Phân lập và nghiên cứu đặc tính nấm mốc chịu nhiệt có khả năng thủy phân Lignocellulose

Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng Bảng 1.3.Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE Bảng 2.1.. Nội dung của đề tài nằm tron

-

Hàn Thị Thu Hương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU

NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

n

LỜI CẢM ƠN

-

Hàn Thị Thu Hương

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU

NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

PGS TS Vũ Nguyên Thành PGS TS Bùi Thị Việt Hà

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Nguyên Thành, Giám đốc Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện và chỉ bảo cho tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Để có được ngày hôm nay tôi không thể quên được sự dìu dắt tận tình cùng những kiến thức quý báu mà các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học và các thầy

cô trong khoa Sinh học đã truyền dạy cho tôi trong suốt hai năm học tập tại trường Tôi cũng xin dành tình cảm cho gia đình,bạn bè những người đã ở bên động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên

Hàn Thị Thu Hương

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 2

1.1.1 Lignocellulose 2

1.1.1.1 Cellulose 3

1.1.1.2 Hemicellulose 4

1.1.1.3 Lignin 6

1.1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose 7

1.1.2.1 Cellullase 7

1.1.2.2 Hemicellulase 10

1.1.2.3 Ligninase 12

1.2 Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose 13

1.2.1 Nấm mốc chịu nhiệt 13

1.2.1.1 Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt 13

1.2.1.2 Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến 14

1.2.2 Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt 17

1.2.2.1 Hoạt tính cellulase 17

1.2.2.2 Hoạt tính xylanase 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng 21

2.2 Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 21

2.2.1 Hóa chất 21

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 22

2.3 Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 22

2.3.1 Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol 22

2.3.2 Môi trường PDA 22

2.3.3 Môi trường lên men lỏng 23

2.3.4 Môi trường YM 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt 24

2.4.4 Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS 24

2.4.5 Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS 26

2.4.6 Điện di protein 27

2.4.6.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE 27

2.4.6.2 Phương pháp điện di Zymogram 28

2.4.7 Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc 29

2.4.8 Phương pháp tinh chế ADN 29

2.4.9 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing 30

2.4.10 Phương pháp điện di ADN 30

2.4.11 Nhuộm gel và đọc kết quả 31

2.4.12 Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA 31

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt 33

3.1.1 Kết quả phân lập 33

3.1.2 Hình thái khuẩn lạc, tế bào 34

3.1.3 Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 37

3.1.4 Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA 38

3.2 Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập 40

3.2.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose 40

3.2.2 Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocelulose 50

3.2.3 Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau 52

3.2.4 Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

nghiệp phổ biến và rác thải

Bảng 1.2 Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng

Bảng 1.3.Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE Bảng 2.1 Thành phần gel chạy điện di protein

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR fingerprinting

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS

Bảng 3.1 Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được

Bảng 3.2 Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting

Bảng 3.3 Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.4 Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.5 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.6 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Bảng 3.7 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.8 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.9 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng

và 70˚C 20 phút

Bảng 3.10 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng

và 70˚C 20 phút

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cellulose

Hình 1.3 Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm

Hình 1.4 Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng

Hình 1.5 Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus

Hình 1.6 Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus

Hình 1.7 Khuẩn lạc và tế bào chủngThermomyces lanuginosus

Hình 1.8 Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum

Hình 3.7 Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.8 Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.9 Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

Hình 3.10 Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt

ITS: Internal transcribed spacer

PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase) PDA: Potato Dextrose Agar

SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

MỞ ĐẦU

Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng, cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch và ô nhiễm môi trường đã chuyển trọng tâm của thế hệ năng lượng theo hướng sử dụng nhiên liệu sinh học với nguyên liệu là chất thải giàu lignocellulose của các ngành lâm nghiệp, công nghiệp giấy và bột giấy, nông nghiệp và thực phẩm, rác thải đô thị rắn

và chất thải động vật Sản xuất nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose, với thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose sẽ tạo tiền đề cho sự phát triển bền vững Mặc dù mang nhiều hứa hẹn, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học từ lignocellulose hiện nay vẫn chưa khả thi trong sản xuất thương mại Vấn đề cốt lõi nằm ở tính bền vững của lignocellulose Với hầu hết các công nghệ hiện hành, lignocellulose trước tiên cần được thủy phân thành các monomer để tạo tiền chất cho chuyển hóa sinh học hoặc hóa học Trong công đoạn này, enzyme thủy phân lignocellulose thường được sử dụng Tuy nhiên, với các hệ enzyme hiện có, quá trình thủy phân chưa thực sự hiệu quả về mặt kinh tế Việc tìm kiếm các hệ enzyme hiệu quả hơn đang được quan tâm đặc biệt

