Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hương cho nước mắm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LU LUẬN TỐT T NGHIỆP NGHI ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN N CÁC CH CHỦNG VI KHUẨN N CÓ KHẢ KH NĂNG SINH H HƯƠNG CHO NƯỚC MẮM GIÁO VIÊN HƯ ƯỚNG DẪN : THS BÙI THỊ HỒNG NG PHƯƠNG PH SINH VIÊN THỰ ỰC HIỆN : TRẦN THỊ TIẾN LỚP : CNSH 1102 – K18 HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp nhận quan tâm, giúp đỡ nhiều nhà trường, thầy cô bạn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Thạc sĩ Bùi Thị Hồng Phương, người tận tình bảo, hướng dẫn động viên trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận Chân thành cảm ơn cô, anh chị Bộ môn Công nghệ Enzym Protein - Viện Công nghiệp Thực phẩm Xin cảm ơn bạn bè gia đình động viên giúp đỡ suốt trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2015 Sinh viên Trần Thị Tiến Trần Thị Tiến a Lớp: 1102 MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NƯỚC MẮM 1.1.1 Giới thiệu nước mắm 1.1.2 Giá trị dinh dưỡng nước mắm 1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 10 1.2.1 Chuyển hóa protit thành axit amin 11 1.2.2 Quá trình thứ hai trình tạo hương thơm 11 1.3 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 13 1.3.1 Giới thiệu chung vi khuẩn sản xuất nước mắm 13 1.3.2 Cơ chế tạo hương vi khuẩn sản xuất nước mắm 15 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN 17 1.4.1 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy 17 1.4.1.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 17 1.4.1.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ 18 1.4.1.3 Ảnh hưởng muối khoáng 19 1.4.1.4 Ảnh hưởng muối 21 1.4.2 Ảnh hưởng điều kiện môi trường 22 1.4.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 22 1.4.2.2 Ảnh hưởng pH 22 1.5 Tình hình nghiên cứu hương nước mắm giới Việt Nam 23 Trần Thị Tiến b Lớp: 1102 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 25 2.1.1 Nguyên vật liệu hóa chất 25 2.1.1.1 Nguyên liệu 25 2.1.1.2 Môi trường sử dụng 25 2.1.1.3 Hóa chất 26 2.1.2 Máy móc, thiết bị 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phương pháp vi sinh 27 2.2.1.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hương nồng độ muối cao 27 2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn 27 2.2.1.3 Nghiên cứu điều kiện tối ưu để nhân sinh khối chủng vi khuẩn 28 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 28 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzym 28 2.2.2.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 29 2.2.2.3 Phân tích khả tạo hương chủng vi khuẩn lựa chon 30 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Xây dựng tiêu chuẩn tuyển chọn vi sinh vật có khả tạo hương cho nước mắm 34 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật tạo hương nước mắm từ sưu tập chủng giống Viện Công nghiệp Thực phẩm 34 3.2.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnh 34 Trần Thị Tiến c Lớp: 1102 3.2.2 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả thủy phân protein nồng độ muối cao 36 3.2.3 Hàm lượng oligopeptit chủng lựa chọn 38 3.2.4 Hoạt tính aminopeptitdase 40 3.2.5 Xác định hợp chất hương dịch lên men mắm cá 41 3.3 Đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 3.