Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic ứng dụng trong sản xuất chế phẩm men tiêu hó
Trang 1VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIÊU HOÁ CHO VẬT NUÔI
Người hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện : Đỗ Phương Thảo
Hà Nội – 2016
Trang 2Formatted: Font: 14 pt
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt ngiệp này
em đã nhận được rất nhiều sự hướng dẫn, giúp đỡ và chia sẻ của thầy cô, gia
đình và bạn bè
Đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng sâu sắc tới PGS
TS Phạm Thị Tâm – phó trưởng khoa Công Nghệ Sinh Học – Trường Viện
Đại học Mở Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp
đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này
Em xin cảm ơn tới các thầy (cô) giáo trong khoa Công nghệ sinh học –
Viện ĐH Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và truyền đạt cho em nền
tảng kiến thức trong suốt quá trình học tập
Cuối cùng, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã
động viên, quan tâm góp ý và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập cũng
như trong thời gian thực hiện khóa luận này
Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính
mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp
thu và hoàn thiện
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016
Trang 3Right + Not at 6.33"
MỤC LỤC
MỤC LỤC 1
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1 – TỔNG QUAN 3
1.1 Lịch sử và định nghĩa probiotic 3
1.1.1 Lịch sử probiotic 3
1.1.2 Định nghĩa probiotic 4
1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi 4
1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic 7
1.3.1 Vai trò của probiotic 7
1.3.2 Cơ chế tác động 8
1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic 10
1.4.1 Lựa chọn các chủng probiotic 10
1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic 11
1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic 1211
1.4.4 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic 12
1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam 13
1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới 13
1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam 15
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17
NGHIÊN CỨU 17
2.1 Đối tượng 17
2.2 Nguyên liệu 17
2.2.1 Hóa chất 17
Formatted: Font: 19 pt Formatted: Line spacing: 1.5 lines Field Code Changed Formatted [1]
Formatted [2]
Formatted [3]
Formatted [4]
Formatted [5]
Formatted [6]
Formatted [7]
Formatted [8]
Formatted [9]
Formatted [10]
Formatted [11]
Formatted [12]
Formatted [13]
Formatted [14]
Formatted [15]
Formatted [16]
Formatted [17]
Formatted [18]
Formatted [19]
Formatted [20]
Formatted [21]
Formatted [22]
Formatted [23]
Trang 42.2.2 Máy móc và dụng cụ 17
2.2.3 Môi trường nghiên cứu 18
2.3 Phương pháp nghiên cứu 2221
2.3.1 Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 2221
2.3.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp 2221
2.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng 3028
2.3.2.1 Định tính axit lactic (đối với vi khuẩnLactobacillus sp.) 3028
2.3.3 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp 3130
2.3.4 Tạo chế phẩm men tiêu hóa 3231
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3735
3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 3735
3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic 4542
3.2.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp có hoạt tính probiotic 4542
3.2.1.1 Đánh giá khả năng sản sinh axit 4542
3.2.1.2 Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin 4643
3.2.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillussubtiliscó hoạt tính probiotic 4845
3.2.2.1 Đánh giá khả năng sản sinh enzym 4845
3.3 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được lựa chọn 5148
3.3.1 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactobacillus sp 5148
3.3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 5148
3.3.1.2 Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy 5249
3.3.2 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis 5350
Formatted [26]
Formatted [27]
Formatted [28]
Formatted [29]
Formatted [30]
Formatted [31]
Formatted [32]
Formatted [33]
Formatted [34]
Formatted [35]
Formatted [36]
Formatted [37]
Formatted [38]
Formatted [39]
Formatted [40]
Formatted [41]
Formatted [42]
Formatted [43]
Formatted [44]
Formatted [45]
Formatted [46]
Formatted [47]
Formatted [48]
Formatted [49]
Formatted [50]
Formatted [51]
Formatted [52]
Formatted [53]
Formatted [54]
Formatted [55]
Formatted [56]
Formatted [57]
Formatted [58]
Formatted [59]
Formatted [60]
Formatted [61]
Formatted [62]
Formatted [63]
Formatted [64]
Formatted [65]
Formatted [66]
Formatted [67]
Formatted [68]
Formatted [69]
Formatted [70]
Formatted [71]
Trang 5Formatted: Font: 14 pt
3.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 5350
3.3.2.2 Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy 5451
3.4 Phát triển chế phẩm 5451
3.4.1 Kết quả về điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm men tiêu hóa 5451
3.4.2 Đánh giá hiệu quả của các chủngcó hoạt tính probiotic gà con 5552
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5956
1 Kết luận 5956
2 Kiến nghị 5956
TÀI LIỆU THAM KHẢO 6057
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Left
Trang 6Right + Not at 6.33"
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm
đặc trưng của chúng 7
Bảng 1.2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic 12
lên vật chủ 12
Bảng 1.3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường 16
Bảng 1.1: Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu 18
Bảng 3.1: Kết quả phân lập vi khuẩn 3936
Bảng 3.2 Số lượng chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axit 4643
Bảng 3.3: Số lượng chủng Bacillussubtiliscó khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải cơ chất 4845
Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng(Số lượng tế bào)của 4 chủng Lactobacillus sp 5148
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactobacillus sp. 5249
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của các chủng Bacillussubtilis 5350
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có nồng độ muối mật khác nhau đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn Bacillus 5451
Bảng 3.8: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa vi khuẩn Lactobacillus sp 5552
Bảng 3.9: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa vi khuẩn Baccillus subtilis 5653
Bảng 3.10: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa Lactobacillus sp và Bacillus subtilis 5754
Formatted: Font: 16 pt
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Field Code Changed
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Normal, Line spacing: Multiple 1.3 li, Tab stops: Not at 6.1"
Formatted: Font: 14 pt, Do not check spelling
or grammar
Trang 7Formatted: Font: 14 pt
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic 109
Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn Lactobacillus sp quan sát dưới kính hiển vi 4239
Hình 3.2: Kết quả thử catalase 4239
Hình 3.3: Kết quả thử Indole 4340
Hình 3.4: Kết quả phản ứng trên KIA 4340
Hình 3.5: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi 4441
Hình 3.6: Kết quả thử catalase 4441
Hình 3.7: Kết quả phản ứng KIA 4441
Hình 3.8: Kết quả thử Indole 4542
Hình 3.9: Hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila của Lactobacillus sp. 4744
Hình 3.10: Hoạt tính kháng E.coli của Lactobacillus sp 4744
Hình 3.11: Hoạt tính xenlulaza của 1 số chủng Bacillus sutilis 4946
Hình 3.12: Hoạt tính amylaza của 1 số chủng Bacillus sutilis 4946
Hình 3.13: Hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticuscủa Bacillus subtilis 5047
Hình 3.14: Hoạt tính kháng Aeromonas hydrophila của Bacillus subtilis. 5047
Hình 3.15: Hoạt tính kháng E.Colicủa Bacillus subtilis 5047
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp 4744
Biểu đồ 3.2: Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn kiểm định của 4946
