Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng phân giải cellulose từ nước rỉ rác tại bãi rác thị trấn lương sơn tỉnh hòa bình

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA QUẢN LÝ TÀI NGUYÊN RỪNG & MÔI TRƢỜNG - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN VÀ NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE TỪ NƢỚC RỈ RÁC TẠI BÃI RÁC LƢƠNG SƠN – HỊA BÌNH NGÀNH: KHOA HỌC MƠI TRƢỜNG MÃ SỐ: 306 Giáo viên hướng dẫn : Ths Nguyễn Thị Bích Hảo Nguyễn Thị Mai Lương Sinh viên thực : Nguyễn Văn Nam Mã sinh viên : 1353061427 Lớp : 58C - KHMT Khóa học : 2013 - 2017 LỜI CẢM ƠN Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Để gắn kết lý thuyết thực hành, đồng thời hoàn thành chƣơng trình học, đƣợc đồng ý Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, Khoa QLTNR & MT, em tiến hành thực Khóa luận tốt nghiệp phịng thực hành thuộc Trung tâm ĐDSH & QLRBV Trong thời gian thực tập hồn thành khóa luận, em nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ bảo cô giáo hƣớng dẫn nhƣ thầy cơ, cán Trung tâm, gia đình bạn bè Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Trƣớc tiên em xin tỏ lịng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Bích Hảo, cô Nguyễn Thị Mai Lƣơng ngƣời định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, trực tiếp hƣớng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành tốt khóa luận Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, cán Trung tâm ĐDSH & QLRBV tận tình bảo giúp đỡ em thời gian thực tập, hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Qua đây, em xin bày tỏ biết ơn thầy cô Khoa QLTNR & MT, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tận tình giảng dạy giúp đỡ em suốt trình học tập Trƣờng để em hồn thành chƣơng trình học Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên giúp đỡ em vật chất tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Văn Nam i TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP KHOA QUẢN LÝ TÀI NGUN RỪNG VÀ MƠI TRƢỜNG ======================================================== TĨM TẮT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên khóa luận: “Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose từ nước rỉ rác bãi rác thị trấn Lương Sơn – tỉnh Hịa Bình” Từ khóa: nước rỉ rác, vi khuẩn phân giải cellulose, nấm men phân giải cellulose Keywords: leachate, cellulolytic bacteria, cellulolytic yeast Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nam Giảng viên hƣớng dẫn: ThS Nguyễn Thị Bích Hảo Cn Nguyễn Thị Mai Lƣơng Mục tiêu nghiên cứu:  Mục tiêu tổng quát Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác để phục vụ nghiên cứu  Mục tiêu cụ thể Phân lập chọn lọc chủng vi khuẩn nấm men có hiệu lực phân giải cellulose cao từ nƣớc rỉ rác Bƣớc đầu xác định số đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn nấm men đƣợc phân lập Xác định điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn nấm men Nâng cao hiệu xử lý cellulose nƣớc rỉ rác vi khuẩn nấm men ii Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu  Đối tƣợng nghiên cứu Một số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose đƣợc phân lập từ nƣớc rỉ rác bãi rác thị trấn Lƣơng Sơn, huyện Lƣơng Sơn – tỉnh Hịa Bình  Phạm vi nghiên cứu Bãi rác thị trấn Lƣơng Sơn – huyện Lƣơng Sơn, tỉnh Hòa Bình Nội dung nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có hiệu lực phân giải cellulose cao từ nƣớc rỉ rác Nghiên cứu số đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn nấm men đƣợc tuyển chọn Nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng phát triển chủng vi khuẩn nấm men Đề xuất giải pháp nâng cao hiệu xử lý cellulose nƣớc rỉ rác vi khuẩn nấm men Những kết đạt đƣợc Đã sàng lọc đƣợc chủng vi khuẩn có khả sinh trƣởng môi trƣờng Hansen Các chủng đƣợc đặt tên BHBi1, BHBi2, BHBi3, BHBi4, BHBi5, BHFi1, BHFi2, BHFi3 Nhƣng đề tài chƣa phân lập đƣợc chủng nấm men có khả phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác Các chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả phân giải cellulose mức độ khác môi trƣờng bổ sung chất CMC Trong chủng BHBi1, BHFi1, BHFi2 BHF3 đƣợc xác định có khả phân giải mạnh Phân loại dựa đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập đƣợc sau nhuộm màu Gram Trong đó, chủng thuộc nhóm Gram âm gồm iii chủng BHBi1, BHBi2, BHBi5 BHFi3 Các chủng lại (BHBi3, BHBi4, BHFi1 BHFi2) thuộc nhóm Gram dƣơng Xác định đƣợc pH mơi trƣờng nuôi cấy tối ƣu cho sinh trƣởng, phát triển sinh tổng hợp enzyme cellulase chủng có khả phân giải cellulose mạnh Trong đó, chủng BHBi1 có pH tối ƣu – , chủng BHFi1, BHFi2 BHFi3 có pH tối ƣu khoảng – Đề xuất đƣợc số giải pháp thúc đẩy trình phân giải cellulose, nâng cao hiệu phân hủy RTSH Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Nguyễn Văn Nam iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ viii DANH MỤC CÁC BẢNG viii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I.TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nƣớc rỉ rác 1.1.1 Khái niệm nƣớc rỉ rác 1.1.2 Nguồn gốc phát sinh nƣớc rỉ rác 1.1.3 Thành phần tính chất nƣớc rỉ rác 1.2 Sự phân bố cấu trúc cellulose tự nhiên 1.2.1 Sự phân bố cellulose tự nhiên 1.2.2 Cấu trúc cellulose 1.3 Sự phân giải cellulose tự nhiên 1.3.1 Cơ chế trình phân giải cellulose nhờ vi sinh vật 1.3.2 Vi sinh vật phân giải cellulose 11 1.4 Các nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác 16 1.4.1 Nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose 16 1.4.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân giải cellulose nƣớc rỉ rác 21 CHƢƠNG II MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 23 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 23 2.2 Đối tƣợng – phạm vi nghiên cứu 23 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.4 Vật liệu – hóa chất – thiết bị 24 v 2.4.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.4.2 Hóa chất 24 2.4.3 Thiết bị - dụng cụ 24 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.5.1 Phƣơng pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 25 2.5.2 Phƣơng pháp thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy 26 2.5.3 Phƣơng pháp phân lập 27 2.5.4 Phƣơng pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải hợp chất hữu cellulose30 2.5.5 Phƣơng pháp nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho chủng vi sinh vật phân giải cellulose 32 2.5.6 Phƣơng pháp nhuộm Gram 32 2.5.7 Phƣơng pháp thu thập, kế thừa tài liệu 33 2.5.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1 Kết thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn nấm men 35 3.3 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose 39 3.4 Đặc điểm hình thái chủng đƣợc phân lập 41 3.5 Nghiên cứu điều kiện pH môi trƣờng tối ƣu cho sinh trƣởng, phát triển chủng vi khuẩn 44 3.6 Giải pháp nâng cao hiệu xử lý cellulose rác thải sinh hoạt chủng vi khuẩn nấm men 48 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BCL: Bãi chôn lấp CMC: Carboxyl methyl cellulose CNSH: Công nghệ sinh học CTNH: Chất thải nguy hại ĐDSH & QLRBV: Đa dạng sinh học quản lí rừng bền vững HEC: Hydroxyl ethyl cellulose ICMC: Index of Relative Enzyme Activity (ICMC) KBTTN: Khu bảo tồn thiên nhiên MĐPG: Mức độ phân giải QLTNR & MT: Quản lý tài nguyên rừng môi trƣờng RTSH: Rác thải sinh hoạt vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc tính nƣớc rỉ rác BCL lâu năm Bảng 1.2 Hàm lƣợng cellulose có số nguyên liệu Bảng 1.3 Các vi sinh vật phân huỷ cellulose 15 Bảng 2.1 Phân cấp hoạt lực enzyme cellulase ngoại bào 31 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng vi sinh vật có khả sinh trƣởng mơi trƣờng Hansen 36 Bảng 3.2 Hoạt tính enzyme cellulase 39 Bảng 3.3 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn nấm men phân lập 42 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh enzyme cellulase chủng phân lập 45 viii DANH MỤC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cấu trúc không gian hợp chất cao phân tử cellulose Hình 1.2 Các mắt xích D – glucose cellulose Hình 1.3 Cellulose cấu trúc thành tế bào thực vật Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme cellulase 11 Hình 2.1 Sơ đồ vị trí lấy mẫu 25 Hình 3.1 Khả phân giải cellulose (V) chủng đƣợc phân lập 40 Hình 3.2 Vòng phân giải CMC chủng BHBi1, BHFi1, BHFi2 BHFi3 41 Hình 3.3 Ảnh hƣởng pH đên khả sinh enzyme cellulase 45 Hình 3.4 Vịng phân giải CMC chủng BHFi1, BHFi2 BHFi3 nuôi cấy môi trƣờng có pH = 46 Hình 3.5 Đƣờng kính vịng phân giải chủng BHFi1, BHFi2, BHFi3 pH = pH = 47 ix TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng, 1983 “Một số sản phẩm vi nấm”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, 1984 “Vi sinh vật đất chuyển hóa hợp chất Carbon, Nito” Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998 Vi sinh vật học, Nhà xuất Giao dục, Hà Nội Ngô Trung Hiếu, 2009 Khóa luận tốt nghiệp: “Xây dựng mơ hình xử lý nước rác bãi chôn lấp rác Tuần Quán, thành phố Yên Bái, tỉnh Yên Bái”, Đại học Lâm Nghiệp Lê Nhƣ Kiểu Tài liệu học tập: “Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý phế phụ phẩm nơng nghiệp góp phần bảo vệ môi trường” Nguyễn Đức Lƣợng, 1996 Luận án Phó Tiến sĩ: “Nghiên cứu tính chất số vi sinh vật có khả tổng hợp cellulase cao ứng dụng xử lý chất thải hữu cơ” Nguyễn Thị Thúy Nga, Phạm Quang Nam, Lê Xuân Phúc, Phạm Quang Thu, Nguyễn Minh Chí, 2015 “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải cellulose sản xuất phân bón sinh học”, Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp, tháng năm 2015, 3841-3850 Nguyễn Ngọc Trúc Ngân, Phạm Thị Ngọc Lan, 2014 “Tìm hiểu khả phân giải cellulose vi sinh vật phân lập tử chất thải rắn nhà máy FOCOCEV Thừa Thiên Huế” Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 1, số năm 2014, Trƣờng Đại học Khoa học Huế, 135-142 Võ Văn Phƣớc Quệ, Cao Ngọc Điệp, 2011 Tạp chí Khoa học: 18a, Trƣờng Đại học Cần Thơ, 177-184 53 10 Đỗ Đình Rãng (Chủ biên), 2013 Hóa học hữu cơ, tập 3, Nhà xuất Giao dục Việt Nam 11 Nguyễn Nhƣ Thanh, Nguyễn Đƣờng, Nguyễn Khắc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Lộc, Nguyễn Bá Hiên, 2004 Vi sinh vật học đại cương, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Thị Thảo, 2008 Khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu đánh giá hiệu xử lý nước thải nhà máy xử lý chất thải rắn Nam Định”, Đại học Lâm Nghiệp 13 Hà Thanh Toàn, Mai Thu Thảo, Nguyễn Thu Phƣớng, Trần Lê Kim Ngân, Bùi Thế Vinh, Cao Ngọc Diệp, 2008 “Phân lập vi khuẩn phân giải cellulose, tinh bột protein nước rỉ từ bãi rác thành phố Cần Thơ” Tạp chí Khoa học: 2008-10, Trƣờng Đại học Cần Thơ, 195-202 14 Lê Ngọc Tú, 2002 “Hóa sinh cơng nghiệp”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 15 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân, Nguyễn Lân Dũng, 1982 “Enzyme vi sinh vật tập II”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 16 Trần Cẩm Vân, 2005 Vi sinh vật học môi trường, Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội Tiếng Anh 17 S P Gautam, P S Bundela, A K Pandey, Jamaluddin, M K Awasthi, and S Sarsaiya, 2012 “Diversity of Cellulolytic Microbes and the Biodegradation of Municipal Solid Waste by a Potential Strain”, Hindawi Publishing Corporation International Journal of Microbiology Volume 2012, Article ID 325907, 12 pages 18 P.R.Hesse, 1980 “Improving soil fertility thought organic recycling”, FAO/UNDP Regional Project RAS/75/004, The collected lectuer delivered during the project Traning course held at New Delhi, Idian 54 19 Ibatsam Khokhar; Muhammad Saleem Haider; Sobia Mushtaq; Irum Mukhtar, 2012 “Isolation and Screening of Highly Cellulolytic Filamentous Fungi”, J Appl Sci Environ Manage Sept., 2012 Vol 16 (3) 223 – 226 20 Patric Chua Tze Chien, Hye-Seung Yoo, Gary A Dykes Sui Mae Lee, 2015 “Isolation and characterization of cellulose degrading ability in Paenibacillus”, Malaysian Journal of Micobiology, Vol 11(2) Special issue 2015, pp 185 – 194 21 Yan-Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu, Yuan Wu, and Jia-Xun Feng, 2014 “Isolation, Screening, and Identification of Cellulolytic Bacteria from Natural Reserves in the Subtropical Region of China and Optimization of Cellulase Production by Paenibacillus terrae ME27-1” 55 NHẬT KÝ THỰC TẬP Thời gian thực hiện: Từ ngày 13/2/2017 đến ngày 13/5/2017 Địa điểm thực hiện: - Công ty TNHH Đầu tƣ Thƣơng mại Hồng Long – chi nhánh Hịa Bình Địa chỉ: Tiểu khu 10, thị trấn Lƣơng Sơn, huyện Lƣơng Sơn, tỉnh Hịa Bình Phịng thực hành Thực vật rừng (203, 303 – T6), Trung tâm ĐDSH & QLRBV, Khoa QLTNR & MT Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nam Mã sinh viên: 1353061427 Lớp: 58C – KHMT Khoa: Quản lý tài nguyên rừng môi trƣờng STT Nội dung thực tập Lập kế hoạch thực tập tốt nghiệp Thời gian thực Ngày 13/2/2017 Lập đề cƣơng khóa luận tốt nghiệp Nộp đề cƣơng khóa luận tốt nghiệp Ngày 25/2/2017 Khảo sát địa bàn thực tập tốt nghiệp Ngày 15/3/2017 Lấy mẫu Ngày 3/5/2017 Bảo quản mẫu phịng thí nghiệm Thực thí nghiệm  Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm  Khử trùng dụng cụ Ngày 4/5/2017  Nấu, khử trùng, phân phối bảo quản môi trƣờng nuôi cấy Thực thí nghiệm  Khử trùng dụng cụ  Pha lỗng mẫu Ngày 5/5/2017  Trải mẫu lên mơi trƣờng ni cấy Kiểm tra thí nghiệm  Quan sát, mô tả khuẩn lạc môi trƣờng nuôi cấy Ngày 8/5/2017  Chụp ảnh khuẩn lạc  Ghi chép kết Thực thí nghiệm (Phân lập)  Khử trùng dụng cụ  Nấu, phân phối môi trƣờng Ngày 10/5/2017  Cấy truyền Kiểm tra thí nghiệm  Quan sát, mô tả khuẩn lạc môi trƣờng nuôi cấy Ngày 11/5/2017  Chụp ảnh khuẩn lạc  Ghi chép kết 10 Kiểm tra thí nghiệm  Quan sát, mô tả khuẩn lạc môi trƣờng nuôi cấy Ngày 12/5/2017  Chụp ảnh khuẩn lạc  Nhuộm màu Gram  Ghi chép kết 11 Thực thí nghiệm (Tuyển chọn)  Khử trùng dụng cụ  Nấu, phân phối mơi trƣờng  Thử hoạt tính enzyme cellulase 12 Thực thí nghiệm (thay đổi pH mơi trƣờng) Ngày 13/5/2017  Ghi chép kết thí nghiệm thử hoạt tính Ngày 14/5/2017  Khử trùng dụng cụ  Nấu, phân phối môi trƣờng  Cấy khuẩn lạc vào đĩa mơi trƣờng có pH khác 13 Kiểm tra thí nghiệm  Quan sát kết  Ghi lại kết đƣờng kính vịng phân Ngày 16/5/2017 giải  Chụp ảnh thí nghiệm 14 Hồn thiện Khóa luận 15 Hồn thiện Khóa luận Nộp Khóa luận tốt nghiệp Ngày 17/5/2017 Ngày 18/5/2017 SỐ LIỆU THỰC TẬP Bảng Đƣờng kính vịng phân giải chủng BHBi1, BHFi1, BHFi2 BHFi3 môi trƣờng nuôi cấy STT Chỉ số V (D – d) Kí hiệu chủng (mm) BHBi1 21 BHBi2 BHBi3 BHBi4 12 BHBi5 11 BHFi1 15 BHFi2 16 BHFi3 15 Bảng Đƣờng kính vịng phân giải chủng BHBi1, BHFi1, BHFi2 BHFi3 mơi trƣờng ni cấy có pH khác Chủng BHBi1 Chủng BHFi1 Chủng BHFi2 Chủng BHFi3 pH V (mm) V (mm) V (mm) V (mm) pH = 14 18 19 19 pH = 16 20 22 21 pH = 19 16 18 17 pH = 21 15 16 15 pH = 17 11 13 14 pH = 12 10 9 Bảng Số lƣợng mẫu tọa độ vị trí lấy mẫu STT Kí hiệu mẫu LS1 LS2 LS3 LS4 LS5 Số lƣợng mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu mẫu Tọa độ PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập đƣợc nồng độ pha lỗng STT Kí hiệu Nồng mẫu độ LS1 10-2 LS1 10-2 Hình ảnh khuẩn lạc LS1 10-2 LS1 10-3 LS1 10-4 LS1 10-5 LS4 10-5 LS4 10-4 Phụ lục Hình ảnh thành phần rác thải sinh hoạt Nhà máy xử lý rác thải Lƣơng Sơn Phụ lục Hình ảnh số vị trí lấy mẫu nƣớc rỉ rác Hình Cống thu nƣớc rỉ rác hố Hình Nƣớc rỉ rác hố chôn lấp chôn lấp Hình Hố thu nƣớc rỉ rác số Hình Nƣớc rỉ rác hố thu số Phụ lục Một số hình ảnh Nhà máy xử lý rác thải Lƣơng Sơn Hình Hố chơn lấp rác thải Hình Kênh dẫn nƣớc mƣa nƣớc rỉ rác Hình Rác thải đƣợc phủ bạt để ủ Hình Hố chơn lấp đƣợc san lấp ... ? ?Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose từ nước rỉ rác bãi rác thị trấn Lương Sơn – tỉnh Hịa Bình? ?? Từ khóa: nước rỉ rác, vi khuẩn phân giải cellulose, nấm men. .. quát Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose từ nƣớc rỉ rác để phục vụ nghiên cứu  Mục tiêu cụ thể Phân lập chọn lọc chủng vi khuẩn nấm men có hiệu lực phân giải. .. ? ?Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn nấm men có khả phân giải cellulose từ nguồn nước rỉ rác bãi rác thị trấn Lương Sơn – Hòa Bình? ?? CHƢƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nƣớc rỉ