1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic ứng dụng trong sản xuất men tiêu hoá cho vật nuôi

78 526 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 78
Dung lượng 3,52 MB

Nội dung

Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm men tiêu hó

Trang 1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIÊU HOÁ CHO VẬT NUÔI

Người hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm

Sinh viên thực hiện : Đỗ Phương Thảo

Hà Nội – 2016

Trang 2

Formatted: Font: 14 pt

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt ngiệp này

em đã nhận được rất nhiều sự hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ của thầy cô, gia

đình và bạn bè

Đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới PGS

TS Phạm Thị Tâm – phó trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường Viện

Đại học Mở Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em xin cảm ơn tới các thầy (cô) giáo trong khoa Công nghệ sinh học –

Viện ĐH Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và truyền đạt cho em nền

tảng kiến thức trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã

động viên, quan tâm góp ý và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng

như trong thời gian thực hiện khóa luận này

Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính

mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp

thu và hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Trang 3

Right + Not at 6.33"

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử và định nghĩa probiotic 3

1.1.1 Lịch sử probiotic 3

1.1.2 Định nghĩa probiotic 4

1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi 4

1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic 7

1.3.1 Vai trò của probiotic 7

1.3.2 Cơ chế tác động 8

1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 10

1.4.1 Lựa chọn các chủng probiotic 10

1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic 11

1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic 1211

1.4.4 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic 12

1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam 13

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới 13

1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam 15

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17

NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng 17

2.2 Nguyên liệu 17

2.2.1 Hóa chất 17

Formatted: Font: 19 pt Formatted: Line spacing: 1.5 lines Field Code Changed Formatted [1]

Formatted [2]

Formatted [3]

Formatted [4]

Formatted [5]

Formatted [6]

Formatted [7]

Formatted [8]

Formatted [9]

Formatted [10]

Formatted [11]

Formatted [12]

Formatted [13]

Formatted [14]

Formatted [15]

Formatted [16]

Formatted [17]

Formatted [18]

Formatted [19]

Formatted [20]

Formatted [21]

Formatted [22]

Formatted [23]

Trang 4

2.2.2 Máy móc và dụng cụ 17

2.2.3 Môi trường nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2221

2.3.1 Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 2221

2.3.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp 2221

2.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng 3028

2.3.2.1 Định tính axit lactic (đối với vi khuẩnLactobacillus sp.) 3028

2.3.3 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp 3130

2.3.4 Tạo chế phẩm men tiêu hóa 3231

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3735

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 3735

3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic 4542

3.2.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp có hoạt tính probiotic 4542

3.2.1.1 Đánh giá khả năng sản sinh axit 4542

3.2.1.2 Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin 4643

3.2.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillussubtiliscó hoạt tính probiotic 4845

3.2.2.1 Đánh giá khả năng sản sinh enzym 4845

3.3 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn 5148

3.3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactobacillus sp 5148

3.3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 5148

3.3.1.2 Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy 5249

3.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis 5350

Formatted [26]

Formatted [27]

Formatted [28]

Formatted [29]

Formatted [30]

Formatted [31]

Formatted [32]

Formatted [33]

Formatted [34]

Formatted [35]

Formatted [36]

Formatted [37]

Formatted [38]

Formatted [39]

Formatted [40]

Formatted [41]

Formatted [42]

Formatted [43]

Formatted [44]

Formatted [45]

Formatted [46]

Formatted [47]

Formatted [48]

Formatted [49]

Formatted [50]

Formatted [51]

Formatted [52]

Formatted [53]

Formatted [54]

Formatted [55]

Formatted [56]

Formatted [57]

Formatted [58]

Formatted [59]

Formatted [60]

Formatted [61]

Formatted [62]

Formatted [63]

Formatted [64]

Formatted [65]

Formatted [66]

Formatted [67]

Formatted [68]

Formatted [69]

Formatted [70]

Formatted [71]

Trang 5

Formatted: Font: 14 pt

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 5350

3.3.2.2 Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy 5451

3.4 Phát triển chế phẩm 5451

3.4.1 Kết quả về điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm men tiêu hóa 5451

3.4.2 Đánh giá hiệu quả của các chủngcó hoạt tính probiotic gà con 5552

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5956

1 Kết luận 5956

2 Kiến nghị 5956

TÀI LIỆU THAM KHẢO 6057

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Left

Trang 6

Right + Not at 6.33"