vi khuẩn Bacillus subtilis 4946
Formatted: Centered, Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [72]
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [73]
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted [74]
Formatted [75]
Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: 11 pt, Not Bold Formatted [76]
Formatted: Font: 14 pt Formatted [77] Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Font: 14 pt Formatted: Left
Trang 8DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Formatted: Font: 16 pt, Bold
Formatted: Font: 4 pt, Bold
Trang 9Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết
Ngành chăn nuôi không đóng vai trò then chốt trong nền kinh tế toàn
cầu nhưng lại có nhiều ý nghĩa về chính trị - xã hội Nó chiếm 40% tổng sản
phẩm trong ngành nông nghiệp, giải quyết việc làm cho hơn 1,3 tỉ người lao
động và sinh kế của hơn 1 tỉ người dân song ở các nước nghèo Đối với nước
ta chăn nuôi là một trong hai lĩnh vực kinh tế quan trọng trong ngành nông
nghiệp Thức ăn là yếu tố quan trọng nhất giúp tăng năng suất vật nuôi
Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu
hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được
coi là một giải pháp rất hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất
phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng
các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn
đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu Bởi vậy, việc sử dụng các biện
pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân
bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ
đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước
quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi
khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm Biện pháp
cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử
dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước
thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
-Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh
ngày càng trở thành cấp bách Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện
nay là probiotic Probiotic - theo Fuller (1992)- là chất bổ sung vi sinh vật
Formatted: Font: 16 pt Formatted: Top: 1.16"
Trang 10Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường
ruột theo hướng có lợi cho vật chủ
Xuất phát từ tình hình thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài :
“Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic ứng
dụng trong sản xuất chế phẩm men tiêu hóa cho vật nuôi”
Mục tiêu
- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic
- Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng thu được để sử dụng làm
thức ăn chăn nuôi
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn 1 số chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic
- Tuyển chọn các chủng có hoạt tính probiotic
- Khảo sát các điều kiện thích hợp cho khả năng sinh trưởng của các
chủng vi sinh vật thu được
- Đánh giá hoạt tính probiotic của bộ chủng trên vật nuôi
- Đánh giá hiệu quả của các chủng tuyển chọn trên gà con
Formatted: Justified
Trang 11Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
PHẦN 1 – TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử và định nghĩa probiotic
1.1.1 Lịch sử probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry
Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của
những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ
Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [28]
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã
chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố
của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của
những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên
tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản
phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc
sống” – The Prolongation of life (1908)[28]
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề
xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về probiotic[23]
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi
khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh Cùng năm đó, các nhà
nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng
làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát
hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình
tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh
dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được[23] Sau đó 5
Formatted: Font: 16 pt
Trang 12Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là
hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung
probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên
men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập
niên 80[28]
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc
Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những
nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như
vật nuôi
1.1.2 Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống” Thuật ngữ
probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ
“những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller,
1989) Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ
những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật
thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật
chủ Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa
thống nhất Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy
đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
(i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn
giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi
cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi
sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ
đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”
1.2 Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe
của vật nuôi
Trang 13Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai
trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể Do đó, nó là hệ
thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm
nhiễm Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các
phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh
Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại
các tác nhân gây bệnh
Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô
trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở
thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001) Theo
thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước
uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không
ngừng tăng lên Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của
vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng
(Fonty, 1995) Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của
đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày
đơn rất khác nhau (khoảng 101-103; 101-104; 105-108 và 109-1012 cfu/ml chất
chứa tương ứng) (Jans, 2005)[26]
Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý
của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật Các yếu tố này chịu tác động
của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau Trong số các
nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một
biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ
vi sinh vật (Conway, 1994)[16] Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong
đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái
mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian
rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005)
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Trang 14Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi
sinh vật ruột Theo Jans(2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh
vật ruột được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài
vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides,
Eubacteria ); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus
và E coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như
Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… [26]Một quần thể vi sinh vật
