Khái niệm phân hữu cơ vi sinh
Phân hữu cơ vi sinh là loại phân bón được sản xuất từ việc pha trộn và xử lý nguyên liệu hữu cơ, sau đó trải qua quá trình lên men Loại phân này chứa hơn 15% chất hữu cơ và có chứa nhiều vi sinh vật sống với mật độ trung bình từ ≥ 1×10^6 CFU/mg Công dụng của phân hữu cơ vi sinh không chỉ cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho cây trồng mà còn giúp đất chống lại mầm bệnh, cải tạo và nâng cao độ phì nhiêu cũng như tăng lượng mùn trong đất.
Phân bón hữu cơ vi sinh vật, hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh, là sản phẩm từ nguyên liệu hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng và cải tạo đất Sản phẩm này chứa nhiều chủng vi sinh vật sống được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn, giúp nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Đặc biệt, phân hữu cơ vi sinh không gây hại cho con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
Trong sản xuất phân bón sinh học, việc khai thác hoạt động của vi sinh vật (VSV) tự nhiên hoặc từ chế phẩm vi sinh là rất quan trọng để chuyển hóa các chất hữu cơ khó hấp thu thành dinh dưỡng dễ hấp thu cho cây trồng Các VSV trong quá trình ủ phân bón đóng vai trò chủ yếu trong việc phân giải cellulose, tinh bột, xylan, pectin và protein Đồng thời, các chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ và phân giải phosphat khó tan cũng rất cần thiết Nghiên cứu và tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân giải chất thải rắn nông nghiệp sẽ mang lại nhiều lợi ích, bao gồm việc tăng tốc độ phân giải chất thải thành phân bón hữu cơ vi sinh, cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho cây trồng, và giảm ô nhiễm môi trường nông thôn cũng như phát thải khí nhà kính Do đó, việc nghiên cứu các chủng vi sinh vật phân giải cellulose mạnh để sản xuất phân hữu cơ từ chất thải rắn nông nghiệp là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng.
Vai trò của vi sinh vật phân giải chất hữu cơ
Phân hủy sinh học là quá trình thiết yếu giúp loại bỏ chất ô nhiễm khỏi đất và môi trường Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc khắc phục môi trường bị ô nhiễm.
Phân hủy sinh học là quá trình phân hủy chất hữu cơ ô nhiễm nhờ hoạt động của vi sinh vật, trong đó các chất ô nhiễm trở thành nguồn thức ăn cho chúng Quá trình này bao gồm nhiều bước phân giải, dẫn đến sự oxy hóa của hợp chất gốc và tạo ra năng lượng Nguồn carbon có thể là đường đơn giản như glucose hoặc các hợp chất phức tạp như cellulose, tinh bột, xylan, pectin, hemicellulose, protein và các chất ô nhiễm phân tử Mỗi bước trong quá trình chuyển hóa này đều được xúc tác bởi enzyme đặc hiệu do tế bào vi sinh vật sản sinh.
Enzym thường được sản xuất và giải phóng khỏi tế bào, gọi là enzym ngoại bào, đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải các đại phân tử như cellulose, pectin, tinh bột và protein Những đại phân tử này cần được cắt thành các tiểu đơn vị nhỏ hơn bên ngoài tế bào để chúng có thể được vận chuyển vào bên trong Sự thiếu hụt hoặc vắng mặt của các enzyme phân hủy sinh học thích hợp là nguyên nhân phổ biến dẫn đến sự tồn lưu của các chất ô nhiễm hữu cơ.
1.2.1 Vi sinh vật phân giải các chất hữu cơ
Cellulose và pectin là các chất không hòa tan và khó phân giải, đòi hỏi vi sinh vật (VSV) có hệ enzyme cellulase, hemicellulase và pectinase để phân hủy Trong tự nhiên, nhiều nhóm VSV có khả năng phân giải các hợp chất này nhờ hệ enzyme ngoại bào Đặc biệt, vi nấm nổi bật với khả năng phân giải mạnh mẽ, vì chúng tiết ra một lượng lớn enzyme với đầy đủ các thành phần cần thiết Các vi nấm có hoạt tính phân giải cellulose, hemicellulose và pectin đáng chú ý.
