Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học VIỆNĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Tuyển chọn số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao Người hướng dẫn: PGS.TS Tăng Thị Chính Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hương Lớp: 11-04 Hà Nội – 2015 Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Tăng Thị Chính- Trưởng phòng Vi sinh vật môi trường, Viện công nghệ môi trường dành thời gian công sức tận tình hướng dẫn định hướng cho suốt trình nghiên cứu giúp hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Đặng Thị Mai Anh trực tiếp hướng dẫn đóng góp nhiều ý kiến quý báu, bảo suốt trình nghiên cứu đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn anh, chị phòng Vi sinh vật môi trường tạo điều kiện, giúp đỡ bảo suốt thời gian thực tập Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội dạy dỗ tôi, cho kiến thức kinh nghiệm bổ ích suốt trình học tập Cuối cùng, dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình thân yêu, người thân, bạn bè bên tôi, cho nguồn động lực,chia sẻ giúp hoàn thành tốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 10 tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Hương MỤC LỤC CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung kitin kitinaza 1.1.1 Kitin 1.1.2 Kitinaza 1.2 Khả sinh tổng hợp enzym kitinaza số chủng VSV 1.2.1 Một số chủng VSV có HT kitinaza 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kitinaza 1.3 Các ứng dụng kitinaza 11 1.4 Tình hình nghiên cứu kitinaza 14 1.4.1 Ngoài nước 14 1.4.2 Trong nước 18 Chương II PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 20 2.1.3 Môi trường 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Địa điểm thu mẫu 21 2.2.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật 21 2.2.3 Phương pháp khiết bảo quản giống 22 2.2.4 Phương pháp xác định khả tổng hợp enzym kitinaza phương pháp thỏi thạch 22 2.2.5 Phương pháp xác định khả tổng hợp enzym kitinaza phương pháp giếng thạch 22 2.2.6 Nghiên cứu thành phần môi trường nguồn dinh dưỡng, yếu tố ảnh hưởng đến vi sinh vật 23 Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn sinh enzyme kitinaza 25 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng vi sinh vật tuyển chọn 29 3.2.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 29 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ cacbon 32 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ kitin 34 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl 37 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian 39 Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 3.2.7 Ảnh hưởng pH môi trường 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Kết tuyển chọn bước đầu chủng vi sinh vật chịu mặn sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào 25 Bảng 3.2 Kết tuyển chọn chủng VSV chịu mặn có khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh tổng hợp kitinaza 30 chủng VSV tuyển chọn 30 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nồng độ C lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ kitin lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 35 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ NaCl lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 43 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn 45 Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử kitin Hình 1.2: Các cấu hình kitin Hình 3: Cơ chế hoạt động enzym kitinaza Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải số chủng VSV chịu mặn sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào 28 Hình 3.2 Sự biến thiên HT enzym kitinaza chủng VSV theo nguồn C MT 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn C đến khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào chủng VSV tuyển chọn 32 Hình 3.4 Sự biến thiên HT enzym kitinaza chủng VSV theo nồng độ C MT 34 Hình 3.5 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo nồng độ kitin môi trường nuôi cấy 36 Hình 3.6 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo nồng độ NaCl môi trường 39 Hình 3.7 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza chủng VSV theo thời gian nuôi cấy 41 Hình 3.8 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza chủng VSV theo nhiệt độ nuôi cấy 44 Hình 3.9 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo pH môi trường 45 Hình 3.10 Hoạt tính chủng VSV tuyển chọn nuôi cấy MT thích hợp 47 Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Nội dung VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn MT Môi trường HT Hoạt tính C Cacbon N Nitơ HL Hàm lượng Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 MỞ ĐẦU Với đường bờ biển dài 3.200 km, Việt Nam có vùng đặc quyền kinh tế dài triệu km2 hệ thống sông kênh rạch, sông, suối dày đặc Vị trí địa lý điều kiện tự nhiên tạo thuận lợi cho Việt Nam đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản Ngành thủy sản Việt Nam có vai trò lớn kinh tế quốc dân, đóng góp cho GDP nước khoảng 4% Trong cấu nông - lâm - ngư nghiệp, thủy sản chiếm khoảng 20 - 22% tỷ trọng Việt Nam đứng vào Top 10 nước xuất thuỷ sản lớn giới Tuy nhiên, vấn đề cấp bách đặt năm có tới hàng ngàn phế thải thủy sản thải môi trường, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Phế thải ngành thủy sản phần lớn vỏ động vật chân khớp như: tôm, cua, ghẹ… có thành phần chủ yếu kitin Kitin chất khó phân hủy Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác để phân hủy kitin chi phí cao Hiện nay, người ta nghiên cứu chiết tách enzym kitinaza phân giải kitin từ nhiều nguồn khác như: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm…Trong đó, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzym cao,ổn định với nhiệt độ pH, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp Ngoài ra,enzym kitinaza có nhiều ứng dụng nông nghiệp, công nghiệp y học Khả khử kitin làm cho kitinaza có giá trị phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm môi trường Kitinaza khai thác sử dụng tác nhân phòng trừ sinh học Chúng có vai trò quan trọng hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất kitooligosaccharid hoạt hóa, sản xuất glucosamine N acetyl-glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học ứng dụng việc kiểm soát nấm kí sinh trồng Vì lý thực đề tài: “ Tuyển chọn số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao” nhằm góp phần cung cấp thêm vào bảo tàng giống số chủng vi sinh vật có hoạt tính kitinaza cao Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 Mục tiêu đề tài: - Tuyển chọn - chủng vi sinh vật chịu mặn có khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao - Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao chủng vi sinh vật tuyển chọn Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung kitin kitinaza 1.1.1 Kitin Kitin polysaccharide tồn tự nhiên với sản lượng lớn (đứng thứ hai sau cellulose) Trong tự nhiên kitin có động vật thực vật Trong động vật kitin thành phần cấu trúc quan trọng vỏ số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong động vật bậc cao, đơn phân kitin thành phần chủ yếu mô da, giúp cho tái tạo làm liền vết thương da Trong thực vật, kitin có vách tế bào nấm họ zygomycetes, sinh khối nấm mốc số loại tảo Trong loài thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ HL kitin-kitinaza chiếm cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vỏ tôm, cua, ghẹ nguồn nguyên liệu để sản xuất kitin-kitinaza Về mặt lịch sử, kitin