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm

đặc trưng của chúng 7

Bảng 1.2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic 12

lên vật chủ 12

Bảng 1.3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường 16

Bảng 1.1: Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn 3936

Bảng 3.2 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit 4643

Bảng 3.3: Số lượng chủng Bacillussubtiliscó khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất 4845

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng(Số lượng tế bào)của 4 chủng Lactobacillus sp 5148

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactobacillus sp. 5249

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của các chủng Bacillussubtilis 5350

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 5451

Bảng 3.8: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa vi khuẩn Lactobacillus sp 5552

Bảng 3.9: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa vi khuẩn Baccillus subtilis 5653

Bảng 3.10: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 5754

Formatted: Font: 16 pt

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Field Code Changed

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Normal, Line spacing: Multiple 1.3 li, Tab stops: Not at 6.1"

Formatted: Font: 14 pt, Do not check spelling

or grammar

Trang 7

Formatted: Font: 14 pt

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic 109

Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn Lactobacillus sp quan sát dưới kính hiển vi 4239

Hình 3.2: Kết quả thử catalase 4239

Hình 3.3: Kết quả thử Indole 4340

Hình 3.4: Kết quả phản ứng trên KIA 4340

Hình 3.5: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 4441

Hình 3.6: Kết quả thử catalase 4441

Hình 3.7: Kết quả phản ứng KIA 4441

Hình 3.8: Kết quả thử Indole 4542

Hình 3.9: Hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila của Lactobacillus sp. 4744

Hình 3.10: Hoạt tính kháng E.coli của Lactobacillus sp 4744

Hình 3.11: Hoạt tính xenlulaza của 1 số chủng Bacillus sutilis 4946

Hình 3.12: Hoạt tính amylaza của 1 số chủng Bacillus sutilis 4946

Hình 3.13: Hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticuscủa Bacillus subtilis 5047

Hình 3.14: Hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila của Bacillus subtilis. 5047

Hình 3.15: Hoạt tính kháng E.Colicủa Bacillus subtilis 5047

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp 4744

Biểu đồ 3.2: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của 4946

vi khuẩn Bacillus subtilis 4946

Formatted: Centered, Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [72]

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [73]

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [74]

Formatted [75]

Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: 11 pt, Not Bold Formatted [76]

Formatted: Font: 14 pt Formatted [77] Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Left

Trang 8

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Formatted: Font: 16 pt, Bold

Formatted: Font: 4 pt, Bold

Trang 9

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết

Ngành chăn nuôi không đóng vai trò then chốt trong nền kinh tế toàn

cầu nhưng lại có nhiều ý nghĩa về chính trị - xã hội Nó chiếm 40% tổng sản

phẩm trong ngành nông nghiệp, giải quyết việc làm cho hơn 1,3 tỉ người lao

động và sinh kế của hơn 1 tỉ người dân song ở các nước nghèo Đối với nước

ta chăn nuôi là một trong hai lĩnh vực kinh tế quan trọng trong ngành nông

nghiệp Thức ăn là yếu tố quan trọng nhất giúp tăng năng suất vật nuôi

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu

hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được

coi là một giải pháp rất hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất

phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng

các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn

đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng các biện

pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân

bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ

đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước

quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi

khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm Biện pháp

cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử

dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn

chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước

thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

-Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh

ngày càng trở thành cấp bách Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện

nay là probiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật

Formatted: Font: 16 pt Formatted: Top: 1.16"

Trang 10

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường

ruột theo hướng có lợi cho vật chủ

Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :

“Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic ứng

dụng trong sản xuất chế phẩm men tiêu hóa cho vật nuôi”

Mục tiêu

- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic

- Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng thu được để sử dụng làm

thức ăn chăn nuôi

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn 1 số chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic

- Tuyển chọn các chủng có hoạt tính probiotic

- Khảo sát các điều kiện thích hợp cho khả năng sinh trưởng của các

chủng vi sinh vật thu được

- Đánh giá hoạt tính probiotic của bộ chủng trên vật nuôi

- Đánh giá hiệu quả của các chủng tuyển chọn trên gà con

Formatted: Justified

Trang 11

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

PHẦN 1 – TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử và định nghĩa probiotic