Tricoderma là một chi nấm sống hoại sinh chủ yếu trong đất, có khả năng phân hủy hiệu quả các chất hữu cơ Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy tàn dư thực vật, góp phần chuyển hóa một lượng lớn chất hữu cơ trong môi trường Ngoài ra, Tricoderma còn phát triển trên tre, nứa và gỗ, tạo thành lớp mốc màu xanh, gây hại cho các vật liệu này.
Tricoderma và nhiều giống nấm khác như Aspergillus, Fusarium, Mucor có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ mạnh mẽ hơn so với vi khuẩn, do vi khuẩn thường tiết ra ít enzyme và không đầy đủ thành phần enzyme cần thiết Trong đất, một số loài vi khuẩn có khả năng tiết ra đầy đủ enzyme trong hệ enzyme phân giải cellulose, hemicellulose và pectin, trong đó nhóm vi khuẩn hiếu khí như Bacillus, Pseudomonas, Cellulomonas và Achromobacter phân giải tốt các hợp chất saccharide Ngược lại, nhóm vi khuẩn kỵ khí như Clostridium và vi khuẩn trong dạ cỏ của động vật nhai lại thuộc chi Ruminococcus cũng có khả năng phân hủy các hợp chất này Ngoài ra, xạ khuẩn cũng đóng vai trò trong quá trình phân hủy Các chủng vi khuẩn và vi nấm này thường được sử dụng để phân hủy rác thải sinh hoạt hiệu quả.
Các vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột và protein dễ dàng hơn so với cellulose, hemicellulose và pectin, vì tinh bột và protein cung cấp nguồn carbon và năng lượng cần thiết Chúng sử dụng enzym ngoại bào để thủy phân các nguồn thức ăn này, hấp thu oligosacarit và peptit ngắn vào tế bào, sau đó tiếp tục phân hủy thành glucose và axit amin.
Vi sinh vật phân giải tinh bột và protein đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp, bao gồm công nghệ sinh học, thực phẩm, dệt may, công nghiệp giấy và xử lý môi trường Các vi sinh vật này, chủ yếu là vi khuẩn và nấm, có khả năng phân giải tinh bột và protein một cách hiệu quả.
Các loài nấm mốc như Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Thermomyces lanuginosus và Penicillium expansum, cùng với nhiều loài thuộc chi Mucor và Trichoderma, sản sinh hàm lượng amylase và protease cao Trong số vi khuẩn, Bacillus spp và các chi liên quan như B cereus, B circulans, B subtilis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B stearothermophilus và Clostridium thermosulfurogenes cũng tạo ra nhiều enzyme ngoại bào, đặc biệt là amylase và protease, có ý nghĩa quan trọng trong ngành công nghiệp Ngoài ra, các chi Lactobacillus được lựa chọn nhờ khả năng tổng hợp α-amylase và protease ngoại bào với số lượng lớn Nhiều loại vi khuẩn dạ cỏ cũng có khả năng sử dụng tinh bột làm chất nền tăng trưởng, có mặt với số lượng đủ để có ý nghĩa định lượng trong quá trình lên men.
Bacteroides ruminicola, Ruminobacter amylophilus, Butyrivibrio fibrisolvens, Selenomonas ruminantium và Streptococcus bovis… [20, 21]
1.2.2 Vai trò của vi sinh vật cố định Nitơ (N 2 )
Trong không khí, có nhiều phân tử nitơ (N2), nhưng hầu hết sinh vật không thể sử dụng nguồn này Chỉ một số vi sinh vật (VSV) có khả năng hấp thụ N2 và chuyển đổi nó thành nitơ trong các hợp chất như protein và sản phẩm thủy phân protein Quá trình này được gọi là sự cố định nitơ phân tử.
Vi sinh vật cố định nitrogen sống tự do, không cộng sinh, bao gồm nhiều loại vi khuẩn, nấm và tảo Trong số đó, các loài thuộc chi có vai trò quan trọng nhất trong quá trình cố định nitrogen.
