Nghiên cứu tuyển chọn bacillus thuringiensis phòng trừ tuyến trùng trên cây cà chua

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƢỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN BACILLUS THURINGIENSIS KIỂM SOÁT TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY CÀ CHUA Lê Quang Trƣờng Đà Nẵng, năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH MƠI TRƢỜNG  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN BACILLUS THURINGIENSIS KIỂM SOÁT TUYẾN TRÙNG TRÊN CÂY CÀ CHUA Ngành: Cơng nghệ sinh học Khóa: 2016-2020 Sinh viên: Lê Quang Trƣờng Ngƣời hƣớng dẫn: Th.S Lê Thị Mai Đà Nẵng, năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng tơi Các số liệu kết khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả khóa luận Lê Quang Trƣờng i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu khoa học đƣợc đầu tƣ kỹ lƣỡng Đây cơng trình gặp phải nhiều vấn đề khó khăn, vấn đề khuất mắc q trình nghiên cứu tơi Tuy nhiên, thành đem lại xứng đáng đƣợc ghi nhận Tất thành không riêng nỗ lực trị chúng tơi mà giúp đỡ, ủng hộ mặt vật chất lẫn tinh thần từ gia đình, thầy bạn bè để tơi hồn thành tốt khóa luận Trƣớc hết, tơi xin chân thành cảm ơn ba mẹ, cảm ơn ngƣời giúp đỡ, động viên tôi, hậu phƣơng vững hỗ trợ tơi tập trung hồn thành tốt đề tài Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Lê Thị Mai, ngƣời tận tâm hỗ trợ, giúp đỡ tôi, động viên thực khóa luận Cảm ơn ln theo sát, truyền đạt kiến thức chuyên ngành, đƣa góp ý kinh nghiệm thực tiễn ngành nhƣ sống suốt thời gian vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô khoa Sinh – Môi trƣờng giúp đỡ, hỗ trợ tội suốt trình học tập bốn năm giảng đƣờng đại học, tạo điều kiện hội để sinh viên đƣợc học tập, rèn luyện tốt Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn thân thƣơng đến ngƣời bạn, ngƣời anh, ngƣời chị bạn sinh viên khóa dƣới ln đồng hành tôi, chia sẻ kiến thức hỗ trợ giúp đỡ lẫn trình nghiên cứu, học tập Tôi xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, tháng năm 2020 Sinh viên Lê Quang Trƣờng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG BIỂU .vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii TÓM TẮT ix MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chƣơng I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ BACILLUS THURINGIENSIS 1.1.1 Lịch sử phát Bacillus thuringiensis 1.1.2 Vị trí, đặc điểm hình thái sinh thái học Bacillus thuringiensis 1.1.3 Đặc điểm phân loại 1.1.4 Đặc điểm protein độc tố 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY CÀ CHUA 11 1.2.1 Cây cà chua 11 1.2.2 Một số bệnh cà chua 13 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA TUYẾN TRÙNG SẦN RỄ (MELOIDOGYNE SPP.) 14 1.3.1 Vị trí phân loại giống Meloidogyne 14 1.3.2 Đặc điểm sinh học, vòng đời tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 15 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 16 1.4.1 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis giới 16 1.4.2 Một số nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam 18 Chƣơng II ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 19 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 19 iii 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 19 2.3.2 Phƣơng pháp điều tra 20 2.3.3 Phƣơng pháp phân lập chủng Bacillus thuringiensis địa 20 2.3.4 Phƣơng pháp định danh sơ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 21 2.3.5 Phƣơng pháp ly trích nhân ni tuyến trùng Meloidogyne spp phịng thí nghiệm 23 2.3.6 Phƣơng pháp tuyển chọn vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả ức chế với tuyến trùng 24 2.3.7 Khả sản xuất hydro xyanua khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tuyển chọn 24 2.3.8 Định danh chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis đƣợc tuyển chọn kỹ thuật sinh học phân tử 25 2.3.9 Phƣơng pháp khảo sát nồng độ ức chế Bacillus thuringiensis tuyển chọn tuyến trùng Meloidogyne spp 25 2.3.10 Phƣơng pháp đánh hiệu phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp chủng Bacillus thuringiensis tuyển chọn điều kiện nhà lƣới 26 2.2.11 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 28 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS SPP TỪ CÁC MẪU ĐẤT TẠI LA HƢỜNG, TÚY LOAN 28 3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH LÝ, SINH HÓA CỦA VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP ĐƢỢC 30 3.3 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ẤU TRÙNG J2 CỦA TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP 31 3.4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO VÀ SẢN XUẤT HYDRO XYANUA CỦA CHỦNG M5 33 3.5 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS (M5) BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 34 3.6 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NỒNG ĐỘ BACILLUS THURINGIENSIS (M5) ỨC CHẾ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP 34 3.6.1 Kết khảo sát nồng độ Bacillus thuringiensis (M5) ức chế trứng tuyến trùng 34 iv 3.6.2 Kết khảo sát nồng độ Bacillus thuringiens (M5) diệt ấu trùng J2 Meloidogyne spp 36 3.