được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và
0,01% tương ứng Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01
được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có
lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ) Ở trạng thái “eubiosis”, vật
chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính,
dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ
mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh
dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi
sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ Thức ăn là nền
dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần,
thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý đều làm
tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột Khi quan hệ cân bằng của
hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái
“chung sống có hại”) Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường
là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu
chảy, viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong
bảng 1.1) Để cải thiện quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột ở vật nuôi,
một phương pháp thường được áp dụng là bổ sung vào khẩu phần thức ăn một
số loại kháng sinh liều thấp như những chất kích thích sinh trưởng Tuy nhiên,
việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi một cách không có kiểm soát
đã và đang gây ra những hậu quả đáng lo ngại về vệ sinh an toàn thực phẩm
Trang 15Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi
khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi Hiện nay, khối liên minh châu Âu
(EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích
sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006 Để vượt qua những thách thức đó,
đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh
nhưng an toàn với vật nuôi Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic
Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm
đặc trưng của chúng Trạng thái Eubiosis
- Sự cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ
vi sinh vật đường ruột – Sự cộng sinh
- Sự bảo vệ bề mặt của đường tiêu
hóa chống lại các vi sinh vật xâm
- Sự không cùng tồn tại giữa vật chủ và
hệ vi sinh vật đường ruột
- Sự phá hủy biểu mô đường ruột, làm cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm sự hấp thụ các chất dinh dưỡng
- Sinh ra các cơ chất gây độc (NH3, chất độc…)
- Phân hủy, tăng sản sinh khí gas (CH4,
H2S, CO2)
- Làm yếu hệ thống miễn dịch
- Làm tăng chu trình tế bào, cần nhiều năng lượng
1.3 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic
1.3.1 Vai trò của probiotic
Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong
thức ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là
Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn
thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt Trên cơ sở các kết
quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) đã tổng kết các ảnh hưởng
có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh
sau[30]:
Formatted: Level 5, Space Before: 0 pt
Trang 16Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có
lợi cho vật chủ
- Tăng cường khả năng miễn dịch
- Giảm phản ứng viêm
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh
- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi
- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B
- Tăng hấp thu chất khoáng
- Làm giảm cholesterol huyết thanh
- Làm tăng năng suất vật nuôi
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải
Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi
trường Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ
không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức
khỏe người tiêu dùng
1.3.2 Cơ chế tác động
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần
lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại
trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006)[10]
Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1.1
Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi
sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là
cạnh tranh vị trí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong
ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Trang 17Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
khác như E coli, Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces
cereviese; S.boulardii) không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác
mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông
qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở
niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002) Tuy nhiên, cạnh tranh dinh
dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng
lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các
loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển[17]
Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh
các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng
như một số axit hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn
có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996)
vi sinh vật gây bệnh các chất dinh dưỡng quan trọng
Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm
Trang 18Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
cảm trên bề mặt ruột,
độc tố được loại trừ
vào niêm mạc và các thụ cảm trên ruột và phá hủy chúng
dính và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh
Hình 1.1: Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic
1.4 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic
1.4.1 Lựa chọn các chủng probiotic
Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an
toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và chiếm lĩnh
(colonization) trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này
được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được
các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic
Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ
yếu sau:
Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn
được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan
trọng nhất trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức
chế vi khuẩn gây bệnh như E.coli, Aeromonas hydrophila., Vibrio
parahaemolyticus Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế
Trang 19Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề
mặt
+ Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh
• Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và
dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym
tiêu hoá (amylaza, proteaza, lysozym…) Các chủng vi sinh vật được coi như
là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này Hiện nay các công ty
đã khuyến cáo dùng vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng
khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày
• Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu
hoá của động vật dao động 1-3% [5] Để tồn tại và phát triển, các chủng
probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%,
ngoài ra một số chủng probiotic (Bacillus subtilis và Lactobacillussp.) có khả
năng sinh enzym tiêu hoá như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và
phytaza có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh
dưỡng của vật chủ
1.4.2 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic
Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và
Bifidobacterium.
Các loài thuộc chi Lactobacillus: L acidophilus, L amylovorus, L
brevis, L casei, L casei subsp rhamnosus (Lactobacillus GG), L caucasicus,
L crispatus, L delbrueckii subsp bulgaricus (L bulgaricus), L fermentum
(L fermenti), L gasseri.
Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B adolescentis, B bifidum, B
breve, B infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum
Formatted: Indent: First line: 0.5", Tab stops: 0.75", Left
Trang 20Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic
Lactobacillus và Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium,
Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae.