1.1.1 Lịch sử probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry

Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của

những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ

Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [28]

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã

chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố

của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của

những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên

tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản

phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc

sống” – The Prolongation of life (1908)[28]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề

xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp

theo về probiotic[23]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi

khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh Cùng năm đó, các nhà

nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng

làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát

hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình

tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh

dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được[23] Sau đó 5

Formatted: Font: 16 pt

Trang 12

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là

hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung

probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên

men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập

niên 80[28]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc

Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những

nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như

vật nuôi

1.1.2 Định nghĩa probiotic

Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống” Thuật ngữ

probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ

“những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller,

1989) Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ

những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật

thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật

chủ Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa

thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy

đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:

(i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn

giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi

cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi

sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ

đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”

1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe

của vật nuôi

Trang 13

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai

trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể Do đó, nó là hệ

thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm

nhiễm Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các

phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh

Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại

các tác nhân gây bệnh

Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô

trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở

thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001) Theo

thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước

uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không

ngừng tăng lên Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của

vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng

(Fonty, 1995) Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của

đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày

đơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 cfu/ml chất

chứa tương ứng) (Jans, 2005)[26]

Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý

của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật Các yếu tố này chịu tác động

của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau Trong số các

nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một

biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ

vi sinh vật (Conway, 1994)[16] Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong

đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái

mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian

rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005)

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Trang 14

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi

sinh vật ruột Theo Jans(2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh

vật ruột được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài

vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides,

Eubacteria ); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus

và E coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như

Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… [26]Một quần thể vi sinh vật

được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và

0,01% tương ứng Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01

được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có

lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ) Ở trạng thái “eubiosis”, vật

chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính,

dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ

mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh

dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi

sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ Thức ăn là nền

dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần,

thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý đều làm

tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột Khi quan hệ cân bằng của

hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái

“chung sống có hại”) Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường

là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu

chảy, viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong

bảng 1.1) Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi,

một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một

số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng Tuy nhiên,

việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát

đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm

Trang 15

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi

khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi Hiện nay, khối liên minh châu Âu

(EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích

sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006 Để vượt qua những thách thức đó,

đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh

nhưng an toàn với vật nuôi Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic

Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm

đặc trưng của chúng Trạng thái Eubiosis

- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ

vi sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh

- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu

hóa chống lại các vi sinh vật xâm

- Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và

hệ vi sinh vật đường ruột

- Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làm cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng

- Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chất độc…)

- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4,

H2S, CO2)

- Làm yếu hệ thống miễn dịch

- Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều năng lượng

1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic

1.3.1 Vai trò của probiotic

Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong

thức ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là

Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn

thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt Trên cơ sở các kết

quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng

có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh

sau[30]:

Formatted: Level 5, Space Before: 0 pt

Trang 16

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có

lợi cho vật chủ

- Tăng cường khả năng miễn dịch

- Giảm phản ứng viêm

- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B

- Tăng hấp thu chất khoáng

- Làm giảm cholesterol huyết thanh

- Làm tăng năng suất vật nuôi

- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi

trường Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ

không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức

khỏe người tiêu dùng

1.3.2 Cơ chế tác động

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần

lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại

trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006)[10]

Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1.1

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi

sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là

cạnh tranh vị trí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong

ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Trang 17

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

khác như E coli, Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces

cereviese; S.boulardii) không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác

mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông

qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở

niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002) Tuy nhiên, cạnh tranh dinh

dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng

lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các

loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển[17]

Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh

các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng

như một số axit hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn

có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996)

vi sinh vật gây bệnh các chất dinh dưỡng quan trọng

Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm

Trang 18

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

cảm trên bề mặt ruột,

độc tố được loại trừ

vào niêm mạc và các thụ cảm trên ruột và phá hủy chúng

dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh

Hình 1.1: Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic

1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic

1.4.1 Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an

toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh

(colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này

được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được

các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ

yếu sau:

Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn

được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan

trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức

chế vi khuẩn gây bệnh như E.coli, Aeromonas hydrophila., Vibrio

parahaemolyticus Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế

Trang 19

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề

mặt

+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

• Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và

dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym

tiêu hoá (amylaza, proteaza, lysozym…) Các chủng vi sinh vật được coi như

là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này Hiện nay các công ty

đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng

khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày

• Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu

hoá của động vật dao động 1-3% [5] Để tồn tại và phát triển, các chủng

probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%,

ngoài ra một số chủng probiotic (Bacillus subtilis và Lactobacillussp.) có khả

năng sinh enzym tiêu hoá như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và

phytaza có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh

dưỡng của vật chủ

1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic

 Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và

Bifidobacterium.