Ngoài ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme thủy phân lignocellulose còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chế biến nông sản, thực phẩm, trong chăn nuôi, công nghiệp giấy, trong sản xuất hóa chất, xử lý môi trường Nội dung của đề tài nằm trong nỗ lực dài hạn nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật nhiệt đới cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, trong trường hợp này là tìm kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mới từ nấm mốc chịu nhiệt, nhóm vi sinh vật rất ít được nghiên cứu tại Việt Nam

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose

Hình 1.1 Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010)

Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển

khác nhau trong cùng một cây Thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau được trình bày ở Bảng 1.1 [41]

Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cellulose (Christiane Laine 2005)

Trong hệ sợi cellulose hình thành hai vùng: vùng tinh thể và vùng vô định hình Trong vùng tinh thể các sợi cellulose kết hợp với nhau theo một trật tự nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl của mạch này với nhóm hydroxyl của mạch kế tiếp Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của điều kiện bên ngoài Ngược lại các sợi cellulose trong vùng vô định hình liên kết với nhau khá lỏng lẻo bởi lực Van der Waals do đó dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài [2] Vùng vô định hình cũng dễ bị tác nhân thủy phân tấn công hơn so với vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết -1,4-glycoside làm giảm độ bền của liên kết đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục lần so với chiều dài phân tử cellulose tinh thể Các cây gỗ lâu năm thường chứa lượng cellulose tinh thể nhiều và ngược lại các cây thảo mộc chứa nhiều cellulose vô định hình

Trong phân tử cellulose có nhiều gốc hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do, hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hóa học như metyl hoặc gốc acetyl tạo nên dẫn xuất ete hoặc este của cellulose Một trong những dẫn xuất được ứng dụng nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế bằng gốc -OCH COOH [1]

1.1.1.2 Hemicellulose

Hemicellulose là polyme sinh học phong phú thứ hai trên trái đất, là heteropolymer của đường 5 carbon (xylose và arabinose), đường 6 carbon (glucose, galactose, mannose) và các acid (acetic) Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và

đa dạng tùy vào nguồn nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung như mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-1,4, xylose là thành phần chủ yếu, nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3, mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide

Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D-

xylopyranoside Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl

và glucoronosyl Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không cộng hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử tùy thuộc vào loại thực vật, vị trí của nó ở các mô, tế bào [41]

Hình 1.3 Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm

(Christiane Laine 2005)

Hình 1.4 Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng

(Christiane Laine 2005)

Xylan tồn tại ở dạng arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm (Hình 1.3) hay ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng (Hình 1.4), hay thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc [29], [63]

1.1.1.3 Lignin

Lignin là một trong những thành phần của tế bào thực vật bao bọc xung quanh các sợi cellulose và có hàm lượng lớn thứ hai sau cellulose Hàm lượng lignin trong gỗ thay đổi không những phụ thuộc vào loại cây mà còn phụ thuộc vào tuổi cây, điều kiện địa lý Trong thực vật lignin đóng vai trò chất kết nối, liên kết các tế bào làm tăng độ bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn độc tố đồng thời giúp thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn [1]

Lignin được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, và một vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol [63] Cấu trúc của lignin rất đa dạng tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân loại thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringy lignin Lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc, bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô dịnh hình Các vòng phenyl trong lignin gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào Cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide

Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và

pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200˚C, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose Trong dinh dưỡng động vật lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và

protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các cacbonhydrate khác bị bẻ gẫy