Tôi lựa chọn 2 Chủng vi khuẩn làBacillus subtilis và Lactobacillus
sp nghiên cứu và tạo chế phẩm
1.4.3 Công thức chế phẩm probiotic
Như đã trình bày ở phần 1.4.2 có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu
phát triển chế phẩm là Bacillus subtilis và Lactobacillus sp Vai trò cũng như
cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau, cụ thể có trong bảng sau:
Bảng 1.2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic
- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu quả hấp
thu chất dinh dưỡng
- Sinh enzym phân giải các cơ chất như tinh bột, xenluloza;
kích thích tiêu hoá
Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau
1.4.4 Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic
Việc nghiên cứu, phát triển chế phẩm probiotic và sử dụng trong chăn
nuôi bắt đầu từ khâu nghiên cứu sản xuất và tiêu thụ, sử dụng trên đàn gia
Formatted: Indent: First line: 0.5"
Formatted: Condensed by 0.1 pt
Formatted: Level 5
Trang 21Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
súc, gia cầm Như vậy các chủng vi sinh vật đã qua nhiều khâu tiếp xúc với
con người, môi trường trước khi vào cơ thể động vật Điều này cho thấy là
yêu cầu an toàn đối với chủng vi sinh vật là vấn đề quan trọng nhất đối với vật
nuôi, con người và môi trường Đối với động vật cần có thời gian thử nghiệm
từ 1-3 tháng, kiểm tra các chỉ tiêu tăng trọng, phản ứng cơ thể, theo dõi các
bệnh tiêu hoá, bệnh nhiếm khuẩn và các phản ứng phụ Ngoài ra cần có những
thông số phân tích sinh hoá về máu và đánh giá chỉ số coliform trong phân
Đối với con người không cần thiết phải thử nghiệm như trên động vật nhưng
cần chú ý các phản ứng phụ như dị ứng với da, mũi, mắt (Arturo et al, 2006)
Với môi trường cần đảm bảo là vi sinh vật không có hại đối với con người và
động vật, không mang gen lạ Nói chung các chủng vi sinh vật probiotic có
nguồn gốc tự nhiên (từ hệ vi sinh vật đường ruột vật nuôi) là các chủng được
khuyến cáo sử dụng Tổ chức FAO (2002) đưa ra hướng dẫn với việc tuyển
chọn các chủng probiotic, ngoài các đặc tính probiotic và đảm bảo an toàn thì
các chủng này phải được cụ thể hoá các thông tin về nguồn gốc chủng, tên
phân loại đến chi và loài Đối với vấn đề an toàn probiotic, cộng đồng Châu
Âu đã lập một Uỷ ban khoa học về dinh dưỡng động vật (SCAN: scientific
committee for animal nutrition) đưa ra những quy định đánh giá an toàn đối
với sản phẩm và những khuyến cáo cho vấn đề này qua các điều luật và kỹ
thuật online ((SCAN, 2000)
Tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các chủng probiotic không những cần
được phân loại chính xác mà còn phải được cung cấp và lưu giữ tại các bảo
tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế Quy trình sản xuất phải theo tiêu
chuẩn GMP (Good Manufacturing Practices)
1.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam
1.5.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic
trên thế giới
Trang 22Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Việc sử dụng thực phẩm có probiotic (hoặc như 1 thành phần tự nhiên
của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng
việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự
phát triển từ những năm 80 của thể kỷ 20 (Patterson và ctv, 2003)[29] Những
nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người
và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen và ctv (1998);
Apajalahti và ctv (1998); Vander Wielen và ctv (2000) đã cho thấy nếu như
trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở
gà là Ruminococcus và Streptococcus Apajialahti và ctv (1998); Gong và ctv
(2002); Zhu và ctv (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay
đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở
động vật dưới tác động của probiotic Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố
nào góp phần tạo nên 1 hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng
của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson và
ctv, 2003)
Những ảnh hưởng có lợi của probiotic thể hiện ở nhiều khía cạnh khác
nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của probiotic
còn rất hạn chế Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của probiotic trong việc
ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động
vật có ý nghĩa rất quan trọng Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách
sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi
(các axit béo bay hơi, các chất giống kháng sinh ), cạnh tranh vị trí bám dính
ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson
và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C Knight và cs, 2009)
Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy
có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở
lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức
ăn ) Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ
Trang 23Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và ctv, 1995):
không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung
trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo;
Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết
quả nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế
phẩm probiotic tạo nên các đáp ứng tích cực ở gia súc và gia cầm chỉ khi nó
có đầy đủ các đặc tính probiotic, sự thiếu một hoặc nhiều các đặc tính của
probiotic có thể là nguyên nhân chủ yếu của các đáp ứng âm tính
1.5.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm
probiotic ở Việt nam
Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời
sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu
được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Lê Thanh Bình và ctv