Các loài thuộc chi Lactobacillus: L acidophilus, L amylovorus, L

brevis, L casei, L casei subsp rhamnosus (Lactobacillus GG), L caucasicus,

L crispatus, L delbrueckii subsp bulgaricus (L bulgaricus), L fermentum

(L fermenti), L gasseri.

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B adolescentis, B bifidum, B

breve, B infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum

Formatted: Indent: First line: 0.5", Tab stops: 0.75", Left

Trang 20

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

 Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic

Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium,

Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae.

Tôi lựa chọn 2 Chủng vi khuẩn làBacillus subtilis và Lactobacillus

sp nghiên cứu và tạo chế phẩm

1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic

Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu

phát triển chế phẩm là Bacillus subtilis và Lactobacillus sp Vai trò cũng như

cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau, cụ thể có trong bảng sau:

Bảng 1.2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic

- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu quả hấp

thu chất dinh dưỡng

- Sinh enzym phân giải các cơ chất như tinh bột, xenluloza;

kích thích tiêu hoá

Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau

1.4.4 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic

Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn

nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia

Formatted: Indent: First line: 0.5"

Formatted: Condensed by 0.1 pt

Formatted: Level 5

Trang 21

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

súc, gia cầm Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với

con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật Điều này cho thấy là

yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật

nuôi, con người và môi trường Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm

từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các

bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và các phản ứng phụ Ngoài ra cần có những

thông số phân tích sinh hoá về máu và đánh giá chỉ số coliform trong phân

Đối với con người không cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng

cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt (Arturo et al, 2006)

Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và

động vật, không mang gen lạ Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có

nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được

khuyến cáo sử dụng Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển

chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì

các chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên

phân loại đến chi và loài Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu

Âu đã lập một Uỷ ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific

committee for animal nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối

với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ

thuật online ((SCAN, 2000)

Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần

được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo

tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế Quy trình sản xuất phải theo tiêu

chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices)

1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam

1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic

trên thế giới

Trang 22

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên

của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng

việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự

phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003)[29] Những

nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người

và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen và ctv (1998);

Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và ctv (2000) đã cho thấy nếu như

trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở

gà là Ruminococcus và Streptococcus Apajialahti và ctv (1998); Gong và ctv

(2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay

đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở

động vật dưới tác động của probiotic Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố

nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng

của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và

ctv, 2003)

Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác

nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic

còn rất hạn chế Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động

vật có ý nghĩa rất quan trọng Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách

sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi

(các axit béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính

ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson

và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C Knight và cs, 2009)

Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy

có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở

lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức

ăn ) Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ

Trang 23

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và ctv, 1995):

không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung

trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo;

Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết

quả nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế

phẩm probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó

có đầy đủ các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của

probiotic có thể là nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính

1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm

probiotic ở Việt nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời

sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu

được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Lê Thanh Bình và ctv

(1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi

thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi

theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm

gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99 Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày

tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối

chứng 10,6% Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã phân lập được hai trong số

789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu

sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156

có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus

salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở

môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với

Salmonella , E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong

chăn nuôi Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng

Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm

probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương

Formatted: Indent: First line: 0.5"

Trang 24

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức

106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella Nguyễn La Anh và

ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải

muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất

probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch

(từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng

cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và

ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II

Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm

men Sacharomyces phối hợp với các enzym α-amylaza và proteaza dùng

trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn

nuôi Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm

BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Bảng 1.3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có

mặt trên thị trường

Sản phẩm Nước sản xuất

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)

Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men

Trang 25

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

- Các chủng vi sinh vật hoạt tính probiotic phân lập từ các nguồn khác nhau

trong tự nhiên như :đất, các thực phẩm lên men…

- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Aeromonas hydrophila, Vibrio

parahaemolyticustừ phòng vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học –Viện Đại học

Mở Hà Nội

2.2 Nguyên liệu

2.2.1 Hóa chất

Glucoza; MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton;

cao nấm men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I2 và các hóa chất khác của

hãng Merck, Sigma…

2.2.2 Máy móc và dụng cụ

Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại phòng Vi sinh Khoa Công

nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội Bao gồm:

- Dụng cụ: ống nghiệm, bông thấm cồn, đĩa petri, đầu côn, ống

eppendorf, que cấy, đèn cồn ,dụng cụ dùng để nhuộm gram, kính hiển vi đĩa

petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy

tinh, ống đong, nhiệt kế, que trang, buồng đếm Neubauer, giá để ống

nghiệm, Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm phải dược sấy

Formatted: Justified, Indent: First line: 0.5"

Formatted: Indent: First line: 0.5"

Trang 26

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Bảng 1.14: Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)

Nồi hấp vô trùng Nhật

Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)

Máy li tâm Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)

Máy đo OD UV/VIS Spectrophotomater ( Nhật Bản)

2.2.3 Môi trường nghiên cứu

Môi trường LB(Luria Betarni) lỏng:

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Trang 27

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút Thạch 15,0

Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3

Môi trường thạch thường (g/l):

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Trang 28

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Trang 29

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 21

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Đun nóng để hòa tan Agar, hấp khử trùng ở121oC, 1 atm, 15 phút, pH cuối

Trang 30

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 22

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp.và

Bacillus subtilis

2.3.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp

Phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.từ các mẫu chất chứa trong đường

tiêu hóa, nước dưa chua các nguồn khác nhau trong tự nhiên được tiến hành theo

quy trình sau:

- Bước 1: Xử lý mẫu

Các mẫu từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, nước dưa chua các

nguồn khác nhau trong tự thu được từ các mẫu bệnh phẩm bằng các dụng cụ thí

nghiệm vô trùng Hút lấy dịch mẫu trong dung dịch nước muối 0,9% Mix đều

bằng máy vortex thu được dịch xử lý mẫu

- Bước 2: Tăng sinh sơ bộ

Lấy 1ml dịch xử lý mẫu bổ sung vào 9ml môi trường MRS đã hấp vô trùng

Nuôi lắc ở 37ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ

- Bước 3: Phân lập trên môi trường nuôi cấy chọn lọc MRS

Thu dịch sau tăng sinh sơ bộ, tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số nhân 10-1,

10-2, 10-3, .10-7 Lấy 100µl mỗi dịch pha loãng cấy chang đều lên bề mặt môi

trường MRS trên đĩa petri Nuôi trong tủ ấm 37ºC trong vòng 24 giờ

Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái giống của vi khuẩn Lactobacillus sp

trên môi trường MRS (khuẩn lạc hình tròn, bóng,màu trắng sữa có vùng trong suốt

xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong)) Nhuộm Gram các chủng vi

khuẩn lựa chọn, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hình thái giống với chủng vi

khuẩn Lactobacillus sp.: Là trực khuẩn, gram dương, tế bào có dạng hình que,

không có khả năng di động, không sinh bào tử, kích thước tế bào 0,7 - 1,0 µm; 3,0 -

8,0 µm Sau đó tiến hành ria thuần những chủng được tuyển chọn trên môi trường

MRS, nuôi trong tủ ấm 37 trong vòng 24h

Formatted: Level 3, Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Trang 31

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 23

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Tiến hành cấy ria riêng rẽ các chủng vi khuẩn lựa chọn trên môi trường MRS agar