Azotobacter và loài Clostridium pasteurianum
Azotobacter là vi khuẩn cố định nitơ sống tự do, hiếu khí và không có bào tử Loại vi khuẩn này đã được nhà vi sinh vật học Hà Lan Beijerinck phân lập và nuôi cấy thuần khiết từ năm 1901 Một trong những đại diện tiêu biểu của chi Azotobacter là Azotobacter chroococcum.
Ngoài Azotobacter, các vi sinh vật cố định nitơ (N2) còn bao gồm một số vi khuẩn thuộc chi Clostridium, Bacillus và Azotomonas, cùng với nấm thuộc các chi Phoma, Macroporum, Cladosporum, Trichoderma và một số loài tảo Tuy nhiên, hiệu quả cố định N2 của những loài này thường thấp hơn so với Azotobacter.
Hiện nay, việc sử dụng phân đạm vô cơ không chỉ tốn kém mà còn gây ô nhiễm đất Do đó, ứng dụng vi sinh vật như một tác nhân sinh học có lợi trong sản xuất nông nghiệp đang trở thành xu hướng tiềm năng, phát triển thành công nghệ vi sinh trên toàn cầu.
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng chế phẩm vi sinh vật có khả năng nâng cao hiệu quả sử dụng phân bón, giảm thiểu thuốc hóa học bảo vệ thực vật và đóng góp tích cực vào nền nông nghiệp bền vững Tại Việt Nam, phương pháp sản xuất hiệu quả thường bao gồm việc tạo giống từ các phòng thí nghiệm và chuyển giao trực tiếp cho các cơ sở sản xuất để nhân giống trong môi trường đơn giản.
1.2.3 Vai trò của vi sinh vật phân giải lân khó tan
Tình hình nghiên cứu sản xuất phân bón hữu cơ trên thế giới
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sản xuất và sử dụng phân bón hữu cơ mang lại nhiều lợi ích, bao gồm việc tăng năng suất cây trồng và giảm ô nhiễm môi trường Ngoài ra, việc tận dụng các phế phụ phẩm nông nghiệp cũng được chứng minh là một phương pháp hiệu quả trong nông nghiệp bền vững.
Chandramohan Marimuthu và cộng sự đã nghiên cứu việc sử dụng chất thải hữu cơ và phân bón để sản xuất phân bón sinh học hiệu quả tại quận Tiruchirapalli, Nam Ấn Độ Nghiên cứu cho thấy sản xuất phân bón hữu cơ từ chất thải nông nghiệp là phương pháp đơn giản, giúp giảm chi phí sản xuất, vận chuyển và lao động Sau 120 ngày ủ, phân hữu cơ được áp dụng trong trồng cây cho kết quả tích cực: cây phát triển khỏe mạnh, kháng bệnh và có khả năng chịu áp lực gió tốt Hơn nữa, phân bón này còn góp phần tăng cường độ phì nhiêu cho đất sau khi thu hoạch.
Nghiên cứu của Soh-Fong Lim chỉ ra rằng phân bón sinh học được sản xuất từ phế phụ phẩm của một số loại quả thông qua quá trình lên men rắn Phân hữu cơ này có giá trị pH, hàm lượng kali, nitơ và các chất dinh dưỡng cao, khi áp dụng trong trồng rau, cho thấy rau đạt trọng lượng sinh khối tươi, chiều cao và chiều dài rễ vượt trội hơn so với việc sử dụng phân hóa học.
Vidhya Devi và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ từ phế phụ phẩm rau quả như dưa hấu, ổi, đu đủ, dứa, na thông qua quá trình lên men rắn kết hợp với các chủng vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và nấm men Kết quả cho thấy, việc sử dụng phân bón hữu cơ này đã mang lại hiệu quả cao trong việc nảy mầm hạt và ngăn chặn bệnh của rễ.