(1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi
thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi
theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm
gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99 Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày
tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối
chứng 10,6% Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) đã phân lập được hai trong số
789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu
sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156
có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus
salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở
môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với
Salmonella , E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong
chăn nuôi Nguyễn Thị Hồng Hà và ctv (2003) đã sử dụng hai chủng
Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm
probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương
Formatted: Indent: First line: 0.5"
Trang 24Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức
106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella Nguyễn La Anh và
ctv (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải
muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất
probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch
(từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng
cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và
ctv (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II
Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm
men Sacharomyces phối hợp với các enzym α-amylaza và proteaza dùng
trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn
nuôi Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm
BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao
Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:
Bảng 1.3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có
mặt trên thị trường
Sản phẩm Nước sản xuất
Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)
Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men
Trang 25Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng
- Các chủng vi sinh vật hoạt tính probiotic phân lập từ các nguồn khác nhau
trong tự nhiên như :đất, các thực phẩm lên men…
- Các vi sinh vật kiểm định: E.coli, Aeromonas hydrophila, Vibrio
parahaemolyticustừ phòng vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học –Viện Đại học
Mở Hà Nội
2.2 Nguyên liệu
2.2.1 Hóa chất
Glucoza; MgSO4.7H2O; NaCl; K2HPO4; CaCO3; FeCl3.6H2O; Pepton;
cao nấm men; cao malt; Tween 80; cao thịt; KI; I2 và các hóa chất khác của
hãng Merck, Sigma…
2.2.2 Máy móc và dụng cụ
Các máy móc, dụng cụ được sử dụng có tại phòng Vi sinh Khoa Công
nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội Bao gồm:
- Dụng cụ: ống nghiệm, bông thấm cồn, đĩa petri, đầu côn, ống
eppendorf, que cấy, đèn cồn ,dụng cụ dùng để nhuộm gram, kính hiển vi đĩa
petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, bacher, micropipette, đũa khuấy thủy
tinh, ống đong, nhiệt kế, que trang, buồng đếm Neubauer, giá để ống
nghiệm, Tất cả các dụng cụ thủy tinh dùng trong thí nghiệm phải dược sấy
Formatted: Justified, Indent: First line: 0.5"
Formatted: Indent: First line: 0.5"
Trang 26Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Bảng 1.14: Thiết bị chính dùng trong nghiên cứu
Tủ cấy vô trùng Sanyo (Nhật)
Nồi hấp vô trùng Nhật
Máy lắc Gyromax 737R Amerex Instrument (Đức)
Máy li tâm Mictocentriguge- Sorvall (Mỹ)
Máy đo OD UV/VIS Spectrophotomater ( Nhật Bản)
2.2.3 Môi trường nghiên cứu
Môi trường LB(Luria Betarni) lỏng:
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Trang 27Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
pH= 7,0; khử trùng ở 121oC/15 phút Thạch 15,0
Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO3
Môi trường thạch thường (g/l):
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Trang 28Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Trang 29Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 21
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Đun nóng để hòa tan Agar, hấp khử trùng ở121oC, 1 atm, 15 phút, pH cuối
Trang 30Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 22
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp.và
Bacillus subtilis
2.3.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus sp
Phân lập chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.từ các mẫu chất chứa trong đường
tiêu hóa, nước dưa chua các nguồn khác nhau trong tự nhiên được tiến hành theo
quy trình sau:
- Bước 1: Xử lý mẫu
Các mẫu từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, nước dưa chua các
nguồn khác nhau trong tự thu được từ các mẫu bệnh phẩm bằng các dụng cụ thí
nghiệm vô trùng Hút lấy dịch mẫu trong dung dịch nước muối 0,9% Mix đều
bằng máy vortex thu được dịch xử lý mẫu
- Bước 2: Tăng sinh sơ bộ
Lấy 1ml dịch xử lý mẫu bổ sung vào 9ml môi trường MRS đã hấp vô trùng
Nuôi lắc ở 37ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ
- Bước 3: Phân lập trên môi trường nuôi cấy chọn lọc MRS
Thu dịch sau tăng sinh sơ bộ, tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số nhân 10-1,
10-2, 10-3, .10-7 Lấy 100µl mỗi dịch pha loãng cấy chang đều lên bề mặt môi
trường MRS trên đĩa petri Nuôi trong tủ ấm 37ºC trong vòng 24 giờ
Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái giống của vi khuẩn Lactobacillus sp
trên môi trường MRS (khuẩn lạc hình tròn, bóng,màu trắng sữa có vùng trong suốt
xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng trong)) Nhuộm Gram các chủng vi