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 49 3.4.1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 49 3.4.2 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 51 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Trần Thị Tiến d Lớp: 1102 DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT LAB Vi khuẩn lactic MF1 Staphylococcus sp MF5 Lactobacillus MF6 Lactobacillus MF8 Pediococcus MF18 Pediococcushalophilus MT1 Môi trường MRS chứa 2% glucose MT2 Môi trường MRS thay glucose 2% saccarose MT3 Môi trường MRS thay glucose 2% lactose MT4 Môi trường MRS thay glucose 2% xylose DC25 Môi trường dịch cá bổ sung muối 25% NaCl Trần Thị Tiến e Lớp: 1102 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các loại nước mắm Châu Á Bảng 1.2: pH hàm lượng NaCl, Nitơ tổng nước mắm nước Bảng 1.3: Hàm lượng axit amin nước mắm nước (mg/100ml) Bảng 1.4: Thành phần hàm lượng axit amin loại nước mắm thương mại Việt Nam (mg/g)] Bảng 1.5: Thành phần chất vô 10 Bảng 1.6: Hàm lượng vitamin nước mắm 10 Bảng 1.7: Nhu cầu axit amin số loài vi khuẩn lactic 19 Bảng 1.8: Muối vô chức sinh lý chúng 20 Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS 25 Bảng 2.2: Xây dựng đường chuẩn hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 30 Bảng 3.1: Hoạt tính protease chủng vi khuẩn 36 Bảng 3.2 Sự phát triển chủng vi khuẩn sàng lọc môi trường MRS có chứa nồng độ NaCl cao 37 Bảng 3.3: Ảnh hưởng chủng vi khuẩn canh trường cá có chứa 25% NaCl tới hàm lượng protein, oligopeptit giá trị pH 39 Bảng 3.4 Kết phân tích hợp chất bay dịch cá có hàm lượng muối cao 25% (DC25) nuôi cấy chủng vi khuẩn thời gian 14 ngày, nhiệt độ 35°C 43 Bảng 3.5: Hình thái khuẩn lạc, tế bào chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 Bảng 3.6: So sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 47 Bảng 3.7 Đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn 47 Bảng 3.8: Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn 49 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn 52 Bảng 3.10: Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn 54 Trần Thị Tiến f Lớp: 1102 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ công nghệ sản xuất nước mắm truyền thống Việt Nam 12 Hình 3.1: Ảnh vòng tròn thủy phân chủng vi khuẩn MF1, MF5, MF6, MF18 35 Hình 3.2.Hoạt tính aminopepitdase chủng nghiên cứu 41 Hình 3.3: Biểu đồ sinh trưởng chủng vi khuẩn trình nhân sinh khối 51 Hình 3.4 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Staphylococcus sp (MF1) 59 Hình 3.5 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Lactobacillus (MF5) 59 Hình 3.6 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Lactobacillus (MF6) 60 Hình 3.7 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Pediococcus (MF8) 60 Hình 3.8 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Pediococcus halophilus (MF18) 61 Trần Thị Tiến g Lớp: 1102 MỞ ĐẦU Từ lâu nước mắm trở thành loại nước chấm thông dụng gần gũi với người dân Việt Nam, xa nhớ quê hương quên hương vị nước mắm quê nhà Nước mắm không gia vị giúp cho bữa ăn ngày ngon mà xem loại thực phẩm giàu chất dinh dưỡng như: axit amin, vitamin, chất khoáng cần thiết cho thể Nước mắm Việt Nam phát triển từ lâu đời với lịch sử phát triển dân tộc mang đâm sắc đặc thù dân tộc Việt Nam Nước mắm hấp dẫn người hương vị đậm đà giá trị dinh dưỡng cao Bên cạnh