- Bước 4: Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn

tuyển chọn

Tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa bao gồm: thử nghiệm khả năng

di động, thử nghiệm catalase, khả năng sử dụng các loại đường (glucose, lactose),

thử nghiệm khả năng sinh gas, sinh H2S, khả năng sinh indol, thử genlatin, thử khả

năng dung huyết

- Bước 5: Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi

khuẩnLactobacillus sp

Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus sp là có khả năng

lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose Tinh bột thì không

lên men, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính,

có khả năng đồng tính Cacborhydrat đặc biệt là xyloza, tích tụ 1,3% axit Không

tạo được nitrit từ nitrate Và dựa vào kết quả sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã

tuyển chọn, ta sẽ chọn ra được chủng vi khuẩn Lactobacillus sp

- Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Chuẩn bị ống eppendorf mới, glyxerol và môi trường MRS lỏng rồi đem

hấp vô trùng, hấp xong cho ngay vào tủ cấy vô trùng và để nguội Lấy 600 l

môi trường MRS lỏng vào trong ống eppendorf mới, tiếp tục lấy que cấy đầu

tròn lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf Mỗi một chủng vi khuẩn ta lên giữ

khoảng 2- 5 ống eppendorf Sau đó, đem nuôi lắc ở 28ºC, 150 vòng/ phút trong

vòng 24 giờ

Sau khi nuôi lắc xong, bổ sung khoảng 400 l glyxeron vào trong từng ống

eppendorf Mix đều bằng máy vortex Sau đó, giống vi khuẩn được bảo quản ở

nhiệt độ -20ºC

Formatted: Condensed by 0.4 pt

Trang 32

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 24

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các

nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước

vô trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi

trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí Nuôi ở

370C trong 48 giờ Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần

khiết các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng

trong) Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng Mỗi

mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới

kính hiển vi

 Phương pháp sinh lý, sinh hóa

Nhuộm gram

Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc

phân loại vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với

tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào

Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính

thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất

màu Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin

hay đỏ tía với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong

peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào

4 Rửa nước tối đa 5 giây

5 Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Trang 33

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 25

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

6 Rửa bằng rượu trong 10 giây

7 Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài

lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút)

Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn

Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu

8 Rửa nước

9 Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ

thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu

nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay

đỏ tía (fuchsin) Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất

10 Rửa qua nước Để khô, soi kính

- Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA: sử dụng môi trường tổng

hợp KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi trường, rồi đổ ra các ống nghiệm

vô trùng 15ml/ống, để tạo ống thạch nghiêng sao cho phần thạch nghiêng bằng 2

lần phần thạch đứng Vi khuẩn được lấy từ đĩa thạch MRS agar bằng que cấy vô

trùng, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy kéo một đường từ dưới lên

và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 28ºC,

sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận kết quả:

• Khả năng sử dụng đường: Vi khuẩn không sử dụng glucose và lactose

có cả ống thạch không chuyển màu, vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường là glucose

và lactose có cả ống thạch chuyển sang màu vàng, vi khuẩn chỉ sử dụng glucose

không sử dụng lactose có phần đáy ống ngiệm chuyển vàng phần thạch ngiêng có

màu đỏ

• Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ làm ống thạch

chuyển màu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt hay chì có trong môi trường

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49"

Trang 34

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 26

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

• Khả năng sinh gas: Vi khuẩn sinh gas sẽ tạo bọt khí đẩy lên làm tách

thạch, vỡ thạch

- Phản ứng thử khả năng sinh Indol: môi trường sử dụng cho phản ứng là

môi trường tryptone waster Môi trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi

khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường, nuôi ở nhiệt độ

28°C Sau 24 giờ đem ra đọc kết quả bằng thuốc thử Kovac’s Trước khi bổ sung

thuốc thử, bổ sung 1ml xylen vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách Indol lên lớp

dung môi hữu cơ Những vi khuẩn có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa axit amin

tryptophan tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol khi nhỏ thuốc thử vào, nó sẽ phản

ứng với thuốc thử tạo một phức chất dạng quynone màu đỏ, cho kết quả dương tính

với indol, những kết quả ngược lại, không tạo phức chất cơ kết quả âm tính

- Phản ứng thử khả năng sinh enzym catalase: vi khuẩn lấy từ môi trường

thạch, đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30% Quan sát 1-2 phút, kết quả là

dương tính với thuốc thử, khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 với vi khuẩn hiếu khí

và sinh enzym catalase Nếu vi khuẩn là kị khí hoặc không sinh enzym này thì sẽ

cho kết quả âm tính, không có hiện tượng sủi bọt khí

2.3.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Phân lập chủng vi khuẩnBacillus subtilistừ các mẫu đất ở các nơi khác nhau

trong tự nhiên được tiến hành theo quy trình sau:

- Bước 1: Lấy mẫu

Chọn những ruộng lúa, ruộng trồng lạc, ruộng rau có đất màu mỡ Dùng dao gạt

bỏ 10 – 15cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20gram đất cho vào túi nilon vô trùng

- Bước 2: Xử lý mẫu

Cho nước muối sinh lý 0.9% vào từng mẫu đất, nghiền đều sau đó hút 1ml

đem ủ ở bể ủ nhiệt 80oC/20’

Formatted: Condensed by 0.3 pt

Trang 35

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 27

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

- Bước 3: Phân lập trên môi trường TSA

Dịch xử lý mẫu tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số nhân 10-1, 10-2, 10-3,

10-7 Lấy 100µl mỗi dịch pha loãng cấy chang đều lên bề mặt môi trường TSA

trên đĩa petri Nuôi trong tủ ấm 30ºC trong vòng 24 giờ

Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái giống của vi khuẩn Bacillus subtilis

trên môi trường TSA (khuẩn lạc hơi xám hoặc trắng, rìa răng cưa không đều)

Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn lựa chọn, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hình

thái giống với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis: Gram dương, hình que thẳng, kích

thước 0,5-0,8 x 1,5-3 µm Sau đó tiến hành ria thuần những chủng được tuyển chọn

trên môi trường TSA, nuôi trong tủ ấm 30 trong vòng 24h

Tiến hành cấy ria riêng rẽ các chủng vi khuẩn lựa chọn trên môi trường TSA agar

- Bước 4:Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa bao gồm: thử nghiệm catalase,

khả năng sử dụng các loại đường (glucose, lactose), thử nghiệm khả năng sinh gas,

sinh H2S, khả năng sinh indol, thử khả năng phân giải casein, tinh bột, gelatin

- Bước 5: Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis

Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis là có khả năng

sử dụng đường glucose, không có khả năng sinh indole, phản ứng catalase, có khả

năng phân giải casein, tinh bột và gelatin Và dựa vào kết quả sinh hóa của các

chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, ta sẽ chọn ra được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

- Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn

Trang 36

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 28

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Chuẩn bị ống eppendorf mới, glyxerol và môi trường LB lỏng rồi đem hấp

vô trùng, hấp xong cho ngay vào tủ cấy vô trùng và để nguội Lấy 500 l môi

trường LB vào trong ống eppendorf mới, tiếp tục lấy que cấy đầu tròn lấy khuẩn

lạc cho vào ống eppendorf Mỗi một chủng vi khuẩn ta lên giữ khoảng 2- 5 ống

eppendorf Sau đó, đem nuôi lắc ở 30ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ

Sau khi nuôi lắc xong, bổ sung khoảng 500 l glyxerol vào trong từng ống

eppendorf Mix đều bằng máy vortex Sau đó, giống vi khuẩn được bảo quản ở

nhiệt độ -20ºC

 Phương pháp sinh lý, sinh hóa[5]

- Phản ứng thử khả năng sinh enzym catalase

Vi khuẩn lấy từ môi trường thạch, đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30%

Quan sát 1-2 phút, kết quả là dương tính với thuốc thử, khi có hiện tượng sủi bọt

khí do O2 với vi khuẩn hiếu khí và sinh enzym catalase Nếu vi khuẩn là kị khí

hoặc không sinh enzym này thì sẽ cho kết quả âm tính, không có hiện tượng sủi bọt khí

- Phản ứng thử khả năng sinh Indole

Môi trường sử dụng cho phản ứng là môi trường tryptone waster Môi

trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy

vi khuẩn cấy vào môi trường, nuôi lắc ở nhiệt độ 30°C Sau 24 giờ đem ra đọc kết

quả bằng thuốc thử Kovac’s Trước khi bổ sung thuốc thử, bổ sung 1ml xylen vào

ống nghiệm, lắc đều để chiết tách Indol lên lớp dung môi hữu cơ Những vi khuẩn

có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa axit amin tryptophan tạo nên các sản phẩm

