Phân lập vi khuẩn bacillus megaterium có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm phân bón sinh học

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài khóa luận này, xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp cho phép tạo điều kiện thuận lợi để thực tập Viện Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp tận tình truyền đạt kiến thức cho tơi suốt năm học tập trƣờng Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu q trình học khơng tảng cho trình nghiên cứu đề tài mà cịn hành trang q báu để tơi bƣớc vào đời cách vững tự tin Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng giảng viên Viện CNSH Lâm nghiệp tận tình định hƣớng hƣớng dẫn tơi suốt q trình hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học Trong q trình thực hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học thời gian kiến thức cịn hạn chế nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót mong nhận đƣợc đóng góp ý kiến, bảo tận tình q thầy, để đề tài khóa luận tơi đƣợc hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực Ths Nguyễn Thị Thu Hằng Hoàng Thị Thu Hiền i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN I MỤC LỤC II DANH MỤC VIẾT TẮT IV DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VI ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI HUẨN BACILLUS 1.2 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS MEGATERIUM 1.2.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS MEGATERIUM 1.2.2 ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI 1.2.3 ĐẶC ĐIỂM 1.2.4 LỊCH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM 1.2.5 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG 1.2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACILLUS MEGATERIUM CHƢƠNG 2MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3 NGUYÊN LIỆU 2.3.1 NGUỒN VI SINH VẬT 2.3.2 HÓA CHẤT 10 2.3.3 THIẾT BỊ SỬ DỤNG 10 2.3.4 MÔI TRƢỜNG NGHIÊN CỨU 10 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.4.1 PHÂN LẬP, GIỮ CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CHẾ PHẨM 13 2.4.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS 13 ii 2.4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO 16 2.4.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƢỜNG 17 2.4.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 17 CHƢƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC CHỦNG BACILLUS MEGATERIUM 19 3.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA NGUỒN CARBON 21 3.3 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS 22 3.4 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO 23 3.4.1 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH AMYLASE 24 3.4.2 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CELLULASE 25 3.4.3 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE 26 3.5 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƢỜNG 27 3.5.1 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NHIỆT 27 3.5.2 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỊU NACL 28 3.6 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 30 CHƢƠNG 4.KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 4.1 KẾT LUẬN 32 4.2 KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 iii DANH MỤC VIẾT TẮT B cereus : Bacillus cereus B.megaterium : Bacillus Megaterium