khuẩn lựa chọn, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hình thái giống với chủng vi
khuẩn Lactobacillus sp.: Là trực khuẩn, gram dương, tế bào có dạng hình que,
không có khả năng di động, không sinh bào tử, kích thước tế bào 0,7 - 1,0 µm; 3,0 -
8,0 µm Sau đó tiến hành ria thuần những chủng được tuyển chọn trên môi trường
MRS, nuôi trong tủ ấm 37 trong vòng 24h
Formatted: Level 3, Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Trang 31Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 23
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Tiến hành cấy ria riêng rẽ các chủng vi khuẩn lựa chọn trên môi trường MRS agar
- Bước 4: Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn
Tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa bao gồm: thử nghiệm khả năng
di động, thử nghiệm catalase, khả năng sử dụng các loại đường (glucose, lactose),
thử nghiệm khả năng sinh gas, sinh H2S, khả năng sinh indol, thử genlatin, thử khả
năng dung huyết
- Bước 5: Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi
khuẩnLactobacillus sp
Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus sp là có khả năng
lên men glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và lactose Tinh bột thì không
lên men, không có khả năng di động, không sinh bào tử, phản ứng catalaza âm tính,
có khả năng đồng tính Cacborhydrat đặc biệt là xyloza, tích tụ 1,3% axit Không
tạo được nitrit từ nitrate Và dựa vào kết quả sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã
tuyển chọn, ta sẽ chọn ra được chủng vi khuẩn Lactobacillus sp
- Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Chuẩn bị ống eppendorf mới, glyxerol và môi trường MRS lỏng rồi đem
hấp vô trùng, hấp xong cho ngay vào tủ cấy vô trùng và để nguội Lấy 600 l
môi trường MRS lỏng vào trong ống eppendorf mới, tiếp tục lấy que cấy đầu
tròn lấy khuẩn lạc cho vào ống eppendorf Mỗi một chủng vi khuẩn ta lên giữ
khoảng 2- 5 ống eppendorf Sau đó, đem nuôi lắc ở 28ºC, 150 vòng/ phút trong
vòng 24 giờ
Sau khi nuôi lắc xong, bổ sung khoảng 400 l glyxeron vào trong từng ống
eppendorf Mix đều bằng máy vortex Sau đó, giống vi khuẩn được bảo quản ở
nhiệt độ -20ºC
Formatted: Condensed by 0.4 pt
Trang 32Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 24
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Để phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu chất chứa trong đường tiêu hóa, các
nguồn khác nhau trong tự nhiên, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu bằng nước
vô trùng, cấy gạt dịch pha loãng ở nồng độ 10-3 và 10-5 trên đĩa Petri chứa môi
trường MRS, sau đó phủ tiếp 1 lớp thạch mỏng để tạo điều kiện kị khí Nuôi ở
370C trong 48 giờ Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa Petri, tách và thuần
khiết các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh (axit phân giải CaCO3 tạo vòng
trong) Bảo quản giống trong ống nghiệm môi trường MRS thạch nghiêng Mỗi
mẫu phân lập chọn các khuẩn lạc có hình thái khác nhau và quan sát tế bào dưới
kính hiển vi
Phương pháp sinh lý, sinh hóa
Nhuộm gram
Nguyên tắc: Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc
phân loại vi khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với
tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào
Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính
thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất
màu Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin
hay đỏ tía với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong
peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào
4 Rửa nước tối đa 5 giây
5 Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Trang 33Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 25
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
6 Rửa bằng rượu trong 10 giây
7 Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài
lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút)
Dung dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, vi khuẩn
Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mất màu
8 Rửa nước
9 Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ
thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu
nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin) hay
đỏ tía (fuchsin) Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất
10 Rửa qua nước Để khô, soi kính
- Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA: sử dụng môi trường tổng
hợp KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi trường, rồi đổ ra các ống nghiệm
vô trùng 15ml/ống, để tạo ống thạch nghiêng sao cho phần thạch nghiêng bằng 2
lần phần thạch đứng Vi khuẩn được lấy từ đĩa thạch MRS agar bằng que cấy vô
trùng, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy kéo một đường từ dưới lên
và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ 28ºC,
sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận kết quả:
• Khả năng sử dụng đường: Vi khuẩn không sử dụng glucose và lactose
có cả ống thạch không chuyển màu, vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường là glucose
và lactose có cả ống thạch chuyển sang màu vàng, vi khuẩn chỉ sử dụng glucose
không sử dụng lactose có phần đáy ống ngiệm chuyển vàng phần thạch ngiêng có
màu đỏ
• Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ làm ống thạch
chuyển màu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt hay chì có trong môi trường
Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.49"
Trang 34Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 26
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
• Khả năng sinh gas: Vi khuẩn sinh gas sẽ tạo bọt khí đẩy lên làm tách
thạch, vỡ thạch