Nghiên cứu của tác giả Christian O Asadu và cộng sự đã so sánh hiệu quả của phân bón sinh học, được sản xuất từ chất thải nông nghiệp như bùn thải và mùn cưa kết hợp với chế phẩm vi sinh Actinomyces, với phân bón hóa học trên đồng ruộng trồng ngô Kết quả cho thấy phân bón sinh học đã thúc đẩy sự phát triển của cây ngô vượt trội hơn so với phân hóa học.
Tình hình nghiên cứu sản xuất phân bón hữu cơ ở Việt Nam
Việt Nam, với nền nông nghiệp phát triển, sản sinh ra một lượng lớn và đa dạng phế thải sau thu hoạch Chương trình 1 triệu tấn đường để lại hàng trăm ngàn tấn bã mía, mùn mía và các tàn dư từ quá trình sản xuất đường Ngành chế biến xuất khẩu cà phê thải ra hơn 200.000 tấn vỏ mỗi năm Trên cánh đồng, hàng triệu tấn phế thải như rơm rạ, lõi ngô, cây sắn và thân lá thực vật cũng được bỏ lại Thêm vào đó, hàng triệu tấn rác thải sinh hoạt cũng góp phần gây ô nhiễm môi trường và nguồn nước Nguồn phế thải này chủ yếu bị đốt hoặc trở thành rác thải, dẫn đến ô nhiễm nghiêm trọng, trong khi đất đai lại thiếu dinh dưỡng cho cây trồng, khiến Việt Nam phải chi hàng chục triệu USD mỗi năm để nhập khẩu phân hóa học.
Từ lâu, việc nghiên cứu xử lý các phế thải nông nghiệp thành phân bón đã được các nhà khoa học nghiên cứu sản xuất và ứng dụng
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương và cộng sự đã chứng minh rằng việc áp dụng công nghệ vi sinh để ủ chất thải từ nhà máy sản xuất bia, chế biến thủy hải sản và bùn mía có thể tạo ra phân hữu cơ vi sinh chất lượng cao Phân sau ủ đạt 2,83-2,85% N; 5,6-6,63% P2O5; 2,1-2,11% K2O và 35,21-40,98% C, đồng thời hàm lượng kim loại nặng, mật độ Salmonella và Escherichia coli đều nằm dưới ngưỡng cho phép Mật độ Trichoderma đạt tiêu chuẩn với 7,14x10^7 - 7,82x10^7 CFU/g Đặc biệt, năng suất cây rau tăng đáng kể trong tất cả các thí nghiệm đồng ruộng khi bón 5 tấn/ha phân hữu cơ vi sinh.
Phạm Thị Hà Nhung và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất phân hữu cơ từ lá táo theo quy mô hộ gia đình, xây dựng công thức ủ gồm lá táo, rơm rạ, thân cây ngô, đạm, lân, kali và chế phẩm vi sinh Trichoderma Sau 70 ngày ủ, sản phẩm phân hữu cơ đạt chất lượng cao với đặc điểm tơi xốp, màu đen đặc trưng và hàm lượng dinh dưỡng tốt: 16,221% OC, 1,435% N, 0,256% P2O5, 0,316% K2O, và pH 7,42, phù hợp cho nhiều loại cây trồng Kết quả thử nghiệm trồng rau cải cho thấy cây sinh trưởng tốt hơn so với trồng trên nền đất trắng.
Hồ Bích Liên đã nghiên cứu kết hợp rác thải sinh hoạt và lá cây cao su (Hevea brasiliensis) với chế phẩm sinh học Trichoderma để tạo ra giá thể mới cho nông nghiệp, đồng thời giảm ô nhiễm môi trường Kết quả cho thấy, giá thể được sản xuất từ nguyên liệu rác thải sinh hoạt và lá cây cao su theo tỷ lệ 1:1,5 và bổ sung 2% Trichoderma mang lại hiệu quả tối ưu với hàm lượng đạm tổng đạt 1,68%, đạm dễ tiêu là 0,044%, không nhiễm Coliform, và chi phí sản xuất chỉ 4.250 VNĐ/kg.