Braconnot phát vào năm 1821, cặn dịch chiết từ loại nấm Ông đặt tên cho chất “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc Năm 1823 Odier phân lập chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi chiitin, kitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa vỏ giáp ông không phát có mặt nitơ Cuối Odier Braconnot đến kết luận kitin có dạng công thức giống với cellulose Cấu trúc hóa học kitin: Kitin (C8H13O5N)n polymer mạch dài N-acetyl glucosamine, dẫn xuất glucose, nhóm (-OH) nguyên tử C(2) thay nhóm acetyl amin (-NHCOCH3)(cấu trúc I) Như kitin poly (N-acetyl-2-amino-2-deoxy-β-Dglucopyranose) liên kết với liên kết β-(1-4) glycoside Trong đơn phân kitin đánh số glucose Cấu trúc kitin tập hợp monosacharide (N-acetyl-β-D-glucosamine) Hơn kitin tồn trạng thái tự luôn liên kết cộng hóa trị (covalent bond) với protein, CaCOR 3R hợp chất hữu khác Nguyễn Thị Hương Lớp 11-04 H o t tính (m m ) 60 50 0,5% 40 1,5% 30 2,5% 20 3% 10 3,5% ĐN1.1 ĐN1.6 T Q1.1 Các chủng VSV Hình 3.6 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo nồng độ NaCl môi trường Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NaCl cho thấy, nồng độ NaCl dao động khoảng 0,5 – 3,5% hoạt tính enzyme kitinaza chủng VSV tuyển chọn gần không thay đổi Điều thấy chủng vi sinh vật tuyển chọn sinh trưởng sinh hoạt tính dải NaCl tương đối rộng Vì sử dụng chủng áp dụng thực tế sử dụng vùng nước lợ nước mặn, chí độ mặn lên tới 3,5% chúng sinh trưởng Tuy nhiên để thuận tiện cho trình nghiên cứu cố định nồng độ NaCl nghiên cứu 3,5% 3.2.5 Ảnh hưởng thời gian Bên cạnh ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng độ NaCl thời gian nuôi cấy yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kitinaza chủng VSV tuyển chọn Như biết, tùy giai đoạn sinh trưởng khác nhau, khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào chủng VSV khác Các giai đoạn sinh trưởng VSV phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy Vì tiến hành nuôi chủng VSV: ĐN1.1,ĐN 1.6, TQ1.1 môi trường thích hợp, sau Nguyễn Thị Hương 39 Lớp 11-04 tiến hành thu nhận thử HT kitinaza thời điểm: 24h, 48h, 72h, 96h Kết ghi nhận bảng 3.7 hình 3.7 Bảng 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn Ký hiệu chủng Thời gian nuôi Đường kính vòng cấy (giờ) phân giải (D – d, mm) ĐN1.1 ĐN1.6 TQ1.1 Nguyễn Thị Hương 24 21 48 39 72 41 96 30 24 21 48 39 72 43 96 27 24 25 48 44 72 48 96 33 40 Lớp 11-04 60 Hoạt tính (mm) 50 24h 40 48h 30 72h 20 96h 10 ĐN1.1 ĐN1.6 T Q1.1 Các chủng VSV Hình 3.7 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza chủng VSV theo thời gian nuôi cấy Kết ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn cho thấy: - Khi nuôi cấy chủng ĐN1.1 khoảng thời gian từ 24 – 72h khả sinh tổng hợp enzym kitinaza có xu hướng tăng (d = 21 – 41 mm), hoạt tính kitinaza đạt giá trị lớn thời điểm nuôi cấy 72h Khi tăng thời gian nuôi cấy lên tới 96 hoạt tính kitinaza lại có xu hướng giảm (d = 30 mm), giảm khoảng 26,8% so với thời gian nuôi cấy 72h - Khả sinh tổng hợp kitinaza chủng ĐN1.6 có xu hướng tăng nuôi cấy khoảng thời gian 24 – 72h (d = 21 - 43 mm) Hoạt tính kitinaza đạt giá trị lớn thời điểm 72h (d = 43 mm) Sau 72h hoạt tính kitinaza có xu hướng giảm khoảng 37% (d = 27 mm) - Chủng TQ1.1 tương tự chủng ĐN1.1và ĐN1.6 khả sinh tổng hợp enzym kitinaza có xu hướng tăng khoảng thời gian nuôi cấy từ 24 - 72h (d = 25 - 48 mm) đạt giá trị snh 72h (d = 48 mm) Khi tăng thời gian nuôi cấy lên từ 72 - 96h hoạt tính kitinaza có xu hướng giảm (d = 33 mm), giảm khoảng 31% so với mức 72h Nguyễn Thị Hương 41 Lớp 11-04 Điều giải thích sau: giai đoạn 24-72h giai đoạn VSV tăng trưởng có nhu cầu dinh dưỡng cao Vì vậy, chúng tạo lượng enzym lớn để tiêu thụ nguồn dinh dưỡng Do đó, thời điểm 72h có hoạt tính kitinaza cao Còn sau 72h tốc độ sinh trưởng vào giai đoạn ổn định Do đó, lượng enzym tạo Từ kết cho thấy thời gian nuôi cấy thích hợp cho thu nhận kitinaza 72h nên chọn thời gian 72h thời gian nuôi cấy tối ưu chủng VSV tuyển chọn 3.2.6 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng nhiều đến hoạt động vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nhiệt độ sinh trưởng tốt chủng VSV thường từ 20oC - 40oC Chúng làm thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp kitinaza chủng VSV mức nhiệt độ từ 10 - 45oC Kết thể bảng 3.8 hình 3.8 Nguyễn Thị Hương 42 Lớp 11-04 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn Ký hiệu Nhiệt độ (oC) chủng ĐN1.1 ĐN1.6 TQ1.1 Nguyễn Thị Hương Đường kính vòng phân giải(D – d, mm) 10 18 25 35 30 40 35 39 40 40 45 25 10 16 25 38 30 43 35 44 40 43 45 33 10 12 25 39 30 49 35 47 40 48 45 29 43 Lớp 11-04 H o t tính (m m ) 60 10ºC 50 25ºC 40 30ºC 30 35ºC 20 40ºC 10 45ºC ĐN1.1 ĐN1.6 TQ1.1 Các chủng VSV Hình 3.8 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza chủng VSV theo nhiệt độ nuôi cấy Kết ảnh hưởng nhiệt độ cho thấy, nhiệt độ có ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính chủng VSV phân lập Chúng cho hoạt tính tương đối tốt khoảng 25 - 45oC, đường kính vòng phân giải > 20mm cho hoạt tính tốt khoảng 30-40oC Khi nhiệt độ giảm xuống 10oC hoạt tính chủng có bị giảm nhiều: chủng ĐN1.1 giảm khoảng 55%, chủng ĐN1.6 giảm khoảng 64% chủng TQ1.1 giảm khoảng 76% so với nuôi cấy khoảng nhiệt độ 3040oC Tuy nhiên, 10oC hoạt tính kitinaza chủng >10mm Điều cho thấy chủng VSV tuyển chọn sinh trưởng sinh hoạt tính dải nhiệt độ từ 10 - 45oC Điều cho thấy, áp dụng chủng vào thực tế phù hợp với khí hậu Việt Nam nên việc áp dụng chủng vào xử lý môi trường Việt Nam hoàn toàn hợp lý 3.2.7 Ảnh hưởng pH môi trường Bên cạnh, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ pH yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển VSV Các ion H+, OHlà hai loại ion có tác động lớn đến hoạt động vi sinh vật, biến đổi dù nhỏ Nguyễn Thị Hương 44 Lớp 11-04 nồng độ chúng có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sinh trưởng VSV Vì vậy, việc xác định pH trì pH cần thiết suốt thời gian sinh trưởng tế bào quan trọng Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng chủng VSV tuyển chọn thay đổi từ 5,5 đến 8,5 Kết trình bày bảng 3.9 hình 3.9 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH lên khả sinh tổng hợp enzym kitinaza chủng VSV tuyển chọn Đường kính vòng phân giải (D – d, mm) Ký hiệu pH chủng 5,5 6,5 7,5 8,5 ĐN1.1 29 42 42 42 28 20 12 ĐN1.6 38 42 42 42 44 44 44 TQ1.1 47 47 47 47 48 49 48 ĐN1.1 TQ1.1 ĐN1.6 60 50 Hoạt tính (mm) 40 30 20 10 5,5 6,5 pH 7,5 8,5 Hình 3.9 Sự biến thiên hoạt tính enzym kitinaza theo pH môi trường Kết bảng 3.9 hình 3.9 cho thấy: Cả chủng VSV tuyển chọn sinh tổng hợp enzym kitinaza khoảng pH từ 5,5 – khác Nguyễn Thị Hương 45 Lớp 11-04 - Chủng ĐN1.1 sinh tổng hợp enzym kitinaza tốt khoảng pH từ - (d = 42 mm) Nhưng mức pH = 5,5 hoạt tính enzyme kitinaza giảm xuống 29 mm, giảm khoảng 31% so với mức pH từ - Với pH lơn hoạt tính kitinaza chủng ĐN1.1 giảm khoảng 33 - 71% so với mức pH từ - - Đối với chủng ĐN1.6 pH môi trường thay đổi - 8,5 cho hoạt tính kitinaza tương đối cao d = 42 – 44mm, pH 5,5 hoạt tính đạt 38mm Điều cho thấy pH thay đổi 5,5 - 8,5 không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính kitinaza chủng ĐN1.6 - Tương tự chủng ĐN1.6 hoạt tính kitinaza chủng TQ1.1 gần không thay đổi pH dao động khoảng 5,5 - 8,5 Kết cho thấy, pH môi trường dao động khoảng 5,5 – 8,5 không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính chủng VSV tuyển chọn Điều cho thấy chủng VSV tuyển chọn có khả sinh trưởng dải pH tương đối rộng thuận lợi áp dụng trình xử lý môi trường vùng có pH môi trường thay đôi liên tục Tổng kết điều kiện môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp kitinaza chủng vi khuẩn tuyển chọn: - Đối với chủng ĐN1.1: MT kitin có bổ sung – 2,5% rỉ đường;0,25% kitin; 3,5 % NaCl, thời gian nuôi cấy 72h, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, pH = – (d = 42mm) - Chủng ĐN1.6: MT kitin có bổ sung 2,5% rỉ đường, 0,25% kitin, 3,5 % NaCl, thời gian nuôi cấy 72h, nhiệt độ nuôi cấy 35oC, pH = 7,5 – 8,5 (d = 44mm) - Chủng TQ1.1: MT kitin có bổ sung 3% rỉ đường, 0,25% kitin, 3,5% NaCl, thời gian nuôi cấy 72h, nhiệt độ nuôi cấy 30oC, pH =8 (d = 49 mm) Dưới hình ảnh HT chủng VSV nuôi cấy MT thích hợp Nguyễn Thị Hương 46 Lớp 11-04 Hình 3.10 Hoạt tính chủng VSV tuyển chọn nuôi cấy MT thích hợp Nguyễn Thị Hương 47 Lớp 11-04 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu đưa số kết luận sau: Từ mẫu bùn lấy âu thuyền Thọ Quang, TP Đà Nẵng bùn ao nuôi tôm Vườn quốc gia Xuân Thủy phân lập 32 chủng VSV, tuyển chọn chủng VSV chịu mặn có khả sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao chủng ĐN1.1 (d = 33mm), ĐN1.6 (d = 29mm) TQ1.1 (d = 40mm) Sau nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh hoạt tính chủng ĐN1.1, ĐN1.6 TQ1.1 rút kết luận cho chủng sau: - Chủng ĐN1.1 sinh tổng hợp enzyme kitinaza cao môi trường có bổ sung – 2,5% rỉ đường, 0,25% kitin, 3,5% NaCl nuôi cấy 30oC, pH = – 72h cho đường kính vòng phân giải kitin đạt 42mm - Chủng ĐN1.6 sinh tổng hợp enzyme kitinaza cao môi trường có bổ sung 2,5% rỉ đường, 0,25% kitin, 3,5% NaCl nuôi cấy 35oC, pH = 7,5 – 8,5 72h cho đường kính vòng phân giải kitin đạt 44mm - Chủng TQ1.1 sinh tổng hợp enzyme kitinaza cao môi trường có bổ sung 3% rỉ đường, 0,25% kitin, 3,5% NaCl nuôi cấy 30oC, pH = 72h cho đường kính vòng phân giải kitin đạt 49mm Kiếnnghị Tiếp tục nghiên cứu sâu yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme kitinaza để phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng xử lý ô nhiễm môi trường giàu kitin Nguyễn Thị Hương 48 Lớp 11-04 TÀI LIỆU THAM KHẢO Đinh Minh Hiệp (2010), Nghiên cứu enzym kitinaza b-glucanaza từ vi nấm Trichoderma spp khả kiểm soát sinh học số nấm gây bệnh thực vật, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Sinh học nhiệt đới, TP Hồ Chí Minh Lê Thị Huệ (2010), Khảosát khả sinh tổng hợp enzym kitinaza số chủng NS thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ, Trường ĐHSP Tp HCM Abdel-Naby, M A., El-Shayeb, N M A., & Sherief, A A (1992) Purification and some properties of kitinaza fromAspergillus carneus Applied biochemistry and biotechnology, 37(2), 141-154 Bingxin, Z Z Z M Y (1992) Studies on Kitinaza Production by Marine Streptomyces Journal of XiamenUniversity (Natural Science), 5 Binod, P., Pusztahelyi, T., Nagy, V., Sandhya, C., Szakacs, G., Pocsi, I., et al (2005) Production and purification of extracellular kitinazas from Penicillium aculeatum NRRL 2129 under solidstate fermentation Enzym and microbial technology, 36(7), 880-887 Chae, D H., De Jin, R., Hwangbo, H., Kim, Y W., Kim, Y C., Park, R D., et al (2006) Control of late blight (Phytophthora capsici) in pepper plant with a compost containing multitude of kitinaza-producing bacteria BioControl, 51(3), 339-351 Dahiya, N., Tewari, R., & Hoondal, G S (2006) Biotechnological aspects of kitinolytic enzyms: a review Applied microbiology and biotechnology, 71(6), 773-782 Dahiya, N., Tewari, R., Tiwari, R P., & Hoondal, G S (2005) Production of an antifungal kitinaza from Enterobacter sp NRG4 and its application in protoplast production World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21(8), 1611-1616 El-Katatny, M H., Gudelj, M., Robra, K H., Elnaghy, M A., & Gübitz, G M (2001) Characterization of a kitinaza and an endo-ß-1, 3-glucanaza from Trichoderma harzianum Rifai T24 involved in control of the phytopathogen Sclerotium rolfsii Applied microbiology and biotechnology, 56(1), 137-143 Nguyễn Thị Hương 49 Lớp 11-04 10 Escott, G M., Hearn, V M., & Adams, D J (1998) Inducible kitinolytic system of Aspergillus fumigatus Microbiology, 144(6), 1575 11 Felse, P A., & Panda, T (2000) Submerged culture production of kitinaza by Trichoderma harzianum in stirred tank bioreactors-the influence of agitator speed Biochemical engineering journal, 4(2), 115-120 12 Ghanem, K M., Al-Fassi, F A., & Farsi, R M (2011) Statistical optimization of cultural conditions for kitinaza production from shrimp shellfish waste by Alternaria alternata African Journal of Microbiology Research, 5(13), 1649-1659 13 Ghanem, K M., Al-Garni, S M., & Al-Makishah, N H (2010) Statistical optimization of cultural conditions for kitinaza production from fish scales waste by Aspergillus terreus African Journal of Biotechnology, 9(32), 5135-5146 14 Gkargkas, K., Mamma, D., Nedev, G., Topakas, E., Christakopoulos, P., Kekos, D., et al (2004) Studies on a N-acetyl-[beta]-d-glucosaminidaza produced by Fusarium oxysporum F3 grown in solid-state fermentation Process Biochemistry, 39(11), 1599-1605 15 Gooday, G W (1995) The dynamics of hyphal growth Mycological Research, 99(4), 385-394 16 Hou, W C., Chen, Y C., & Lin, Y H (1998) Kitinaza activity of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam var Tainong 57) Botanical Bulletin of Academia Sinica, 39 17 Kawachi, I., Fujieda, T., Ujita, M., Ishii, Y., Yamagishi, K., Sato, H., et al (2001) Purification and properties of extracellular kitinazas from the parasitic fungus Isaria japonica Journal of bioscience and bioengineering, 92(6), 544-549 18 Koga, D (2004) Application of kitinaza to agriculture Bioscience, 62(8), 529-530 19 Kumari, J A., & Panda, T (1994) Intergeneric hybridization of Trichoderma reesei QM9414 and Saccharomyces cerevisiae NCIM 3288 by protoplast fusion Enzym and microbial technology, 16(10), 870-882 Nguyễn Thị Hương 50 Lớp 11-04 20 Lee, Y G., Chung, K C., Wi, S G., Lee, J C., & Bae, H J (2009) Purification and properties of a kitinaza from Penicillium sp LYG 0704 Protein expression and purification, 65(2), 244-250 21 Lee, Y S., Park, I H., Yoo, J S., Chung, S Y., Lee, Y C., Cho, Y S., et al (2007) Cloning, purification, and characterization of kitinaza from Bacillus sp DAU101 Bioresource technology, 98(14), 2734-2741 22 Liu, C L., Shen, C R., Hsu, F F., Chen, J K., Wu, P T., Guo, S H., et al (2009) Isolation and identification of two novel SDS resistant secreted kitinazas from Aeromonas schubertii Biotechnology progress, 25(1), 124-131 23 Marco, J L D., Valadares-Inglis, M C., & Felix, C R (2003) Production of hydrolytic enzyms by Trichoderma isolates with antagonistic activity against Crinipellis perniciosa, the causal agent of witches' broom of cocoa Brazilian Journal of Microbiology, 34(1), 33-38 24 Maria, G L., Sridhar, K R., & Raviraja, N S (2005) Antimicrobial and enzym activity of mangrove endophytic fungi of southwest coast of India Journal of Agricultural Technology, 1, 67- 80 25 Mtui, G., & Masalu, R (2008) Extracellular enzyms from Brown-rot fungus Laetioporus sulphureus isolated from mangrove forests of Coastal Tanzania Sci Res Essay, 3, 154-161 26 Ordentlich, A., Elad, Y., & Chet, I (1988) The role of kitinaza of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii Phytopathology (USA) 27 Owhashi, M., Arita, H., & Hayai, N (2000) Identification of a novel eosinophil chemotactic cytokine (ECF-L) as a kitinaza family protein Journal of Biological Chemistry, 275(2), 1279 28 Patidar, P., Agrawal, D., Banerjee, T., & Patil, S (2005) Optimisation of process parameters for kitinaza production by soil isolates of Penicillium chrysogenum under solid substrate fermentation Process Biochemistry, 40(9), 2962-2967 Nguyễn Thị Hương 51 Lớp 11-04 29 Pedraza-Reyes, M., & Lopez-Romero, E (1989) Purification and some properties of two forms of kitinaza from mycelial cells of Mucor rouxii Journal of general microbiology, 135(1), 211 30 Rattanakit, N., Plikomol, A., Yano, S., Wakayama, M., & Tachiki, T (2002) Utilization of shrimp shellfish waste as a substrate for solid-state cultivation of Aspergillus sp.S1-13: Evaluation of a culture bazad on kitinaza formation which is necessary for kitin-assimilation Journal of bioscience and bioengineering, 93(6), 550556 31 Rattanakit, N., Yano, S., Plikomol, A., Wakayama, M., & Tachiki, T (2007) Purification of Aspergillus sp S1-13 kitinazas and their role in saccharification of kitin in mash of solid-state culture with shellfish waste Journal of bioscience and bioengineering, 103(6), 535-541 32 Rodriguez, J., Copa Patiño, J L., & Pérez Leblic, M I (1995) Purification and properties of a kitinaza from Penicillium oxalicum autolysates Letters in applied microbiology, 20(1), 46-49 33 Swiontek-Brzezinska, M., Lalke-Porczyk, E., & Donderski, W (2007) Kitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons Oceanological and Hydrobiological Studies, 36(3), 101-111 34 Vyas, P., & Deshpande, M (1991) Enzymatic hydrolysis of kitin by Myrothecium verrucaria kitinaza complex and its utilization to produce SCP Journal of General and Applied Microbiology, 37(3), 267-275 35 Wang, S L., & Hwang, J R (2001) Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of kitinazas Enzym and microbial technology, 28(4-5), 376382 36 Abeles, F B., Bosshart, R P., Forrence, L E., & Habig, W H (1971) Preparation and purification of glucanaza and kitinaza from bean leaves Plant Physiology, 47(1), 129 Nguyễn Thị Hương 52 Lớp 11-04 37 Mauch, F., Mauch-Mani, B., & Boller, T (1988) Antifungal hydrolazas in pea tissue: II Inhibition of fungal growth by combinations of kitinaza and -1, 3glucanaza Plant Physiology, 88(3), 936 38 Stoyachenko, I A., Varlamov, V P., & Davankov, V A (1994) Kitinaza of Streptomyces kurssanovii: purification and some properties Carbohydrate polymers, 24(1), 47-54 39 Takahashi, M., Tsukiyama, T., & Suzuki, T (1993) Purification and some properties of kitinaza produced by Vibrio sp.Journal of fermentation and bioengineering, 75(6), 457-459 40 Tao, Y., Long, Z., Xie, J., Jin, H., Ran, H., Tao, K., et al (2005) Identification of a kitinaza producing bacterium C4 and histopathologic study on locusts Pest management science, 61(2), 159-165 41 Widmer G In Encyclopedia of Polymer Science and Technology, Bikales, N.M.; Mark, H.F et al Eds.; John Wiley & Sons: New York, 1965 Petersen, H In Houben-Weil-Methoden der Organischen Chemie; Bartl, H ; Falte, J Eds.;Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1987 42 Sahai AS, Manocha MS (1993) Kitinazas of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction FEMS Mocrobiol Rev 11:317-338 Nguyễn Thị Hương 53 Lớp 11-04 [...]... kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza Nguyễn Thị Hương 24 Lớp 11-04 Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn sinh enzyme kitinaza Vi sinh vật chịu mặn chủ yếu sinh trưởng và phát triển trong môi trường nước mặn: nước biển, bùn biển…Vì vậy chúng tôi đã tiến hành tuyển chọn một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào từ... hình ảnh của một số chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải của một số chủng VSV chịu mặn sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào Nguyễn Thị Hương 28 Lớp 11-04 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp enzym kitinaza của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn Các yếu tố môi trường cũng như điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất... chú: + có hoạt tính yếu; - không có hoạt tính Kết quả bảng 3.1 cho thấy trong số 32 chủng VSV thử hoạt tính sinh tổng hợp enzym kitinaza thì có 20 chủng (chiếm 62,5%) có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza với mức độ khác khau - Số chủng có đường kính vòng phân giải > 10mm chiếm khoảng 43,75% trong tổng số chủng - Số chủng có đường kính vòng phân giải 5 – 10mm chiếm khoảng 9,375% - Số chủng có đường... 11-04 Để khẳng định lại về hoạt tính của các chủng VSV tuyển chọn, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng sinh enzym kitinaza của 14 chủng có đường kính vòng phân giải > 10mm Kết quả thu được sau 48h nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết quả tuyển chọn các chủng VSV chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza ngoại bào cao Số thứ Ký hiệu chủng tự Thời gian nuôi Đường kính vòng cấy (giờ)... cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hoá ở thực vật bậc cao Ngoài ra, theo cơ chế xúc tác của kitinaza ta có các loại kitinaza sau: endokitinaza, kitin-1,4-β-kitobiosidaza, N-acetyl-β-D-glucosamine (exokitinaza) và kitobiaza 1.2 Khả năng sinh tổng hợp enzym kitinaza của một số chủng VSV 1.2.1 Một số chủng VSV có HT kitinaza Hiện nay kitinaza được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn... endokitinaza ở Trichoderma longibrachiatumTĐ16 Lê Thị Huệ (2010) khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzymkitinaza của một số chủng NS thuộc giống spergillus,Trichoderma và ứng dụng Đinh Minh Hiệp (2010) nghiên cứu enzymkitinaza và β- glucanaza từ vi nấm Trichodermaspp và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [1], [2] Nhìn chung, những nghiên cứu về kitinaza ở vi sinh vật trong... vật: Vi sinh vật là nguồn cung cấp chủ yếu kitinaza trong sản xuất Nguồn kitinaza được tạo ra bởi vi sinh vật cho HL nhiều hơn so với động, thực vật, và nhìn chung enzym cảm ứng ngoại bào thuộc hai loại endokitinaza và exokitinaza Vi sinh vật có khả năng phân hủy kitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên Nhưng nguồn enzym từ các chủng vi sinh vật khác nhau có khả năng hòa tan trong dung dịch và kích thước... trong sinh tổng hợp enzym Loại enzym được sinh tổng hợp, số đơn vị enzym được tạo ra và hoạt lực của enzym đều phụ thuộc vào sự Nguyễn Thị Hương 10 Lớp 11-04 thay đổi của pH môi trường Mỗi loài khác nhau thích nghi với một độ pH khác nhau Với vi khuẩn tổng hợp kitinaza có HT cao nhất với điều kiện pH thường là từ 7-8 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym. .. (2003) đã khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp hệ enzym kitinaza của các chủng nấm mốc Trichoderma spp Tô Duy Khương (2004) đã khảo sát sự sinh tổng hợp kitinaza ở Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh Quỳnh Hương (2006) nghiên cứu về chuyển gen kháng nấm kitinaza gluconaza vào cây sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và đã thu được một số kết quả... nhằm tăng sản lượng kitinaza sinh ra [13] Năm 2011 ông đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho enzymkitinaza cao từ Alternaria alternata và ứng dụng sản xuất Kitooligosaccharides và Nacetyl-D-Glucosamine [12] * Nghiên cứu về kitinaza được sinh tổng hợp từ vi sinh vật phân lập ở rừng ngập mặn Hơn 300 chủng Actinomyces có khả năng sinh tổng hợp kitinaza được phân lập từ bùn biển ở rừng ngập mặn ở phía Nam Fujian,