo thành axit lactic chủng vi khuẩn LT7 Saccharose Hàm lƣợng axit (mg/ml) 2,63 ± 0,016 Glucose 3,08 ± 0,016 Lactose 2,84 ± 0,016 Nguồn Cacbon Bảng P8 Ảnh hưởng nồng độ cacbon đến tạo thành axit lactic chủng LT7 Nồng độ cacbon (g/l) Hàm lƣợng axit (mg/ml) MRS1 MRS2 MRS3 MRS4 2,16 ± 0,020 2,76 ± 0,016 3,28 ± 0,010 3,42 ± 0,008 Ghi chú: MRS1: Môi trƣờng MRS bổ sung 0,5% - g/l đƣờng glucose MRS2: Môi trƣờng MRS bổ sung 1% - 10 g/l đƣờng gluose MRS3: Môi trƣờng MRS bổ sung 2% - 20 g/l đƣờng glucose MRS4: Môi trƣờng MRS bổ sung 3% - 30 g/l đƣờng gluose