Tác giả Nguyễn Thị Thu Thủy đã nghiên cứu và chọn lọc ba chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose mạnh, bao gồm nấm mốc, xạ khuẩn và vi khuẩn Kết quả ủ phế phụ phẩm nông nghiệp với các chủng vi sinh vật này cho thấy khả năng phân giải cellulose rất tốt, giảm 75% cellulose so với đối chứng, đồng thời hàm lượng đạm, lân và kali tổng số đều tăng cao hơn so với mẫu đối chứng.
Nghiên cứu trước đây đã xác định cơ sở lý thuyết và khoa học cho việc ứng dụng biện pháp sinh học trong xây dựng các cơ sở xử lý và tái chế phế thải Những nghiên cứu này không chỉ giúp giảm thiểu ô nhiễm mà còn mở ra hướng đi mới để khắc phục hậu quả của thời đại công nghiệp Hiện nay, nhiều nhà khoa học đang tiếp tục tìm kiếm các chủng vi sinh vật ưu việt nhằm phát triển chế phẩm vi sinh vật hiệu quả cao, phục vụ cho việc thương mại hóa và ứng dụng trong xử lý chất thải quy mô lớn, hướng tới công nghiệp.
MỤC TIÊU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu
Góp phần sản xuất phân hữu cơ vi sinh cho phát triển nông nghiệp hữu cơ
Chúng tôi đã phân lập, tuyển chọn và định danh ba chủng vi sinh vật bản địa có đặc tính hữu ích trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh Các chủng này có khả năng phân giải đa dạng hợp chất hữu cơ, cố định nitơ, phân giải photphate khó tan, sinh tổng hợp IAA và có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh.
- Khảo sát và tối ưu hóa được các yếu tố lên men để thu sinh khối các chủng tuyển chọn
- Tạo được chế phẩm vi sinh vật hữu ích, thử nghiệm chế phẩm vi sinh để sản xuất phân bón và đánh giá được chất lượng của phân bón
Đối tượng nghiên cứu
- Chất thải rắn nông nghiệp
- Các chủng vi sinh vật hữu ích
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật có năng lực phân giải mạnh các hợp chất hữu cơ
Nghiên cứu về việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật hữu ích trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh tập trung vào những vi sinh vật có khả năng cố định nitơ, phân giải phosphat khó tan, sinh tổng hợp IAA và đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh Việc phát triển các chủng vi sinh vật này không chỉ nâng cao hiệu quả của phân bón hữu cơ mà còn góp phần bảo vệ cây trồng, đảm bảo năng suất và chất lượng nông sản.
- Nghiên cứu định tên các chủng vi sinh vật tuyển chọn
- Nghiên cứu khảo sát và tối ưu hóa các thông số lên men thu sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn
- Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh và sử dụng chế phẩm để xử lý chất thải thành phân bón.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp phân lập các chủng vi sinh vật có năng lực phân giải các hợp chất hữu cơ
Tại khu vườn ươm Đại học Lâm Nghiệp – Gia Lai, các mẫu chất thải rắn nông nghiệp như gỗ mục, lá mục và rơm rạ, cùng với mẫu đất đang phân hủy, đã được thu thập Các mẫu này được cân chính xác 1 gram và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến nồng độ 10^-7 đến 10^-8.