B.subtilis : Bacillus subtilis ĐC : Đối chứng VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh Vật iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Công thức Môi trƣờng Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi khuẩn Bacillus megaterium 10 Bảng 2.2: Công thức môi trƣờng LB 11 Bảng 2.3: Mơi trƣờng xác định khả đồng hóa nguồn Cacbon 11 Bảng 2.4: Công thức mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme 11 Bảng 3.1 Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 19 Bảng 3.2 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng vi khuẩn 21 Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa Bacillus 22 Bảng 3.4 Hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác 24 Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác 25 Bảng 3.6 Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác 26 Bảng 3.7 Khả chịu nhiệt chủng L3 môi trƣờng LB-lỏng agar 27 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bacillus Megaterium Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu Hình 3.1 A, Ba dạng khuẩn lạc đặc trƣng đƣợc làm 20 môi trƣờng Ashby agar 20 B, Hình ảnh nhuộm gram ba khuẩn lạc 20 Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khuẩn B2 B3 môi trƣờng cố định Nitơ 23 B, Hình ảnh chủng vi khuẩn có khả sinh catalase 23 Hình 3.3 Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào chủng Bacillus megaterium phân lập 24 Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác 25 Hình 3.4 Hoạt tính phân giải cellulase chủng Bacillus phân lập 25 Hình 3.5 Hoạt tính phân giải protease chủng Bacillus phân lập 26 Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 ni nhiệt độ khác môi trƣờng LBlỏng 28 Hình 3.7 a, Hình ảnh biểu đồ khả chịu muối vi khuẩn 29 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ vi sinh đóng góp cho nơng nghiệp giới thành tựu to lớn, trở thành ngành mũi nhọn tham gia giải mục tiêu bảo vệ tài nguyên đất đai nâng cao độ phì nhiêu, tăng suất trồng chất lƣợng nông sản Nông nghiệp Việt Nam năm tiêu thụ triệu phân hóa học để bảo đảm sản lƣợng, nhƣng hiệu sử dụng phân bón thấp, nhiều vùng đất có xu hƣớng suy thối độ phì, sâu bệnh phát triển mạnh, chất lƣợng nông sản chƣa cao Vì việc nghiên cứu ứng dụng nguồn gen vi sinh vật tốt để sản xuất chế phẩm vi sinh, phân vi sinh vất, phân hữu vi sinh hữu sinh học xu hƣớng tích cực chiến lƣợc phát triển nơng nghiệp theo hƣớng hữu hiệu bền vững Tuy nhiên, ngành cơng nghệ vi sinh nói chung Việt Nam non trẻ so với nƣớc có nơng nghiệp tiên tiến, nghiên cứu tuyển chọn làm giàu nguồn gen vi sinh vật hữu ích có chất lƣợng cao phục vụ cho sản xuất nông nghiệp vấn đề cấp thiết Hiện nay, hầu hết sản phẩm vi sinh vật đƣợc sản xuất từ loại vi sinh vật, hay phối hợp nhiều chủng có tác dụng hỗ trợ cho phát huy tác dụng chuyên biệt chúng nhƣ: (Cố định đạm cộng sinh – Nitragin, Rhizoda; Cố định đạm hội sinh, tự – Azogin, Rhizolu; Phân giải hợp chất photpho khó tan – Phosphobacterein, phân hữu vi sinh cố định đạm, phân giải lân, phân hữu vi sinh đa chức gồm vi sinh vật cố định đạm, phân giải lân, kích thích sinh trƣởng kết hợp với chủng vi sinh có khả hạn chế bệnh đất hại trồng) hiệu sử dụng chế phẩm địa phƣơng khác Nguyên nhân tƣợng phong phú, đa dạng hệ vi sinh vật đất tác động qua lại nhiều chiều cùa vi sinh vật với nhau, vi sinh khác với