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TUYỂN CHỌN TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƢỚI 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 50 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT B thuringiensis Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis PCR Polymerase Chain Reaction DNA Deoxyribonucleic acid rRNA ribosome Ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information KL Khuẩn lạc cs cộng CT công thức TNHH MTV Trách nhiệm hữu hạn thành viên vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Bảng 1.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Tên bảng Trang Các bệnh phổ biến vi sinh vật gây 13 cà chua Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm 28 sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 42oC Đặc điểm sinh hóa 02 chủng B thuringiensis 30 giả định Khả ức chế ấu trùng J2 02 chủng B 32 thuringiensis Khả sinh enzyme ngoại bào sản xuất 33 hydro xyanua chủng M5 Khảo sát nồng độ Bacillus thuringiensis (M5) ức 35 chế trứng tuyến trùng nở Khảo sát nồng độ Bacillus thuringiensis (M5) 36 diệt ấu trùng J2 Meloidogyne spp Ảnh hƣởng chủng Bacillus thuringiensis M5 38 ức chế hình thành u sƣng rễ cà chua vii DANH MỤC HÌNH ẢNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh bào tử tinh thể vi khuẩn B thuringiensis Hình 1.2 Tóm tắt phổ hoạt tính B thuringienis σ- endotoxins (Cry Cyt) Hình 1.3 Hình ảnh mơ tả cà chua 12 Hình 1.4 Hình ảnh tuyến trùng sần rễ lần đƣợc 15 cơng bố Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 20 Hình 2.2 Các cà chua thử nghiệm 26 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tinh thể 29 chủng M2 (100X) Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào tinh thể 30 chủng M5 (100X) Hình 3.3 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng B 32 thuringiensis đến ấu trùng J2 Hình 3.4 Đƣờng kính vịng phân giải chitin, protein 33 cellulose chủng M5 Hình 3.5 Kết tìm kiếm trình tự tƣơng đồng chủng 34 M5 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ Bacillus thuringiensis 35 (M5) ức chế trứng tuyến trùng Hình 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ Bacillus thuringiensis 37 (M5) tới khả diệt ấu trùng J2 Meloidogyne spp Hình 3.8 Ảnh hƣởng chủng Bacillus thuringiensis M5 ức chế hình thành u sƣng rễ cà chua viii 38 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nồng độ Bacillus thuringiensis (M5) tới khả diệt ấu trùng J2 Meloidogyne spp A Ấu trùng J2 xử lý Bacillus thuringiensis (M5) nồng độ 105; B Ấu trùng J2 xử lý Bacillus thuringiensis (M5) nồng độ 107; C Ấu trùng J2 xử lý Bacillus thuringiensis (M5) nồng độ 109; D Ấu trùng J2 nước cất Kết thí nghiệm trình bày bảng 3.6 hình 3.7 cho thấy chủng Bacillus thuringiensis (M5) đƣợc chọn tiêu diệt ấu trùng J2 tất nồng độ thử nghiệm (105, 107, 109 tế bào/ml) Tuy nhiên, nồng độ 109 tế bào/ml Bacillus thuringiensis (M5) khả diệt ấu trùng J2 cao nhất, đạt 100% sau 10 Có thay đổi lớn hình thái ruột ấu trùng J2 xử lý Bacillus thuringiensis (M5) nồng độ 109 Những thay đổi bao gồm hình thành cấu trúc giống nhƣ không bào tế bào ruột, co rút ruột tách khỏi thành thể, co thắt chặt điểm khác dọc theo ruột xuất thối hóa ruột Điều này, tƣơng đồng với báo cáo Marroquin L D cs (2000) 3.7 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS TUYỂN CHỌN TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƢỚI Tiến hành đánh giá khả ức chế tuyến trùng cà chua đƣợc bố trí theo thí nghiệm trình bày mục 2.3.10 Kết khảo sát đƣợc thể bảng 3.7 hình 3.8 37 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng chủng Bacillus thuringiensis (M5) ức chế hình thành u sƣng rễ cà chua Số nốt u sƣng Công thức CT1: không chủng trứng tuyến trùng CT2 (Đối chứng âm): trứng tuyến trùng 0,0c 35,84 ± 4,38a Meloidogyne spp CT3: 30ml Bt tuyển chọn + trứng tuyến trùng 14,93± 4,10b Meloidogyne spp CT4 (đối chứng dƣơng): 30ml chế phẩm Bt 13,33 ± 3,63b thị trƣờng + trứng tuyến trùng Meloidogyne spp Chú thích: chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p