Lấy 50 μl dịch, trang đều lên các đĩa petri có chứa môi trường NA (cao nấm men: 3g/l; pepton: 10g/l; NaCl: 10g/l, agar: 15g/l) và môi trường PDA (chiết khoai tây 200g/l; glucose: 20g/l; agar: 15g/l) đã được tiệt trùng để phân lập, các đĩa được nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 35-37 o C trong 24 - 36 giờ với vi khuẩn, 72 - 96 giờ với nấm Chọn những khuẩn lạc vi khuẩn và nấm xuất hiện riêng rẽ trên đĩa thạch để cấy ria và làm thuần trên các đĩa môi trường tương ứng mới [9] Để tuyển chọn các chủng có khả năng chuyển hóa các chất hữu cơ hiệu quả, các khuẩn lạc riêng rẽ được chuyển sang môi trường NA (đối với vi khuẩn) hoặc PDA (đối với nấm), môi trường này được bổ sung 1% đối với các cơ chất tinh bột, CMC, pectin, cazein Sau khi cấy, các đĩa được nuôi trong tủ nuôi ở nhiệt độ 35-37 o C trong 24 – 36 giờ với vi khuẩn, 72 - 96 giờ với nấm
2.4.2 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có các đặc tính phù hợp để sản xuất phân hữu cơ vi sinh a Khả năng sử dụng hiệu quả nguồn cơ chất hữu cơ
Các khuẩn lạc phân lập đã được xác định có hoạt tính sinh enzyme ngoại bào, có khả năng phân giải các cơ chất như tinh bột, CMC, pectin và casein thông qua phương pháp xác định vòng phân giải trên đĩa thạch Những chủng có khả năng phân giải tốt các cơ chất này sẽ được tuyển chọn và lưu giữ để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, bao gồm cả khả năng cố định nitơ.
Chủng được pha loãng trong nước cất vô trùng và được cấy trên môi trường Ashby manitol agar, bao gồm các thành phần như manitol 20g/l, K2HPO4 0,2g/l, MgSO4.7H2O 0,2g/l, NaCl 0,2g/l, K2SO4 0,1g/l, CaCO3 5g/l, agar 15g/l, và nước cất 1000ml với pH 7-7,2 Môi trường này được nuôi ở nhiệt độ 30 độ C trong 72 giờ để lựa chọn các chủng có khả năng phát triển tốt.
Các chủng vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường thạch Ashby được chuyển sang môi trường lỏng Ashby và nuôi lắc ở tốc độ 125 vòng/phút, nhiệt độ 30°C trong 72 giờ Sau đó, ly tâm thu dịch trong và xác định nồng độ NH4+ trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler, sử dụng đường chuẩn amonium.
[42] c Khả năng phân giải phosphate khó tan
Khả năng phân giải Photphate khó tan của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp cấy chấm điểm trên môi trường Pikovskaya’s
Các chủng được nuôi trong môi trường NB lỏng với pH 7, ở nhiệt độ 37°C trong 96 giờ và tốc độ lắc 120 vòng/phút Sau đó, dịch nuôi được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch Cấy chấm điểm vào môi trường Pikovskaya’s và nuôi ở 37°C trong 24 giờ Cuối cùng, đường kính vòng thủy phân Ca3(PO4)2 được đo để xác định khả năng sinh tổng hợp IAA.
Hàm lượng IAA được tạo ra trong dịch lên men vi khuẩn được xác định bằng phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Van Urk Salkowski [27]
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường lỏng với 1% Triptophan, lắc 120 vòng/phút ở 30 độ C trong 72 giờ, trong khi nấm được nuôi trong 120 giờ Hàm lượng IAA thô trong dịch nuôi cấy được xác định qua phản ứng màu với thuốc thử Salkowski, tạo ra sản phẩm màu, sau đó được đo cường độ màu trên máy quang phổ so màu ở bước sóng thích hợp.
Dựa vào đồ thị chuẩn IAA, hàm lượng IAA trong dịch nuôi cấy được xác định thông qua các mẫu có nồng độ IAA khác nhau, với phương trình chuẩn có dạng y = Ax + b Ngoài ra, khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh cũng được xem xét trong nghiên cứu này.
Các chủng tuyển chọn đã được xác định khả năng đối kháng với một số chủng vi khuẩn và nấm bệnh thông qua phương pháp đĩa cấy kép Vi khuẩn và nấm bệnh được cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp, sau đó các chủng tuyển chọn được cấy chấm điểm trên cùng một đĩa môi trường Quá trình nuôi cấy được thực hiện ở nhiệt độ 30-35 độ C trong 48-72 giờ, sau đó tiến hành quan sát hiện tượng đối kháng.
2.4.3 Phương pháp định tên các chủng tuyển chọn
2.4.3.1 Xác định đặc tính chủng
Theo sổ tay phân loại vi sinh vật, việc mô tả hình thái, đặc điểm tế bào và khuẩn lạc, cũng như đặc điểm Gram là cần thiết để xác định tên sơ bộ cho các chủng vi sinh vật.