trồng điều kiện môi trƣờng Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: “Phân lập vi khuẩn Bacillus Megaterium có tiềm ứng dụng sản xuất chế phẩm phân bón sinh học” Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1 Giới thiệu chung vi hu n Bacillus  Phân loại khoa học: Giới (regnum): Bacteria Ngành (divisio): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (ordo): Bacillales Họ (familia): Bacillaceae Chi (genus): Bacillus Tế bào Bacillus hình que, thẳng gần thẳng, kích thƣớc 0,3 - 2,2 x 1,2 µm Tế bào Bacillus thƣờng xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn vuông Bacillus VK gram dƣơng, hầu hết dƣơng tính với catalase có khả di động nhờ lơng roi Mỗi tế bào Bacillus hình thành nội bào tử có hình oval hình trụ Bào tử V có khả chịu nhiệt, acid Sự hình thành nội bào tử khơng bị ngăn cản tiếp xúc khơng khí Các lồi thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử giữ nguyên hình que mang bào tử, số trƣờng hợp phình to lên chút Tùy theo lồi chi Bacillus, bào tử nằm giữa, gần cuối, cuối [15,20] - Đặc điểm phân bố: Nhờ khả sinh bào tử nên Bacillus tồn thời gian dài dƣới điều kiện khác Bacillus phổ biến tự nhiên nên phân lập từ nhiều nguồn khác nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, phân, trầm tích biển, thức ăn, sữa, lớp mùn, Chủ yếu đất nơi mà đóng vai trị quan trọng chu kỳ carbon nito - Hầu hết loài thuộc chi Bacillus sinh vật hóa dị dƣỡng, thu nhận lƣợng nhờ oxi hóa hợp chất hữu nhƣ đƣờng, amino acid, acid hữu cơ, [8] - Phần lớn loài thuộc chi Bacillus V hiếu khí kị khí tùy tiện, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu từ 30-45°C, số chịu nhiệt với nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu lên tới 6°C, ƣa lạnh (5°C-25°C) Các loài V thuộc chi Bacillus sinh trƣởng khoảng pH rộng từ 2-11 Trong phịng thí nghiệm, dƣới điều kiện sinh trƣởng tối ƣu, Bacillus có thời gian hệ 25 phút Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ muối rộng nên Bacillus tồn điều kiện bất lợi thời gian dài [15] 1.2 Tổng quan Bacillus Megaterium 1.2.1 Đặc điểm sinh học Bacillus Megaterium Bacillus megaterium vi khuẩn Gram dƣơng , hiếu khí chủ yếu bào tử đƣợc tìm thấy phổ biến môi trƣờng Với chiều dài tế bào lên tới Pha đƣờng kính 1,5 Thaym, B megaterium vi khuẩn lớn đƣợc biết đến Các tế bào thƣờng xuất theo cặp chuỗi, tế bào đƣợc nối với polysaccharide thành tế bào Vào năm 1960, B megaterium sinh vật mẫu số vi khuẩn gram dƣơng cho nghiên cứu chuyên sâu sinh hóa, bào tử vi khuẩn Hiện nay, Bacillus megaterium đƣợc ứng dụng rộng rãi lĩnh vực công nghệ sinh học cho khả sản xuất protein tái tổ hợp, làm phân bón 1.2.2 Đặc điểm phân loại Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Lồi: B megaterium Hình 1.1: Bacillus Megaterium 1.2.3 Đặc điểm B megaterium phát triển nhiệt độ từ 3°C đến 45°C, với mức tối ƣu khoảng 37°C Một số phân lập từ hồ địa nhiệt Nam Cực đƣợc tìm thấy phát triển nhiệt độ lên tới 63°C B megaterium đƣợc công nhận endophyte tác nhân tiềm cho việc kiểm soát sinh học bệnh thực vật Sự cố định đạm đƣợc chứng minh số chủng B megaterium B megaterium sinh vật công nghiệp quan trọng nhiều thập kỷ Nó sản xuất penicillin amidase đƣợc sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp, loại amylase khác đƣợc sử dụng ngành làm bánh glucose dehydrogenase đƣợc sử dụng