nước mắm chữa số bệnh như: đau dày, phục hồi thể suy nhược,… Nước mắm sản xuất từ cá muối không sử dụng rộng rãi Việt Nam mà ưa chuộng nhiều nước giới như: Nampla Thái Lan, Ngapi Myanma, Patis Philippin,…Ở quốc gia khác có phương pháp chế biến nước mắm riêng, mang nét đặc trưng quốc gia Do vậy, nước mắm từ vùng khác có nét đặc trưng hương vị, màu sắc, thành phần chất dinh dưỡng khác Hương thơm nước mắm hình thành thủy phân protease vi sinh vật protease có tụy tạng cá Vi khuẩn lactic ưa mặn vi sinh vật chiếm ưu thay đổi hương vị màu sắc giai đoạn cuối trình lên men nước mắm (Saisithi, 1994) Tetragenococcus tìm thấy nước mắm đóng vai trò quan trọng việc hình thành hương thơmtrong trình lên men nước mắm Sự tích lũy axit amin peptit trình lên men có tác dụng đáng kể hương thơm nước mắm (Peralta cs, 1996) Các axit amin peptit hình thành hoạt động vi sinh vật proteinase cá Proteinase vi khuẩn, đặc biệt aminopeptidase nội bào, enzyme quan trọng cho hình thành hương thơm Bởi aminopeptidase nội bào chuyển hóa peptit oligopeptit thành axit amin (Smit cs, 2005) Các axit amin chuyển đổi để tạo hợp chất hương Trần Thị Tiến Lớp: 1102 Nhằm mục tiêu góp phần vào nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hương cho nước mắm, tiến hành thực đề tài: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hương cho nước mắm” Mục tiêu đề tài: Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hương cho nước mắm Nội dung nghiên cứu: Nghiên cứu lựa chọn chủng vi khuẩn có khả sinh hương cho nước mắm từ Bộ sưu tập giống vi sinh vật công nghiệp (Viện CNTP) Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Trần Thị Tiến Lớp: 1102 Bảng 3.6: So sánh đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn + + + - Trực khuẩn to + + + + + + + - Trực khuẩn ngắn, + + + + + + + - khuẩn thước tế bào Staphylococcus(MF Đơn cầu, tứ cầu, bắt 1) cặp Lactobacillus Amylase + T Lipase - Hình thái, kích Proteinase Oxisade - Các chủng vi Catalase Phản ứng Gram + ST Kiểu lên men Lên Lên men men đồng dị hình hình (MF5) Lactobacillus (MF6) nhỏ Pediococcus (MF8) Song cầu, tứ cầu + - - + + + + - Pediococcus Song cầu, tứ cầu + - - + + + + - halophilus (MF18) Nhìn bảng 3.7 cho thấy chủng vi khuẩn có khả phát triển nồng độ muối từ 0- 25% NaCl, phát triển pH khoảng pH= 4,5-9,0; có khả sinh axit từ glucose, galactose, saccarose, khả lên men mannitol, xylose Lên men yếu môi trường có bổ sung Maltose Các chủng MF5, MF6 có khả lên men nhiệt độ 45°C, chủng MF1 MF8 phát triển tốt nhiệt độ35°C, chủng phát triển nhiệt độ 10°C Tất chủng vi khuẩn chọn có khả lên men tạo axit L- lactic Trần Thị Tiến 47 Lớp: 1102 Bảng 3.7 Đặc tính sinh lý chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn Đặc tính MF1 MF5 MF6 MF8 MF18 Hình thái tế bào Hình cầu Hình que Hình que Hình cầu Hình cầu Kích thước tế bào (µm) 0,7-0,9 0,7-0,8 0,5-0,8 Catalase - + + - - 0,5÷1x1÷4 0,5÷0,8x1÷2 Nhiệt độ 10 °C - - - - - phát triển 35 °C + + + + + 45 °C - + + - - 4,5 + + + + + 5,0 + + + + + 6,5 + + + + + 7,0 + + + + + 8,0 + + + + + 9,0 + + + + + + + + + + + + + + + 15 + + + + + 20 + + + + + 25 + + + + + Khả Lactose + + + + + lên men Glucose + + + + + đường Maltose ± - ± ± - Galactose + + + + + Mannitol - - - - - Saccarose + + + + + Xylose - - - - - pH %NaCl Chú thích: + phát triển tốt, - không phát triển, ± lên