2.4.3.2 Định tên chủng bằng sinh học phân tử a Định tên vi khuẩn
Phương pháp định tên chủng được thực hiện theo phương pháp mô tả của tác giả Tim Sandle và cộng sự [47]
- Tách DNA tổng số từ vi khuẩn
- Cấy chuyển khuẩn lạc đơn vào 10 ml môi trường LB, lắc 200 v/p, ở
- Ly tâm dịch nuôi ở 5000 v/p trong 5 phút
- Sinh khối thu được hòa vào 1 ml đệm phá tế bào, lắc đều
- Hỗn dịch được ly tâm ở 5000 v/p trong 5 phút
- Tế bào được hoà lại trong 0,4 ml TE và bổ sung lysozym (200
g/ml), trộn đều, ủ ở 37 o C trong 1 giờ, sau đó bổ sung 10 l proteinase K, ủ 80 o C trong 1 giờ
- Tiếp tục bổ sung 600 l phenol/chloroform, trộn đều
- Ly tâm hỗn dịch 13000 v/p trong 5 phút để thu dịch nổi
- Thêm 600 l chloroform/isoamylalcolhol (24:1 v/v) vào dịch nổi, trộn đều và ly tâm 13000 v/p trong 10 phút để thu dịch nổi
- Tủa lại bằng cách bổ sung 50 l Na2CO3 3M và 1 ml ethanol tuyệt đối, trộn đều Ủ hỗn dịch ở -20 o C trong 1 giờ
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút thu DNA tủa, rửa lại DNA bằng 0,5 ml ethanol 70%
- Ly tâm 13000 v/p trong 10 phút thu lại DNA và làm khô DNA bằng máy làm khô mẫu Hoà tan DNA hệ gen trong 50 l nước vô trùng
- Điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số trên gel agarose 1%
- Xác định trình tự chuỗi nucleotid và xử lý số liệu
- Mẫu DNA tổng số của chủng tuyển chọn được gửi đi xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA tại công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa
- Xử lý số liệu chuỗi nucleotid bằng phần mềm BLAST để so sánh trên genbank và xây dựng cây phân loại loài của các chủng b Định tên nấm
DNA tổng số được chiết xuất từ các chủng vi nấm bằng bộ hóa chất QIAamp DNA Mini Kit (#51304, QIAGEN, Hilden, Đức) Sau khi chiết xuất, chất lượng DNA được kiểm tra bằng máy đo quang phổ Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) và điện di trên gel agarose 1%.
Sau đó sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn gen vùng ITS1 - 5,8S - ITS2 của mẫu nấm nội sinh Bộ mồi được sử dụng là mồi
Sản phẩm PCR có độ dài khoảng 600 bp được tạo ra bằng cách sử dụng mồi 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ Hỗn hợp dung dịch PCR được chuẩn bị trong ống 0,2 ml với tổng thể tích 50 µl, bao gồm: 19 µl nước deion khử trùng, 1 µl mồi xuôi và 1 µl mồi ngược (mỗi loại 10 µM), 25 µl Dream Taq PCR master mix 2X và 4 µl mẫu DNA 100 ng.
Mẫu DNA được thêm vào ống là chứng dương để kiểm tra phản ứng PCR, trong khi một ống khác sử dụng nước thay cho DNA làm chứng âm để kiểm tra nhiễm.
Sau khi hoàn tất việc chuẩn bị các phản ứng PCR, ống mix được đưa vào máy luân nhiệt ProFlex PCR System (Thermo Fisher) Chu trình gia nhiệt được thực hiện với các bước: biến tính ở 95°C trong 3 phút, tiếp theo là chu kỳ biến tính ở 95°C trong 15 giây và bắt cặp.
95 o C: 30 s; kéo dài chuỗi 72 o C: 15 s) lặp lại 35 chu kỳ và kéo dài chuỗi 72 o C: 5 phút; kết thúc phản ứng ở 4 o C