- Phản ứng thử khả năng sinh Indol: môi trường sử dụng cho phản ứng là
môi trường tryptone waster Môi trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi
khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường, nuôi ở nhiệt độ
28°C Sau 24 giờ đem ra đọc kết quả bằng thuốc thử Kovac’s Trước khi bổ sung
thuốc thử, bổ sung 1ml xylen vào ống nghiệm, lắc đều để chiết tách Indol lên lớp
dung môi hữu cơ Những vi khuẩn có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa axit amin
tryptophan tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol khi nhỏ thuốc thử vào, nó sẽ phản
ứng với thuốc thử tạo một phức chất dạng quynone màu đỏ, cho kết quả dương tính
với indol, những kết quả ngược lại, không tạo phức chất cơ kết quả âm tính
- Phản ứng thử khả năng sinh enzym catalase: vi khuẩn lấy từ môi trường
thạch, đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30% Quan sát 1-2 phút, kết quả là
dương tính với thuốc thử, khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 với vi khuẩn hiếu khí
và sinh enzym catalase Nếu vi khuẩn là kị khí hoặc không sinh enzym này thì sẽ
cho kết quả âm tính, không có hiện tượng sủi bọt khí
2.3.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis
Phân lập chủng vi khuẩnBacillus subtilistừ các mẫu đất ở các nơi khác nhau
trong tự nhiên được tiến hành theo quy trình sau:
- Bước 1: Lấy mẫu
Chọn những ruộng lúa, ruộng trồng lạc, ruộng rau có đất màu mỡ Dùng dao gạt
bỏ 10 – 15cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20gram đất cho vào túi nilon vô trùng
- Bước 2: Xử lý mẫu
Cho nước muối sinh lý 0.9% vào từng mẫu đất, nghiền đều sau đó hút 1ml
đem ủ ở bể ủ nhiệt 80oC/20’
Formatted: Condensed by 0.3 pt
Trang 35Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 27
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
- Bước 3: Phân lập trên môi trường TSA
Dịch xử lý mẫu tiến hành pha loãng mẫu theo hệ số nhân 10-1, 10-2, 10-3,
10-7 Lấy 100µl mỗi dịch pha loãng cấy chang đều lên bề mặt môi trường TSA
trên đĩa petri Nuôi trong tủ ấm 30ºC trong vòng 24 giờ
Chọn lọc những khuẩn lạc có hình thái giống của vi khuẩn Bacillus subtilis
trên môi trường TSA (khuẩn lạc hơi xám hoặc trắng, rìa răng cưa không đều)
Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn lựa chọn, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hình
thái giống với chủng vi khuẩn Bacillus subtilis: Gram dương, hình que thẳng, kích
thước 0,5-0,8 x 1,5-3 µm Sau đó tiến hành ria thuần những chủng được tuyển chọn
trên môi trường TSA, nuôi trong tủ ấm 30 trong vòng 24h
Tiến hành cấy ria riêng rẽ các chủng vi khuẩn lựa chọn trên môi trường TSA agar
- Bước 4:Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Tiến hành thử nghiệm các phản ứng sinh hóa bao gồm: thử nghiệm catalase,
khả năng sử dụng các loại đường (glucose, lactose), thử nghiệm khả năng sinh gas,
sinh H2S, khả năng sinh indol, thử khả năng phân giải casein, tinh bột, gelatin
- Bước 5: Dựa vào các kết quả sinh hóa tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis
Dựa vào các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis là có khả năng
sử dụng đường glucose, không có khả năng sinh indole, phản ứng catalase, có khả
năng phân giải casein, tinh bột và gelatin Và dựa vào kết quả sinh hóa của các
chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, ta sẽ chọn ra được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis
- Bước 6: Tiến hành giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Trang 36Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 28
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Chuẩn bị ống eppendorf mới, glyxerol và môi trường LB lỏng rồi đem hấp
vô trùng, hấp xong cho ngay vào tủ cấy vô trùng và để nguội Lấy 500 l môi
trường LB vào trong ống eppendorf mới, tiếp tục lấy que cấy đầu tròn lấy khuẩn
lạc cho vào ống eppendorf Mỗi một chủng vi khuẩn ta lên giữ khoảng 2- 5 ống
eppendorf Sau đó, đem nuôi lắc ở 30ºC, 150 vòng/ phút trong vòng 24 giờ
Sau khi nuôi lắc xong, bổ sung khoảng 500 l glyxerol vào trong từng ống
eppendorf Mix đều bằng máy vortex Sau đó, giống vi khuẩn được bảo quản ở
nhiệt độ -20ºC
Phương pháp sinh lý, sinh hóa[5]
- Phản ứng thử khả năng sinh enzym catalase
Vi khuẩn lấy từ môi trường thạch, đặt lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30%
Quan sát 1-2 phút, kết quả là dương tính với thuốc thử, khi có hiện tượng sủi bọt
khí do O2 với vi khuẩn hiếu khí và sinh enzym catalase Nếu vi khuẩn là kị khí
hoặc không sinh enzym này thì sẽ cho kết quả âm tính, không có hiện tượng sủi bọt khí
- Phản ứng thử khả năng sinh Indole
Môi trường sử dụng cho phản ứng là môi trường tryptone waster Môi
trường được tiệt trùng để nguội và tăng sinh vi khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy
vi khuẩn cấy vào môi trường, nuôi lắc ở nhiệt độ 30°C Sau 24 giờ đem ra đọc kết
quả bằng thuốc thử Kovac’s Trước khi bổ sung thuốc thử, bổ sung 1ml xylen vào
ống nghiệm, lắc đều để chiết tách Indol lên lớp dung môi hữu cơ Những vi khuẩn
có hệ enzym tryptophanase sẽ oxi hóa axit amin tryptophan tạo nên các sản phẩm
chứa gốc indol khi nhỏ thuốc thử vào, nó sẽ phản ứng với thuốc thử tạo một phức
chất dạng quynone màu đỏ, cho kết quả dương tính với indol, những kết quả ngược
lại, không tạo phức chất cơ kết quả âm tính
- Phản ứng lên men đường trong môi trường KIA
Formatted: Justified, Space After: 0 pt
Formatted: Condensed by 0.3 pt
Trang 37Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 29
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
Sử dụng môi trường tổng hợp KIA (Kligler Iron Agar) Hấp tiệt trùng môi
trường, rồi đổ ra các ống nghiệm vô trùng 15ml/ống, để tạo ống thạch nghiêng sao