men yếu Trần Thị Tiến 48 Lớp: 1102 3.4 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.4.1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Các chủng vi khuẩn sinh trưởng tăng sinh khối mạnh môi trường có chất hữu phức tạp Tiến hành tăng sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn môi trường MRS với hàm lượng glucose 2%, thay đường glucose loại đường khác saccarose, lactose, xylose Để lựa chọn nguồn cacbon thích hợp, có khả sinh hương tạo sinh khối nhanh, khảo sát phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn loại môi trường 1, 2, 3, (môi trường 1: 2% đường glucose, môi trường 2: 2% saccarose, môi trường 3: 2% lactose, môi trường 4: 2% xylose) bổ sung muối 25% NaCl, quan sát phát triển chủng thời gian lên men 40 Sau lấy mẫu xác định mật độ sinh khối tế bào Các chủng vi khuẩn nuôi cấy bình tam giác lên men có chứa 100ml dịch, nhiêt độ nuôi cấy 350C, pH ban đầu 7,0 tốc độ lắc 150 rpm Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn đánh giá thông qua số OD620nm thời điểm khác trình nuôi cấy Số liệu nghiên cứu nêu bảng 3.8 cho thấy chủng vi khuẩn sinh trưởng phát triển tốt môi trường có chứa hàm lượng đường glucose, phát triển tương đối tốt môi trường có chứa saccarose lactose, phát triển yếu môi trường có chứa xylose Do đó, lựa chọn môi trường (môi trường có chứa glucose) Sinh khối tăng dần theo thời gian nuôi cấy, mật độ tế bào đạt cao sau 32 – 36 nuôi cấy Trần Thị Tiến 49 Lớp: 1102 Bảng 3.8: Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn Khả sinh trưởng Thời gian (h) 0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h MF1 0,45 0,50 0,65 1,35 1,50 1,76 2,25 2,48 2,65 2,78 2,68 trường MF5 0,35 0,40 0,50 1,25 1,45 1,70 2,28 2,45 2,62 2,70 2,60 MF6 0,41 0,45 0,55 1,25 1,44 1,68 2,15 2,40 2,59 2,72 2,60 MF8 0,31 0,45 0,48 1,28 1,45 1,69 2,16 2,42 2,62 2,73 2.62 MF18 0,32 0,40 0,45 1,20 1,40 1,70 2,10 2,38 2,60 2,68 2,55 MF1 0,40 0,45 0,50 1,25 1,48 1,68 2,17 2,40 2,62 2,75 2,60 trường MF5 0,30 0,35 0,45 1,20 1,40 1,65 2,12 2,30 2,55 2,70 2,60 MF6 0,40 0,42 0,45 1,25 1,42 1,60 2,20 2,35 2,52 2,65 2,50 MF8 0,35 0,40 0,44 1,24 1,43 1,62 2,19 2,36 2,54 2,65 2,55 MF18 0,35 0,45 0,55 1,30 1,46 1,65 2,24 2,32 2,55 2,60 2,50 MF1 0,25 0,32 0,35 0,53 0,76 0,95 1,20 1,46 1,60 1,87 1,83 trường MF5 0,20 0,25 0,31 0,47 0,69 0,87 1,19 1,38 1,55 1,76 1,74 MF6 0,19 0,22 0,30 0,41 0,65 0,81 1,18 1,34 1,53 1,70 1,70 MF8 0,17 0,20 0,25 0,37 0,58 0,82 1,03 1,35 1,58 1,78 1,75 MF18 0,15 0,19 0,25 0,34 0,48 0,71 0,96 1,21 1,42 1,68 1,64 MF1 0,25 0,30 0,34 0,50 0,74 0,91 1,24 1,45 1,63 1,85 1,80 trường MF5 0,18 0,26 0,30 0,46 0,67 0,85 1,20 1,40 1,60 1,81 1,78 MF6 0,20 0,25 0,29 0,39 0,60 0,84 1,22 1,40 1,58 1,79 1,75 MF8 0,16 0,21 0,26 0,36 0,61 0,80 1,19 1,38 1,60 1,80 1,75 MF18 0,15 0,21 0,24 0,35 0,58 0,78 1,15 1,37 1,55 1,78 1,76 (OD620nm) Môi Môi Môi Môi Sau 40 giờ, mật độ tế bào vi khuẩn không tăng bắt đầu giảm Điều hàm lượng môi trường dinh dưỡng môi trường nuôi cấy cạn kiệt tế bào bắt đầu chết thiếu dinh dưỡng kết thể hình 3.3 Trần Thị Tiến 50 Lớp: 1102 Biểu đồ sinh trưởng chủng OD (620nm) 2.7 2.2 MF1 1.7 MF5 MF6 1.2 MF8 MF18 0.7 0.2 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian nuôi cấy (h) Hình 3.3: Biểu đồ sinh trưởng chủng vi khuẩn trình nhân sinh khối 3.4.2 Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Nhiệt độ yếu tố quan trọng trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Mỗi loài vi khuẩn có giới hạn nhiệt độ thích hợp cho trình sinh trưởng Nghiên cứu tìm nhiệt độ thích hợp với trình sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn có ý nghĩa quan trọng để nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối Nghiên cứu phát triển chủng vi khuẩn môi trường MRS bổ sung 25% muối NaCl Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ đến sinh trưởng vi khuẩn thực mức nhiệt độ nuôi cấy khác nhau: 300C,350C, 400C 450C Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn đánh giá qua số OD dịch nuôi cấy bước sóng 620nm, thể bảng 3.9 Trần Thị Tiến 51 Lớp: 1102 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn Nhiệt độ 30 C 350C 400C 450C Khả sinh trưởng (OD620nm) Chủng 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 32h 36h 40h MF1 0,51 0,70 0,94 1,24 1,58 1,91 2,10 2,27 2,51 2,45 MF5 1,40 1,47 1,54 1,67 1,72 1,85 1,94 2,22 2,37 2,30 MF6 1,48 1,55 1,60 1,76 1,81 1,95 2,05 2,10 2,30 2,23 MF8 0,74 0,89 1,06 1,21 1,37 1,50 1,69 1,82 2,10 2,07 MF18 0,50 0,55 0,84 1,05 1,31 1,52 1,78 1,95 2,17 2,10 MF1 0,50 0,72 1,30 1,48 1,70 2,18 2,40 2,62 2,70 2,60 MF5 1,45 1,56 1,60 1,74 1,80 1,96 2,05 2,15 2,24 2,20 MF6 1,52 1,60 1,68 1,82 1,85 2,09 2,16 2,28 2,32 2,28 MF8 0,75 1,10 1,45 1,58 1,76 1,95 2,23 2,37 2,45 2,40 MF18 0,45 0,62 1,27 1,46 1,74 2,00 2,35 2,57 2,65 2,61 MF1 0,50 0,65 1,20 1,32 1,48 1,42 1,90 2,15 2,35 2,30 MF5 1,35 1,40 1,51 1,55 1,67 1,79 1,91 2,00 2,10 1,97 MF6 1,46 1,57 1,60 1,72 1,79 1,86 2,00 2,08 2,15 2,00 MF8 0,75 0,86 0,90 0,97 1,26 1,40 1,65 1,73 1,95 1,91 MF18 0,46 0,50 0,87 0,92 1,34 1,50 1,75 1,86 2,05 2,00 MF1 0,42 0,58 0,75 0,96 1,25 1,50 1,76 1,85 1,95 1,90 MF5 1,30 1,45 1,48 1,58 1,65 1,76 1,85 1,92 1,92 1,90 MF6 1,40 1,55 1,60 1,68 1,78 1,86 1,95 2,00 1,97 1,90 MF8 0,76 0,85 0,94 0,96 1,15 1,37 1,58 1,70 1,90 1,87 MF18 0,30 0,45 0,68 0,80 1,20 1,28 1,35 1,65 1,86 1,80 Từ kết nghiên cứu bảng 3.9 cho thấy chủng vi khuẩn có khả phát triển nhiệt độ 30 ÷ 450C Các chủng phát triển mạnh nhiệt độ 350C, số OD620nm đạt cao (chỉ số OD lúc = 2,70) khoảng 32 – 36 nhân sinh khối Ở nhiệt độ môi trường nuôi cấy 40-450C chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng, nhiên khả sinh trưởng giảm so với nhiệt độ 350C Chủng MF1 Trần Thị Tiến 52 Lớp: 1102 số OD cao 2,70 sinh khối thu lúc 2g/l, chủng MF5 số OD cao 2,37 sinh khối thu lúc 1,65 g/l, chủng MF6 số OD cao 2,32 sinh khối thu lúc 1,6 g/l, chủng MF8 số OD cao 2,45 sinh khối thu lúc 1,7 g/l chủng MF18 số OD cao 2,65 sinh khối thu lúc 1,8 g/l Do đó, chọn điều kiện nhiệt độ 350C để nuôi cấy nhân sinh khối chủng vi khuẩn 3.4.3 Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho chủng vi khuẩn tuyển chọn Trong trình nuôi cấy, chủng vi khuẩn sinh trưởng mạnh, sinh khối tế bào tăng nhanh, làm tăng lượng axit lactic dịch nuôi cấy, làm giảm pH môi trường Khi hàm lượng axit lactic tích lũy nhiều dịch nuôi cấy, gây ức chế trình sinh trưởng tế bào Để lựa chọn pH môi trường ban đầu tối ưu cho phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn môi trường MRS bản, nhiệt độ nuôi cấy 350C, pH ban đầu với mức khác nhau: 6,0; 6,5 7,0 (dựa theo nghiên cứu M.P Zacharof cs) [10] Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn nghiên cứu đánh giá thông qua theo dõi mật độ tế bào (OD620nm) thời gian nuôi cấy khác (bảng 3.10) Trần Thị Tiến 53 Lớp: 1102 Bảng 3.10: Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn lựa chọn Thời Khả sinh trưởng (OD620nm) gian (h) pH ban đầu 6,0 pH ban đầu 6,5 pH ban đầu 7,0 MF1 MF5 MF6 MF18 MF1 MF5 MF6 MF18 MF1 MF5 MF6 MF18 0,55 0,45 0,48 0,45 0,55 0,45 0,48 0,45 0,55 0,45 0,48 0,45 0,64 0,56 0,60 0,62 0,74 0,60 0,63 0,65 0,68 0,60 0,62 0,60 12 1,24 0,98 1,15 1,19 1,35 1,26 1,25 1,20 1,30 0,102 1,18 1,15 16 1,45 1,32 1,40 1,42 1,46 1,45 1,50 1,48 1,40 1,41 1,45 1,44 20 1,62 1,50 1,56 1,58 1,65 1,75 1,70 1,65 1,55 1,56 1,60 1,50 24 1,90 1,61 1,72 1,65 2,10 2,10 2,25 2,09 2,04 1,64 1,73 1,75 28 2,15 1,70 1,90 1,96 2,46 2,25 2,45 2,40 2,45 1,75 2,04 1,98 32 2,40 1,84 2,15 2,10 2,64 2,50 2,65 2,55 2,52 1,92 2,15 2,18 36 2,45 1,91 2,40 2,25 2,65 2,66 2,70 2,70 2,60 2,06 2,40 2,39 40 2,45 1,90 2,40 2,20 2,60 2,58 2,60 2,65 2,58 2,08 2,40 2,36 Nhìn vào bảng 3.10 cho thấy, chủng vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng tốt pH = 6,5 Sau 36 giờ, mật độ tế bào đạt cao (OD620nm= 2,66÷ 2,70), pH lúc 2,70 Chủng MF1 số OD cao 2,65 sinh khối thu lúc 1,95 g/l, chủng MF5 số OD cao 2,66 sinh khối thu lúc 1,95 g/l, chủng MF6 số OD cao 2,70 sinh khối thu lúc g/l, chủng MF18 số OD cao 2,70 sinh khối thu lúc g/l Khả sinh trưởng chủng vi khuẩn môi trường có pH = 6,0 7,0 giảm so với pH = 6,5, nhiên sai khác không nhiều Vì vậy, lựa chọn pH = 6,5 để nhân sinh khối chủng vi khuẩn Trần Thị Tiến 54 Lớp: 1102 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chúng tuyển chọn chủng vi khuẩn tổng số 38 chủng vi khuẩn nghiên cứu Kết lựa chọn chủng MF1, MF5, MF6, MF8, MF18 chủng có khả tạo hương cho nước mắm dựa đặc tính sau: 1.1 Khả lựa nồng độ muối cao 25% NaCl 1.2 Các chủng lựa chọn có khả thủy phân protein cá với hoạt tính thủy phân cao như: - Mẫu MF1: 19,8% - Mẫu MF5: 18,5% - Mẫu MF6: 19,1% - Mẫu MF8: 15,6% - Mẫu MF18: 16,5% 1.3 Các chủng lựa chọn có hoạt tính aminopeptitdase cao, phân cắt chuyển hóa hợp chất cao phân tử thành hợp chất thấp phân tử, tạo thành amino axit tiền chất tạo nên loại hương cho nước mắm 1.4 Xác định nhóm có ảnh hưởng tạo hương cho sản phẩm nhóm Rượu, aldehyt, este keton nhóm rượu phát ngưỡng lớn nên khó nhận biết mùi Hợp chất 2-methylpropanal, 2-methylbutanal, 3methylbutanal thuộc nhóm aldehyt nhóm mạch nhánh nhóm phát ngưỡng thấp, benzaldehyde có nguồn gốc từ axit amin thơm (phenylalanine) tạo nên mùi hạnh nhân 1.5 Xác định nguồn cacbon sử dụng glucose 20g/l cho nghiên cứu 1.6 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp pH=6,5, nhiệt độ lên men thích hợp 350C, thời gian lên men từ 32- 36 Trần Thị Tiến 55 Lớp: 1102 KIẾN NGHỊ Do khả sinh hương chủng vi khuẩn có tính ứng dụng cao công nghệ chế biến nước mắm, muốn đề xuất hướng nghiên cứu tiếp theo: - Nghiên cứu thêm khả sinh hương chủng vi khuẩn - Nghiên cứu thêm phối hợp chủng cho khả tổng hợp hương đạt chất lượng tốt Trần Thị Tiến 56 Lớp: 1102 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tập 2, 1976 [2] Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn, Thành phần axit amin chất bay có số loại nước mắm thương mại Việt Nam, Tạp chí Khoa học Phát triển 2013, tập 11, số 7: 1030-1036 [3] PTS Nguyễn Đức