xét nghiệm glucose máu Hơn nữa, đƣợc sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, loại thuốc có đặc tính diệt nấm kháng vi-rút, Nó tạo enzyme để điều chỉnh corticosteroid, nhƣ số axit amin dehydrogenase B megaterium đƣợc biết sản xuất axit poly-glutamic Sự tích lũy polymer đƣợc tăng lên nhiều môi trƣờng nƣớc muối (2 xăng10% NaCl ), polymer bao gồm phần lớn L-glutamate (hàm lƣợng đồng phân L lên tới 95%) Ít chủng B megaterium đƣợc coi halophile , tăng trƣởng NaCl lên đến 15% đƣợc quan sát thấy [27] Xác định khả đồng hóa nguồn carbon Từ phƣơng pháp xác định khả đồng hóa đƣợc nêu ta thu đƣợc kết nhƣ Bảng 3.2: Bảng 3.2 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng vi khu n Nguồn Khả Khả Khả Carbon đồng hóa đồng hóa đồng hóa Của chủng chủng chủng B1 B2 B3 Glucose + + + Lactose + + + Glycerol + + + Maltose + + + Xylose + + - Sucrose + + + Fructose + + + Mannitol + + + Ghi chú: - : Khơng có khả đồng hóa + : Có khả đồng hóa Từ Bảng 3.2 thể nhƣ nhận xét nhƣ sau: Hai chủng B1 B2 có khả đồng hóa nguồn với tất loại đƣờng đƣợc thể bảng 3.2 Chủng B3 có khả đồng hóa với loại đƣờng Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose Mannitol khơng có khả đồng hóa với đƣờng Xylose Từ đặc điểm sinh lý sinh hóa phân lập đƣợc vi khuẩn xác định khả đồng hóa nguồn carbon chủng B3 Bacillus megaterium trùng với khóa luận xác định khả đồng hóa nguồn carbon khóa phân 21 loại bergey (2004) có khả vi khuẩn Bacillus megaterium, nhiên để khẳng định xác cần định dạng sinh học phân tử 3.3 Xác định số đặc điểm sinh lý, sinh hóa Bacillus Ba chủng vi khuẩn đƣợc xác định số đặc điểm nhƣ khả sinh trƣởng, phát triển môi trƣờng Ashby không chƣa Nitơ; khả sinh trƣởng phát triển mơi trƣờng kỵ khí xác định khả sinh catalase kết đƣợc thể Bảng 3.3 Hình ảnh 3.3: Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa Bacillus STT Ký hiệu Khả sinh Khả sinh chủng vi trƣởng, phát triển trƣởng, phát triển khuẩn môi trƣờng Ashby môi trƣờng kỵ khơng chứa Nitơ khí Catalase B1 ++ - + B2 ++ - + B3 +++ - + Ghi chú: -: Khơng có khả sinh trưởng, phát triển mơi trường kỵ khí +: Có khả sinh catalase ++: Sinh trưởng tạo lượng sinh khối trung bình mơi trường Ashby +++: Sinh trưởng tạo nhiều sinh khối môi trường Ashby khơng chứa Nitơ 22 A B Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khu n B2 B3 môi trƣờng cố định Nitơ B, Hình ảnh chủng vi khu n có khả sinh catalase Kết đƣợc thể Bảng 3.3 cho thấy ba chủng đƣợc cấy trải môi trƣờng Ashby agar sang môi trƣờng Ashby- lỏng B3 có khả sinh trƣởng hiếu khí sinh trƣởng tốt mơi trƣờng khơng có Nitơ, mơi trƣờng khơng có Nitơ có Bacillus megaterium sinh trƣởng tốt tƣơng ứng với công bố Bergey(1884) Qua Bảng 3.2 Hình 3.2 cho thấy ba chủng thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí có khả sinh trƣởng mơi trƣờng Ashby agar mơi trƣờng Ashby lỏng đó, đáng ý khả cố định Nitơ chủng B3 3.4 Xác định khả sinh enzyme ngoại bào Thành phần chủ yếu thức ăn chăn nuôi protein, xơ thô tinh bột, Tuy nhiên, tiết enzyme tiêu hóa dày ruột non cịn thấp nên 23 khả tiêu hóa thức ăn cịn hạn chế Vì vậy, khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) chủng có vai trị quan trọng, nhằm hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp động vật hấp thu tốt Vì vậy, chủng Bacillus sau chọn lọc đƣợc tiến hành khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 3.4.1 Xác định hoạt tính amylase Bảng 3.4 Hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi khu n sau khoảng thời gian ni cấy khác Ký hiệu Đƣờng kính vòng phân giải tinh bột 1% Bacillus chủng vi sau khoảng thời gian nuôi cấy khác D-d (cm) khuẩn Sau 24h Sau 48h Sau 72h B1 2,37 ± 0,01 2,40 ± 0,01 2,36 ± 0,02 B2 2,00 ± 0,01 2,00 ± 0,01 1,87 ± 0,03 B3 4,00 ± 0,02 4,05 ± 0.01 3,97 ± 0.01 Hình 3.3 Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào chủng Bacillus megaterium phân lập Qua kết đƣợc thể từ Bảng 3.3 Hình 3.3 cho thấy khả phân giải tinh bột 1% ba chủng mạnh Cụ thể: Chủng B1 hoạt tính mạnh, hoạt tính mạnh thời gian 48 2,40 (cm) giảm dần thời gian 72 2,36 (cm) Chủng B2 có hoạt tính mạnh nhƣng yếu chủng B1, hoạt tính mạnh thời gian 24 đến 48 2,00 (cm) sau giảm dần thời điểm 72 xuống cịn 1,87 (cm) Cuối chủng 24 B3 có hoạt tính mạnh ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh 48 4,05 (cm) giảm dần thời gian 72 3,97 (cm) 3.4.2 Xác định hoạt tính cellulase Enzyme tác động với chất môi trƣờng thạch, chất bị phân hủy tạo thành vòng suốt xung quanh lỗ khoan Độ lớn mơi trƣờng suốt phản ánh hoạt tính enzyme đƣợc thể Bảng 3.5 Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác Ký hiệu Đƣờng kính vịng phân giải tinh CMC 1% Bacillus chủng vi sau khoảng thời gian nuôi cấy khác D-d (cm) khuẩn Sau 24h Sau 48h Sau 72h B1 2,50±0,01 2,40±0,01 2,40±0,02 B2 1,70±0,01 1,75±0,01 1,67±0,03 B3 2,62±0,02 2,65±0.01 2,60±0.01 Hình 3.4 Hoạt tính phân giải cellulase chủng Bacillus phân lập Kết đƣợc thể từ Bảng 3.4 Hình 3.4 cho thấy khả phân giải CMC 1% ba chủng mạnh Cụ thể: Chủng B1 hoạt tính mạnh, hoạt tính mạnh thời gian 24 2,50 (cm) giảm dần thời gian 48 72 2,40 (cm) Chủng B2 có hoạt tính mạnh, hoạt tính mạnh thời gian 48 2,75 (cm) có hoạt tính yếu thời điểm 72 xuống 1,67 (cm) Cuối chủng B3 có hoạt tính mạnh ba 25 chủng, thời gian hoạt tính mạnh 48 2,65 (cm) giảm dần thời gian 72 cịn 2,60 (cm) 3.4.3 Xác định hoạt tính protease Enzyme tác động với chất môi trƣờng thạch, chất bị phân hủy tạo thành vòng suốt xung quanh lỗ khoan Độ lớn môi trƣờng suốt phản ánh hoạt tính enzyme đƣợc thể Bảng 3.6 Bảng 3.6 Hoạt tính protease ngoại bào chủng vi khuẩn sau khoảng thời gian nuôi cấy khác Ký hiệu Đƣờng kính vịng phân giải tinh casein 1% chủng vi Bacillus sau khoảng thời gian nuôi cấy khác khuẩn D-d (cm) Sau 24h Sau 48h Sau 72h B1 3,20±0,01 3,30±0,01 3,26±0,02 B2 2,56±0,01 2,60±0,01 2,57±0,03 B3 5,50±0,02 5,43±0.01 5,43±0.01 Hình 3.5 Hoạt tính phân giải protease chủng Bacillus phân lập Kết đƣợc thể từ Bảng 3.6 Hình 3.5 cho thấy khả phân giải casein 1% ba chủng mạnh Cụ thể: Chủng B1 hoạt tính mạnh, hoạt tính mạnh thời gian 48 3,30 (cm) giảm dần thời gian 72 cịn 2,26 (cm) Chủng B2 có hoạt tính mạnh nhƣng yếu chủng B1, hoạt tính mạnh thời gian 24 đến 48 2,60 (cm) sau giảm nhẹ thời điểm 72 xuống 1,57 (cm) Cuối chủng B3 có hoạt tính 26 mạnh ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh 24 5,50 (cm) hoạt tính giữ nguyên thời gian 48 72 5,43 (cm)  Qua bƣớc tiến hành xác định enzyme ngoại bào ba chủng phân lập đƣợc có kết đƣợc thể Bảng 3.3, 3.4, 3.5 Hình 3.3, 3.4 3.5 cho thấy chủng Bacillus khảo sát có khả sinh enzyme ngoại bào Nhƣng thấy bật chủng B3 có hoạt tính mạnh cao hai chủng lại cụ thể hoạt tính phân giải tinh bột 1% mạnh 4,05 (cm), hoạt tính phân giải CMC mạnh 2,65 (cm) hoạt tính phân giải casein 0,8% 5,50 (cm) Từ kết chọn đƣợc chủng B3 Bacillus megaterium có hoạt tính mạnh để thực thí nghiệm sau Xác định khả chống chịu số yếu tố bất lợi môi trƣờng 3.5.1 Xác định khả chịu nhiệt Nhiệt độ yếu tố môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới sinh trƣởng phát triển chủng q trình ni cấy nhƣ thực tiễn Ở điều kiện nuôi cấy phịng thí nghiệm, chủng ni cấy thƣờng có giá trị nhiệt độ xác định thích hợp cho trình sinh trƣởng phát triển Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu nhiệt chúng nhiệt độ khác nhau, kết thu đƣợc Bảng 3.7 Bảng 3.7 Khả chịu nhiệt chủng L3 môi trƣờng LB-lỏng agar Nhiệt độ nuôi cấy Môi trƣờng LB-lỏng Môi trƣờng LB-agar (OD600nm) 40ºC 1,67 ± 0,02 +++ 45ºC 1,54 ± 0,02 +++ 50ºC 1,35 ± 0,02 ++ 60ºC 1,26 ± 0,02 ++ 27 Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 ni nhiệt độ khác môi trường LB-lỏng Ghi chú: A Nuôi nhiệt độ 40ºC; B Nuôi nhiệt độ 45ºC; C Nuôi nhiệt độ 50ºC D Nuôi nhiệt độ 60ºC Kết trình bày Bảng 3.7 Hình 3.6, thấy chủng phân lập có khả sinh trƣởng, phát triển nhiệt độ từ 30-50°C Trong đó, khoảng nhiệt độ từ 40-55°C chủng sinh trƣởng mạnh sau 20 nuôi cấy Ở nhiệt độ 45°C, chủng sinh trƣởng yếu Nhiệt độ 37-45°C nhiệt độ phù hợp cho nuôi chủng Bacillus megaterium B3 3.5.2 Xác định khả chịu NaCl Hầu hết chủng Bacillus ƣa mặn, nên mục đích thí nghiệm nhằm xác định khả chịu mặn vi khuẩn Bacillus megaterium B3 Việc nghiên cứu khả chịu mặn chủng vi khuẩn có nghĩa lớn để đề xuất phạm vi ứng dụng vi khuẩn nhƣ sản xuất chế phẩm sinh học phân bón hữu chế phẩm xử lý mơi trƣờng, ứng dụng cho vùng đất ven biển xử lý ô nhiễm môi trƣờng vùng nhiễm mặn ven biển Do vậy, tiến hành khảo sát khả chịu muối chúng nồng độ muối khác Kết thu đƣợc trình bày Hình 3.7a 28 a, b, Ghi chú: a, A nồng độ NaCl 2%; B nồng độ NaCl 3%; C nồng độ NaCl 4% D nồng độ NaCl 5% Hình 3.7 a, Hình ảnh biểu đồ khả chịu muối vi khuẩn b, Khả sinh trưởng, phát triển chủng B3 Bacillus megaterium nuôi cấy môi trường có nồng độ NaCl khác Ghi chú: a, A nồng độ NaCl 1,5%; B nồng độ NaCl 2%; C nồng độ NaCl 3% D nồng độ NaCl 5% 29 Từ kết Bảng 3.7, thấy chủng phân lập có khả chịu đƣợc nồng độ muối từ 2-5% Ở nồng độ muối 1,5% chủng sinh trƣởng tốt (OD600nm đạt 2,058) đến nồng độ muối 5% giảm rõ rệt (OD600nm đạt 1,440) Nhƣ chủng B3 có khả chịu muối cao đặc tính tốt việc ứng dụng chúng làm chế phẩm So sánh với nồng độ muối ao nƣớc lợ nƣớc ta 1,5-2,5% [3], điều cho thấy chủng có khả chịu đƣợc nồng độ muối rộng phù hợp với điều kiện vùng nƣớc lợ Do đó, thích hợp để làm chế phẩm sinh học nhƣ phân bón sinh học chế phẩm sinh học xử lý mơi trƣờng 3.6 Xác định hoạt tính háng hu n Khả đối kháng với vi khuẩn E Coli, Salmonella, Bacillus cereus, shigela nấm men chủng Bacillus megaterium B3 đƣợc trình bày Bảng 3.8 Bảng 3.8: Khả háng vi sinh vật kiểm định vi khu n Bacillus megaterium B3 STT VSV kiểm định Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E.Coli - Shighella - B cereus - Samonella - Saccharomyces crevisiae - Ghi chú: -: Khơng có tính kháng vi khuẩn kiểm định Kết thể Bảng 3.9 cho thấy chủng Bacillus megaterium B3 khơng có khả kháng vi khuẩn E.coli, Samonella, Shighella, B cereus nấm men Đặc điểm chủng B3 sản xuất chế phẩm sinh học phối trộn đƣợc với vi sinh vật khác Nhƣ vậy, qua bƣớc sàng lọc tuyển chọn đặc tính probiotic chủng Bacillus điều kiện in vitro, chúng tơi nhận thấy chủng L3 có tiềm sử dụng làm chế phẩm với nhiều ƣu điểm vƣợt trội nhƣ: 30 - Có khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) với hoạt tính enzyme mạnh - Có khả sinh trƣởng, phát triển nhiệt độ cao (đến 60oC) - Có khả chịu muối nồng độ cao (NaCl 5%) - Không đối kháng số vi sinh vật kiểm định  Do vậy, chủng Bacillus megaterium B3 phân lập khẳng định có số đặc điểm sinh học thích hợp cho sản xuất chế phẩm phân bón sinh học 31 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Đã phân lập đƣợc chủng vi khuẩn có khả Bacillus megaterium chủng thuộc chi Bacillus - Xác định đƣợc hình thái khuẩn, hình dạnh tế bào chủng vi khuẩn Bacillus megaterium phân lập - Xác định đƣợc số đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Bacillus megaterium nhƣ có khả sinh nội bào tử, có kích thƣớc tế bào lớn, vi khuẩn gram dƣơng có khả sinh trƣởng, phát triển mơi trƣờng khơng có Nitơ, có khả đồng hóa nguồn carbon với đƣờng Xylose có khả sinh catalase - Xác định hoạt tính loại enzyme (amylase, protease, cellulase) ngoại bào chủng vi khuẩn Bacillus megaterium phân lập mạnh cụ thể: hoạt tính phân giải tinh bột 1% mạnh 4,05 (cm), hoạt tính phân giải CMC mạnh 2,65 (cm) hoạt tính phân giải casein 0,8% 5,50 (cm) - Xác định khả chống chịu số yếu tố bất lợi với môi trƣờng chủng vi khuẩn (khả chịu nhiệt độ cao đến 60ºC nồng độ NaCl cao 5%) vi khuẩn Bacillus megaterium - Không đối kháng số vi sinh vật kiểm định Kiến nghị Do thời gian hạn chế nên đƣợc tiếp tục tiến hành công việc nhƣ sau: - Tiến hành lặp lại thí nghiệm để tăng tính xác - Tạo chế phẩm probiotic kết hợp chủng B3 với chủng vi khuẩn có lợi khác 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT hƣu Phƣơng Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh Lê Văn Cát, Thị Hồng Nhung Ngô Ngọc Cát (2006), Nƣớc nuôi thủy sản: Chất lƣợng biện pháp cải thiện chất lƣợng, NXB hoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phƣơng pháp nghiên cứu VSV học, NXB khoa học kĩ Thuật, Hà Nội Đặng Thị Cẩm Hà and Nghiêm Ngọc Minh (2006), "Nghiên cứu phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt XKS2" Nguyễn Thị Hoàng Hải (2009), Nghiên cứu thu nhận enzyme α-amylase từ trực khuẩn cỏ khô, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trƣờng đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh 6.Thị Thu Nga (2011), Khảo sát khả sinh tổng hợp protease số chủng Bacillus, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh Lƣơng Đức Phẩm (2004), Cơng nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Lƣơng Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 112-152 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 10 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh tơm ni biện pháp phịng trị, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 11 Lê Ngọc Tú (1982), Enzyme vi sinh vật, Vol Tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội 12 Lê Phù Cẩm Tú (2018), Ứng dụng chế phẩm sinh học trồng trọt 13 Ngô Văn Thu (chủ biên) (2004), Bài Giảng Dƣợc Liệu Tập 1, NXB Hà Nội, Hà Nội 14 Nguyễn Thị Thu (2017), Sàng lọc, tuyển chọn chủng Bacillus dùng làm probiotic nuôi trồng thủy sản xử lý ao ni, Khóa luận tốt nghiệp