cho phần thạch nghiêng bằng 2 lần phần thạch đứng Vi khuẩn được lấy từ đĩa
thạch TSA bằng que cấy vô trùng, cấy ria lên bề mặt thạch nghiêng, dùng que cấy
kéo một đường từ dưới lên và cấy đâm sâu vào phần môi trường thạch đứng Nuôi
vi khuẩn ở nhiệt độ 30ºC, sau 24h đem ra đọc kết quả Ghi nhận kết quả:
Khả năng sử dụng đường: Vi khuẩn không sử dụng glucose và lactose có cả
ống thạch không chuyển màu, vi khuẩn sử dụng cả hai loại đường là glucose và
lactose có cả ống thạch chuyển sang màu vàng, vi khuẩn chỉ sử dụng glucose
không sử dụng lactose có phần đáy ống ngiệm chuyển vàng phần thạch ngiêng có
màu đỏ
Khả năng sinh H2S: Vi khuẩn có khả năng sinh H2S sẽ làm ống thạch chuyển
màu đen do H2S tạo kết tủa với ion sắt hay chì có trong môi trường
Khả năng sinh gas: Vi khuẩn sinh gas sẽ taọ bọt khí đẩy lên làm tách thạch, vỡ thạch
- Thử nghiệm gelatinase
Môi trường sử dụng là môi trường LB rắn bổ sung 1% gelatin Hấp vô trùng
rồi đổ ra đĩa petri Cấy chấm điểm vi khuẩn lên môi trường nuôi ở 30oC Sau 24h
đọc kết quả kết quả bằng thuốc thử Lugol Kết quả là dương tính khi xung quanh
khuẩn lạc có vòng phân giải, ngược lại không xuất hiện vòng là âm tính
- Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột
Môi trường sử dụng là môi trường LB bổ sung 1% CMC Tiến hành cấy
chấm điểm một lượng sinh khối chủng thuần vào đĩa môi trường; ủ ở nhiệt độ 30oC
trong 24h Sau đó nhỏ vào đĩa dung dịch Lygol, để trong vài phút và quan sát
Kết quả: vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột (+) xung quanh khuẩn lạc
sẽ tạo vòng phân giải tinh bột trong rõ trong khi môi trường có màu nâu của Lygol
Kết quả (-) khi xung quanh khuẩn lạc không tạo vòng phân giải
Formatted: Condensed by 0.2 pt
Trang 38Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 30
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
2.3.2 Các phương pháp định tính và định lượng
2.3.2.1 Định tính axit lactic (đối với vi khuẩnLactobacillus sp.)
Đánh giá khả năng sinh axit của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp
đục lỗ thạch Phương pháp như sau: lấy phần dịch nuôi cấy các chủng phân lập
được ly tâm lạnh 12000 vòng/phút lấy dịch trong Nhỏ phần dịch trong vào các
giếng trên đĩa thạch đã có CaCO3, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Khả năng sinh
axit của các chủng vi khuẩn được tính đánh giá thông qua đường kính vòng trong
phân giải CaCO3[5]
∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng trong phân giải CaCO3 (mm)
d: đường kính lỗ thạch (mm)
2.3.2.2 Định lượng số lượng bào tử vi khuẩnBacillus subtilis và Lactobacillus sp
Vi khuẩn Bacillus subtilis
Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng
cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các
ống nước muối Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống
nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta
được nồng độ pha loãng, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ
pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng
liên tiếp thích hợp Dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên
môi trường đĩa TSA (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để đĩa
TSA ở 37 oC trong 24 h Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành trên
đĩa[5]
Vi khuẩn Lactobacillus sp
Pha loãng huyễn dịch bào tử vi khuẩn thu được theo bậc 10 liên tiếp bằng
cách dùng các ống nghiệm chứa 9 ml nước muối vô trùng, đánh số thứ tự trên các
Formatted: Condensed by 0.3 pt
Formatted: Justified
Formatted: Justified
Trang 39Sinh viên: Đỗ Phương Thảo Page 31
Formatted: Right: -0.02", Border: Top: (Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: Not at 6.13"
ống nước muối Dùng micropipette hút 1ml huyễn dịch vi khuẩn cho vào 2 ống
nghiệm 1, bơm lên bơm xuống nhiều lần và lắc trên máy vortex để trộn đều, ta
được nồng độ pha loãng, hút 1ml từ ống 1 cho vào ống 2, trộn đều được nồng độ
pha loãng 10-2 và tiếp tục cho tới ống cuối cùng Sau đó chọn 3 nồng độ pha loãng
liên tiếp thích hợp Dùng micropipette hút 0,1 huyễn dịch bào tử vi khuẩn cho lên
môi trường đĩa MRS (mỗi nồng độ 2 đĩa), trang đều bằng que trang vô trùng, để
đĩa MRS ở 37 oC trong 48 h Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn hình thành
trên đĩa
2.3.2.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp đục lỗ Phương
pháp như sau: môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri (đã
chứa vi khuẩn kiểm định), sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch
Nhỏ phần dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các lỗ đã đục, để ở 40C trong 6
giờ, sau đó mang các đĩa thạch để 370C Sau 24 giờ quan sát vòng kháng khuẩn tạo
thành Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng
đường kính vòng kháng khuẩn ∆D
∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm)
d: đường kính lỗ thạch (mm)
2.3.2.4 Xác định hoạt tính enzym
Hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp đục lỗ thạch Phương
pháp như sau: Bản thạch thử hoạt tính enzym (cơ chất tinh bột, xenluloza) được đổ
trên đĩa Petri, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành đục lỗ thạch Nhỏ dịch
enzym vào các lỗ đã đục, để ở 370C trong 24 giờ, sau đó nhuộm bằng thuốc thử
Lugol để vòng phân giải cơ chất hiện rõ Đo vòng phân giải D-d (mm), D là đường
kính vòng ngoài, d là đường kính lỗ nhỏ dịch
2.3.3 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp
2.3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên sinh trưởng của các chủng vi sinh vật
Formatted: Space Before: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Level 3, Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt