Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt .... Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệtError!. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lậpError!. Hoạt
Trang 2n
LỜI CẢM ƠN
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Nguyên Thành, Giám đốc Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện và chỉ bảo cho tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn này
Để có được ngày hôm nay tôi không thể quên được sự dìu dắt tận tình cùng những kiến thức quý báu mà các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học và các thầy
cô trong khoa Sinh học đã truyền dạy cho tôi trong suốt hai năm học tập tại trường
Tôi cũng xin dành tình cảm cho gia đình,bạn bè những người đã ở bên động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua
Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên
Hàn Thị Thu Hương
Trang 4MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 9
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1 Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 10
1.1.1 Lignocellulose 10
1.1.1.1 Cellulose Error! Bookmark not defined
1.1.1.2 Hemicellulose Error! Bookmark not defined
1.1.1.3 Lignin Error! Bookmark not defined
1.1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose Error! Bookmark not defined
1.1.2.1 Cellullase Error! Bookmark not defined
1.1.2.2 Hemicellulase Error! Bookmark not defined
1.1.2.3 Ligninase Error! Bookmark not defined
1.2 Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocelluloseError! Bookmark not defined
1.2.1 Nấm mốc chịu nhiệt Error! Bookmark not defined
1.2.1.1 Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt Error! Bookmark not defined
1.2.1.2 Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biếnError! Bookmark not defined
1.2.2 Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệtError! Bookmark not defined 1.2.2.1 Hoạt tính cellulase Error! Bookmark not defined
1.2.2.2 Hoạt tính xylanase Error! Bookmark not defined
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined 2.1 Đối tượng Error! Bookmark not defined
2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc Error! Bookmark not defined
2.2.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined
2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc Error! Bookmark not defined
2.3 Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứuError! Bookmark not defined
2.3.1 Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicolError! Bookmark not defined 2.3.2 Môi trường PDA Error! Bookmark not defined.
2.3.3 Môi trường lên men lỏng Error! Bookmark not defined
2.3.4 Môi trường YM Error! Bookmark not defined
2.4 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined
2.4.1 Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt Error! Bookmark not defined
Trang 52.4.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào Error! Bookmark not defined
2.4.3 Tách chiết enzyme Error! Bookmark not defined
2.4.4 Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS Error! Bookmark not defined
2.4.5 Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNSError! Bookmark not defined
2.4.6 Điện di protein Error! Bookmark not defined
2.4.6.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE Error! Bookmark not defined
2.4.6.2 Phương pháp điện di Zymogram Error! Bookmark not defined
2.4.7 Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc Error! Bookmark not defined
2.4.8 Phương pháp tinh chế ADN Error! Bookmark not defined
2.4.9 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printingError! Bookmark not defined
2.4.10 Phương pháp điện di ADN Error! Bookmark not defined
2.4.11 Nhuộm gel và đọc kết quả Error! Bookmark not defined
2.4.12 Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬNError! Bookmark not defined
3.1 Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệtError! Bookmark not defined 3.1.1 Kết quả phân lập Error! Bookmark not defined
3.1.2 Hình thái khuẩn lạc, tế bào Error! Bookmark not defined
3.1.3 Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting Error! Bookmark not defined
3.1.4 Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNAError! Bookmark not defined 3.2 Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lậpError! Bookmark not defined
3.2.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocelluloseError! Bookmark not defined
3.2.2 Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignoceluloseError! Bookmark not defined
3.2.3 Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhauError! Bookmark not defined
3.2.4 Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme Error! Bookmark not defined
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined
KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined
KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined
TÀI LIỆU THAM KHẢO 11
Trang 6DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông
nghiệp phổ biến và rác thải
Bảng 1.2 Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của
chúng
Bảng 1.3 Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE Bảng 2.1 Thành phần gel chạy điện di protein
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR fingerprinting
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS
Bảng 3.1 Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được
Bảng 3.2 Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting
Bảng 3.3 Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.4 Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.5 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.6 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Bảng 3.7 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.8 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.9 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng
và 70˚C 20 phút
Bảng 3.10 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng
và 70˚C 20 phút
Trang 7DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose
Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cellulose
Hình 1.3 Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm
Hình 1.4 Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng
Hình 1.5 Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus
Hình 1.6 Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus
Hình 1.7 Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus
Hình 1.8 Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum
Hình 3.1 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 5.1
Hình 3.2 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 5.3
Hình 3.3 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 5.5
Hình 3.4 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 10.4
Hình 3.5 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 112.2
Hình 3.6 Khuẩn la ̣c và tế bào chủng FCH 23.1
Hình 3.7 Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.8 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.9 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
Hình 3.10 Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của 46 chủng nấm
mốc chịu nhiệt
Trang 8DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp: Base pair (cặp bazơ)
CBH: Cellobiohydrolase
CBM: Carbohydrate-binding module
CE: Carbohydrate esterase
CMC: Carboxymethyl cellulose
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
DNS: Dinitrosalicylic acid
EG: Endoglucanase
FPU: Filter paper unit
GH: Glycoside hydrolase
ITS: Internal transcribed spacer
PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase) PDA: Potato Dextrose Agar
SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Trang 9MỞ ĐẦU
Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng, cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch và ô nhiễm môi trường đã chuyển trọng tâm của thế hệ năng lượng theo hướng sử dụng nhiên liệu sinh học với nguyên liệu là chất thải giàu lignocellulose của các ngành lâm nghiệp, công nghiệp giấy và bột giấy, nông nghiệp và thực phẩm, rác thải đô thị rắn
và chất thải động vật Sản xuất nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose, với thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose sẽ tạo tiền đề cho sự phát triển bền vững Mặc dù mang nhiều hứa hẹn, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học từ lignocellulose hiện nay vẫn chưa khả thi trong sản xuất thương mại Vấn đề cốt lõi nằm ở tính bền vững của lignocellulose Với hầu hết các công nghệ hiện hành, lignocellulose trước tiên cần được thủy phân thành các monomer để tạo tiền chất cho chuyển hóa sinh học hoặc hóa học Trong công đoạn này, enzyme thủy phân lignocellulose thường được sử dụng Tuy nhiên, với các hệ enzyme hiện có, quá trình thủy phân chưa thực sự hiệu quả về mặt kinh tế Việc tìm kiếm các hệ enzyme hiệu quả hơn đang được quan tâm đặc biệt
Ngoài ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme thủy phân lignocellulose còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chế biến nông sản, thực phẩm, trong chăn nuôi, công nghiệp giấy, trong sản xuất hóa chất, xử lý môi trường Nội dung của đề tài nằm trong nỗ lực dài hạn nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật nhiệt đới cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, trong trường hợp này là tìm kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mới từ nấm mốc chịu nhiệt, nhóm vi sinh vật rất ít được nghiên cứu tại Việt Nam
Trang 10CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose
1.1.1 Lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó
để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose, hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1.1)[41]
Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010)
Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển
Trang 11TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Hồ Sĩ Tráng (2006), Cơ sở hóa học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản khoa học và kĩ
thuật, Hà Nội
2 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB đại học quốc gia TP Hồ
Chí Minh, TP Hồ Chí Minh
Tiếng Anh
3 Almeida Elzira Maria, Maria de Lourdes T.M Polizeli, Héctor Francisco Terenzi
andJoão Atilio Jorge (1995), “Purification and biochemical characterization
of β-xylosidase from Humicola grisea var thermoidea”, FEMS Microbiology Letters, 130, pp 171–176
4 Anand L, Krishnamurthy S, Vithayathil PJ (1990), “Purification and properties of
xylanase from the thermophilic fungus, Humicola lanuginosa (Griffon and Maublanc) Bunce”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 276(2), pp
546-553
5 Anthi Karnaouri, Evangelos Topakas, Io Antonopoulou, Paul Christakopoulos
(2014), “Genomic insights into the fungal lignocellulolytic system of
Myceliophthora thermophila”, Frontiers in Microbiology, 5: 281
6 Anthony Levasseur, Elodie Drula, Vincent Lombard, Pedro M Coutinho and
Bernard Henrissat (2013), “Expansion of the enzymatic repertoire of the
CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes”, Biotechnology for Biofuels, 6(1), pp 1-2
7 Armand S, Drouillard S, Schülein M, Henrissat B, Driguez H (1997) “A
bifunctionalized fluorogenic tetrasaccharide as a substrate to study
cellulases”, The Journal of Biological Chemistry, 272(5), pp 2709-2713
Trang 128 Baldrian P, Valaskova V (2008), “Degradation of cellulose by basidiomycetous
fungi”, FEMS Microbiology Reviews, 32(3), pp 501–521
9 Bayer EA, Chanzy H, Lamed R, Shoham Y (1998), “Cellulose, cellulases and
cellulosome”, Current Opinion in Structural Biology, 8(5), pp 548–557
10 Bernard Henrissat (1991), ” A classification of glycosyl hydrolases based on
amino acid sequence similarities”, Biochemical Journal, 280, pp 309-316
11 Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1993), “New families in the classification
of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities”,
Biochemical Journal, 293, pp 781-788
12 Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1996), “Updating the sequence-based
classification of glycosyl hydrolases”, Biochemical Journal, 316, pp
695-696
13 Bhat MK, Bhat S (1997), “Cellulose degrading enzymes and their potential
industrial applications”, Biotechnology Advances, 15(3-4), pp 583-620
14 Bhat MK, Bhat S (1998), “Clostridium thermocellum cellulosome: dissociation,
isolation and characterisation of subunits and the potential biotechnological
implications”, Recent Res Devel Biotech Bioeng, 1(1), pp 59-84
15 Bhat MK, Joel Solomon Gaikwad and Ramesh Maheshwari (1993),
“Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase from the
thermophilic fungus Sporotrichum thermophile and its influence on cellulase activity”, General Microbiology, 139, pp 2825–2832
16 Bhat MK, R Maheshwari (1987), “Sporotrichum thermophile: growth, cellulose
degradation, and cellulase activity”, Applied and Environmental Microbiology, 53, pp 2175–2182
17 Boisset C, Fraschini C, Schülein M, Henrissat B, Chanzy H (2000), “Imaging
the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo character of the cellobiohydrolase Cel6A from Humicola insolens and its
Trang 13mode of synergy with cellobiohydrolase Cel7A”, Applied and Environmental Microbiology, 66(4), pp 1444-1452
18 Brandi L Cantarel, Pedro M Coutinho, Corinne Rancurel, Thomas Bernard,
Vincent Lombard and Bernard Henrissat (2009), “The Carbohydrate-Active
EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics”, Nucleic Acids Research, 37, pp 233–238
19 Cai YJ, Chapman SJ, Buswell JA, Chang ST (1999), “Production and
distribution of endoglucanase, cellobiohydrolase, and beta-glucosidase
components of the cellulolytic system of Volvariella volvacea, the edible straw mushroom”, Appl Environ Microbiol, 65(2), pp 553-559
20 Cao WG, Crawford DL (1993), “Purification and some properties of
β-glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius strain SMF”, Canadian Journal of Microbiology, 39(1), pp 125-129
21 Christine S Evans (1985), “Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase)
from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor”, Applied Microbiology and Biotechnology, 22(2), pp 128-131
22 Coutts A D and Smith R E (1976), “Factors influencing the production of
cellulases by Sporotrichum thermophile”, Appl Environ Microbiol, 31(6), pp
819–825
23 Dalia Shallom, Yuval Shoham (2003), “Microbial hemicellulase”, Current
Opinion in Microbiology, 6(3), pp 219–228
24 Dan S, Marton I, Dekel M, Bravdo BA, He S, Withers SG, Shoseyov O (2000),
“Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of
family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase”, J Biol Chem, 275(7), pp
4973-4980