K58C-CNSH, trƣờng Đại học Lâm nghiệp 15 Nguyễn Thị Trần Thụy (2009), Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus phân lập từ đất vƣờn sinh protease kiềm, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm TP Hồ Chí Minh 16 Trần Thanh Thủy (1999), Hƣớng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục 17 Lê Thu Trà K58C-CNSH (2017), Phân lập, thuyể chọn chủng vi khuẩn chịu nhiêt sinh tổng hợp enzyme cellulose ứng dụng chế biến thức ăn chăn ni, Khóa luận tốt nghiệp, trƣờng Đại học Lâm Nghiệp 18 Nguyễn Thị Quỳnh Trang (2012), Tuyển chọn chủng vi sinh vật tạo chế phẩm nhằm xử lý nƣớc thải nuôi trồng thủy sản, Luận văn Thạc sĩ hoa học, Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội 19 Võ Thị Thứ, Trƣơng Ba Hùng, Nguyễn Minh Dƣơng, La Thị Nga, Lê Thị Thu Hiền, Phạm Thị Minh Hà, Lê Doanh Toại, Nguyễn Trƣờng Sơn, Đào Thị Thanh Xuân (2005), Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nƣớc nuôi thuỷ sản Tuyển tập hội thảo toàn quốc nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệ nuôi trồng thuỷ sản, trang 815 20 Đào Thị Thanh Xuân (2008), Nghiên cứu sử dụng nhóm vi khuẩn Bacillus tạo chế phẩm sinh học xử lí mơi trƣờng nƣớc ni thủy sản, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 21 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2014 Trƣờng ĐHCT, Ngành Công nghệ sinh học tiên tiến Viện NC&PT Cơng nghệ sinh học TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI 22 Arici, M, et al (2004), "Some characteristics of Lactobacillus isolates from infant faeces", Food Microbiology 21(1), pp 19-24 23 AFRC, R FULLER (1989), "Probiotics in man and animals", Journal of applied bacteriology 66(5), pp 365-378 24 Apajalahti, Juha HA, et al (1998), "Effective recovery of bacterial DNA and percent-guanine-plus-cytosine-based analysis of community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens", Applied and environmental microbiology 64(10), pp 4084-4088 25 CORAL, GÖKHAN, et al (2002), "Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain", Turkish Journal of Biology 26(4), pp 209-213 26 Czerucka, Dorota and Rampal, Patrick (2002), "Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens", Microbes and infection 4(7), pp 733-739 TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 27 https://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_megaterium 28.http://www.zbook.vn/ebook/nghien-cuu-tuyen-chon-chung-vi-khuanbacillus-phan-lap-tu-dat-vuon-sinh-protease-kiem-44653/ 29 http://albavet.vn/B%C3%A0i%20Vi%E1%BA%BFt/14 30.https://tailieu.vn/doc/nghien-cuu-su-dung-bacillus-subtilis-bacillusmegaterium-bacillus-licheniformis-va-lactobacillus-a-1806861.html 31 Dienkimtrang.com/che-pham-sinh-hoc-la-gi/ ... cùa vi sinh vật với nhau, vi sinh khác với trồng điều kiện mơi trƣờng Vì vậy, chúng tơi thực đề tài: ? ?Phân lập vi khuẩn Bacillus Megaterium có tiềm ứng dụng sản xuất chế phẩm phân bón sinh học? ??... nghiên cứu khả chịu mặn chủng vi khuẩn có nghĩa lớn để đề xuất phạm vi ứng dụng vi khuẩn nhƣ sản xuất chế phẩm sinh học phân bón hữu chế phẩm xử lý môi trƣờng, ứng dụng cho vùng đất ven biển xử... triển mạnh, chất lƣợng nơng sản chƣa cao Vì vi? ??c nghiên cứu ứng dụng nguồn gen vi sinh vật tốt để sản xuất chế phẩm vi sinh, phân vi sinh vất, phân hữu vi sinh hữu sinh học xu hƣớng tích cực chiến