Lượng, Thực phẩm lên men truyền thống, Công nghệ vi sinh vật, tập [4] Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, Các phương pháp phân tích ngành Công nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 2005 [5] Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nhà xuất giáo dục, 2003 B Tài liệu tiếng Anh [6] James G., Cappuccino, Natalie Sheraman, Microbiology a laboratory manual, 311-313, 1986 [7] Jong Oh Lee, Jin Young Kim, Development of Cultural Context Indicator of Fermented Food, International Journal of Bio-Science and Bio-Technology Vol 5, No 4, August, 2013 [8] Jung-Nim Park, Yuki Fukumoto, Eriko Fujita, Tadayoshi Tanaka, Takuya Washio, Soichiro Otsuka, Tetsuji Shimizu, Katsuko Watanabe, Hiroki Abe, Chemical Composition of Fish Sauces Produced in Southeast and East Asian Countries, Journal of Food Composition and Analysis (2001) 14, 113-125, doi: 10.1006/jfca, 2000.0963 Trần Thị Tiến 57 Lớp: 1102 [9]Manual for analysis of meat and meat products & fish and fish products, Food safety and standards authority of India, ministry of health and family welfare, government of India, New Delhi, 2012 [10] M.P.Zacharof, R.W.Lovitt, K.Ratanapongleka, Deverlopment of a suitable growth strategy for intensvive propagation and lactic acid production of selected strains of Lactobacilli,8th Green Chemistry conference, an international event Zaragora- Spain, 2009 [11] Natteewan Udomsil, Role of lactic acid bacteria on chemical compositions of fish sauce, Suranaree University of technology academic year 2008 [12] Nawaporn Lapsongphon, Keith R Cadwallader, Sureelak Rodtong, Jirawat Yongsawatdigul, Characterization of Protein Hydrolysis and Odor-Active Compounds of Fish Sauce Inoculated with Virgibacillus sp SK37 under Reduced Salt Content, Journal of agricultural and food chemistry 2013, 61, 6604−6613 Trần Thị Tiến 58 Lớp: 1102 PHỤ LỤC Hình 3.4 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Staphylococcus sp (MF1) Hình 3.5 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Lactobacillus (MF5) Trần Thị Tiến 59 Lớp: 1102 Hình 3.6 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Lactobacillus (MF6) Hình 3.7 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Pediococcus (MF8) Trần Thị Tiến 60 Lớp: 1102 Hình 3.8 Phổ đồ sắc ký đồ chủng Pediococcus halophilus (MF18) Trần Thị Tiến 61 Lớp: 1102 [...]... trong các khoảng thời gian khác nhau, từ đó xác định được điều kiện nhiệt độ tối ưu cho chủng vi khuẩn phát triển Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua chỉ số OD620nm ở các thời điểm khác nhau trong quá trình nuôi cấy Nghiên cứu xác định pH thích hợp cho các chủng vi khuẩn Nuôi vi khuẩn lần lượt trên các nồng độ pH ban đầu từ 6,0÷ 7,0 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn. .. nhân sinh khối các chủng vi khuẩn Lựa chọn môi trường thích hợp Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lần lượt trên các môi trường MRS có bổ sung glucose, lactose, xylose, saccarose Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua chỉ số OD620nm ở các thời điểm khác nhau trong quá trình nuôi cấy Nghiên cứu xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn Nuôi vi khuẩn lần lượt ở các. .. Tiến 12 Lớp: 1102 1.3 VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM 1.3.