chứa gốc indol khi nhỏ thuốc thử vào, nó sẽ phản ứng với thuốc thử tạo một phức

chất dạng quynone màu đỏ, cho kết quả dương tính với indol, những kết quả ngược

lại, không tạo phức chất cơ kết quả âm tính

- Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA

Formatted: Justified, Space After: 0 pt

Formatted: Condensed by 0.3 pt

Trang 37

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 29

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

Sử dụng môi trường tổng hợp KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi

trường, rồi đổ ra các ống nghiệm vô trùng 15ml/ống, để tạo ống thạch nghiêng sao

cho phần thạch nghiêng bằng 2 lần phần thạch đứng Vi khuẩn được lấy từ đĩa

thạch TSA bằng que cấy vô trùng, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy

kéo một đường từ dưới lên và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi

vi khuẩn ở nhiệt độ 30ºC, sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận kết quả:

Khả năng sử dụng đường: Vi khuẩn không sử dụng glucose và lactose có cả

ống thạch không chuyển màu, vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường là glucose và

lactose có cả ống thạch chuyển sang màu vàng, vi khuẩn chỉ sử dụng glucose

không sử dụng lactose có phần đáy ống ngiệm chuyển vàng phần thạch ngiêng có

màu đỏ

Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ làm ống thạch chuyển

màu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt hay chì có trong môi trường

Khả năng sinh gas: Vi khuẩn sinh gas sẽ taọ bọt khí đẩy lên làm tách thạch, vỡ thạch

- Thử nghiệm gelatinase

Môi trường sử dụng là môi trường LB rắn bổ sung 1% gelatin Hấp vô trùng

rồi đổ ra đĩa petri Cấy chấm điểm vi khuẩn lên môi trường nuôi ở 30oC Sau 24h

đọc kết quả kết quả bằng thuốc thử Lugol Kết quả là dương tính khi xung quanh

khuẩn lạc có vòng phân giải, ngược lại không xuất hiện vòng là âm tính

- Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột

Môi trường sử dụng là môi trường LB bổ sung 1% CMC Tiến hành cấy

chấm điểm một lượng sinh khối chủng thuần vào đĩa môi trường; ủ ở nhiệt độ 30oC

trong 24h Sau đó nhỏ vào đĩa dung dịch Lygol, để trong vài phút và quan sát

Kết quả: vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột (+) xung quanh khuẩn lạc

sẽ tạo vòng phân giải tinh bột trong rõ trong khi môi trường có màu nâu của Lygol

Kết quả (-) khi xung quanh khuẩn lạc không tạo vòng phân giải

Formatted: Condensed by 0.2 pt

Trang 38

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 30

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

2.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng

2.3.2.1 Định tính axit lactic (đối với vi khuẩnLactobacillus sp.)

Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp

đục lỗ thạch Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập

được ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong Nhỏ phần dịch trong vào các

giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Khả năng sinh

axit của các chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong

phân giải CaCO3[5]

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

2.3.2.2 Định lượng số lượng bào tử vi khuẩnBacillus subtilis và Lactobacillus sp

 Vi khuẩn Bacillus subtilis

Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng

cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các

ống nước muối Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống

nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta

được nồng độ pha loãng, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ

pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng

liên tiếp thích hợp Dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên

môi trường đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa

TSA ở 37 oC trong 24 h Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên

đĩa[5]

 Vi khuẩn Lactobacillus sp

Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng

cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các

Formatted: Condensed by 0.3 pt

Formatted: Justified

Formatted: Justified

Trang 39

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 31

Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"

ống nước muối Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống

nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta

được nồng độ pha loãng, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ

pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng

liên tiếp thích hợp Dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên

môi trường đĩa MRS (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để

đĩa MRS ở 37 oC trong 48 h Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành

trên đĩa

2.3.2.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ Phương

pháp như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã

chứa vi khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch

Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 40C trong 6

giờ, sau đó mang các đĩa thạch để 370C Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo

thành Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng

đường kính vòng kháng khuẩn ∆D

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)

d: đường kính lỗ thạch (mm)

2.3.2.4 Xác định hoạt tính enzym

Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch Phương

pháp như sau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ

trên đĩa Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ dịch

enzym vào các lỗ đã đục, để ở 370C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử

Lugol để vòng phân giải cơ chất hiện rõ Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường

kính vòng ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch

2.3.3 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp

2.3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật

Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Level 3, Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Ngày đăng: 01/09/2016, 08:37

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w