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn trong sản xuất nước mắm[ 11] Nước mắm là loại nước chấm có hàm lượng muối cao, vì vậy đa số các vi sinh vật phát triển trong nước mắm là những loài chịu muối Vi khuẩn ưa mặn được tìm thấy trong nước mắm có thể được phân loại theo khả năng chịu mặn như: vi khuẩn hơi ưa mặn, ưa mặn vừa và cực... hợp cho chủng vi khuẩn 2.2.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn a Xác định khả năng sinh trưởng bằng chỉ số mật độ quang – OD/620 [4], [5] Đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy bằng số mật độ tế bào, thông qua giá trị OD (sử dụng chỉ số bước sóng 620nm – OD/620) để đo mật độ tế bào, và kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn. .. 1102 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Phương pháp tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh hương ở nồng độ muối cao Hút 0,5ml dịch mẫu vào ống nghiệm có chứa môi trường MRS bổ sung lần lượt nồng độ muối 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% Sau đó đem nuôi ở nhiệt độ 320C trong 24 giờ Dựa vào khả năng sinh trưởng của các chủng trên các nồng độ muối khác nhau sẽ lựa chọn được... 1102 catalase 2H2O2 2H2O + O2 Nuôi cấy các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên môi trường thạch sau 36 giờ Các mẫu đối chứng không bổ sung H2O2 3%, mẫu thí nghiệm được nhỏ 2ml H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc Vi khuẩn sinh catalase, khi cho H2O2 vào khuẩn lạc, các vi khuẩn có bọt khí (oxy) thoát ra – catalase dương tính, vi khuẩn không có khả năng tạo catalase, không có bọt khí thoát ra – catalase âm tính 2.2.1.3... vào từng loại cá mà chúng có ảnh hưởng tới sản phẩm của nước mắm Hầu hết các protein trong cá đều được thủy phân thành các peptit mạch ngắn và các axit amin, ngoại trừ mô liên kết và cơ xương Hương thơm của nước mắm chủ yếu từ vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí Nhóm bào tử hiếu khí ưa mặn là các vi sinh vật chiếm ưu thế trong nước mắm Các nghiên cứu trước đây đã xác định được các vi sinh vật sau đây từ mẫu... phần tạo hương thơm có mùi pho mát (Ishikawa và cs, 2006) Tuy nhiên, vi c sử dụng các vi khuẩn lactic như một môi trường khởi động cho quá trình lên men nước mắm chưa được báo cáo Trần Thị Tiến 5 Lớp: 1102 Các vi khuẩn lactic ưa mặn có thể phát triển trên môi trường có nồng độ muối NaCl cao > 18% (Holt và cs, 1994) Các chủng vi khuẩn lactic ưa mặn như Tetragenococcus đã được tìm thấy trong nước mắm và... tạo nên mùi hương đặc trưng của mắm, trong đó có 4 hợp chất như Katsuya Fukami đã đưa ra Ở Vi t Nam, Phạm Thị Thu Thủy và Trần Thu Hương, 2005, cũng đã nghiên cứu nâng cao thành phần các hợp chất bay hơi trong quá trình lên men nước mắm ngắn ngày bằng cách bổ sung enzym Neutrase, 3 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium Kết quả cho thấy hương nước mắm được cải thiện rõ rệt, cả 3 chủng vi khuẩn này hoạt... mùi thơm và hương vị được phát triển hoàn chỉnh (Saisithi, 1994) Vì vậy, vi khuẩn lactic ưa mặn được tìm thấy trong nước mắm có vai trò quan trọng trong sự phát triển hương thơm và mùi vị của nước mắm Các vi sinh vật tồn tại trong nước mắm được chia như sau: Dựa trên chức năng: • Nhóm vi sinh vật thủy phân protein: Bacillus sp, Halobacterium salinarium, Halobacterium cutirubrum • Nhóm vi sinh vật phát