1.1.2 Enzyme thủy phân lignocellulose

Để phân hủy một hợp chất polymer phức tạp như lignocellulose cần có sự phối hợp hoạt động của nhiều enzyme ngoại bào của vi sinh vật Các enzyme này được phân loại là enzyme phân hủy carbohydrate (CAZymes) và enzyme oxy hóa lignin (FOLymes) [6], [18] Cellulase và hầu hết hemicellulase thuộc về một họ các enzyme được gọi là Glycoside Hydrolase (GH) Sự phân loại Glycoside Hydrolase vào các họ khác nhau dựa trên cơ sở tương đồng về trình tự axit, các protein trong một họ nhất định sẽ có nếp gấp tương tự nhau cho phép mô hình hóa tương đồng [10], [11], [12] Vì vậy các enzyme đặc trưng với các cơ chất khác nhau đôi khi được tìm thấy trong cùng một họ, cho thấy một sự phân kỳ tiến hóa để có được đặc trưng mới Hiện nay hơn 2500 GH đã được xác định và phân thành 133 họ bao gồm các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật với các cơ chất khác nhau [9], [53], [61]

1.1.2.1 Cellullase

Cellulase là hệ enzym xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan bằng việc phân cắt liên kết β-1,4-glycoside giữa các đơn vị glucose Cellulase từ nấm mốc chủ yếu được tìm thấy trong một vài họ GH bao gồm GH 5,

6, 7, 8, 9, 12, 44, 45, 48, 61 và 74 Cellulase sử dụng hai cơ chế xúc tác khác nhau

để thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose là cơ chế giữ và nghịch đảo Hầu như tất cả các cellulase GH thủy phân liên kết glycoside bởi cơ chế giữ trừ GH

6 sử dụng cơ chế nghịch đảo Hầu hết các cellulase có một mô-đun liên kết carbohydrate (CBM), các CBM có trách nhiệm liên kết các enzyme với vùng cellulose tinh thể để tăng cường hoạt động của enzyme Hiện nay nhiều CBM đã được xác định và phân loại thành 54 họ, tuy nhiên chỉ có một số họ (1, 13, 14, 18-

21, 24, 29, 32, 35, 38, 39, 40, 42, 43, 47, 48, 50 và 52) được tìm thấy trong nấm mốc [9], [18], [61] Hệ enzyme cellulase trong tự nhiên gồm 3 nhóm chủ yếu:

endoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase Mặc dù β-glucosidase không phân hủy trực tiếp cellulose, nhưng nó vẫn được coi là một thành phần của hệ thống cellulase vì nó kích thích quá trình thủy phân cellulose

Bảng 1.2 Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của

chúng

Enzyme Cơ chất tối

ưu

Trọng lượng phân tử (kDa)

glucanase

Cellulose vô định hình

Monomer (22-45) 50-70

Chủ yếu 4-5

Không có hoặc rất thấp Cellobiohydrola

se

Cellulose tinh thể

Monomer (50-65) 37-60

Chủ yếu 4-5

Không có hoặc rất thấp β-glucosidase Cellobiose,

cellodextrin

Monomer, dimer, trimer (35-450)

45-75 Khác

nhau

Thường rất cao

 Endo-1,4-β-glucanase (EC 3.2.1.4, endocellulase)

Endoglucanase (EG) hay còn được gọi là carboxymethylcellulase (CMCase) thủy phân cellulose bằng cách tấn công các vùng vô định hình của cellulose, giải phóng các chuỗi có chiều dài khác nhau, tạo điều kiện cho cellobiohydrolase dễ dàng tiếp cận hơn Nhóm enzyme này có pH tối ưu khoảng 4.0-5.0 và nhiệt độ tối

ưu 50-70ºC (Bảng 1.2) [53] Các nghiên cứu đều cho thấy nấm mốc sản xuất rất

nhiều EG Ví dụ, T reesei sản xuất ít nhất 5 loại EG (EGI/Cel7B, EGII/Cel5A, EGIII/Cel12A, EGIV/Cel61A và EGV/Cel45A), P chrysosporium sản xuất 3 loại

(EG28, EG34 và EG44) [8], [31]

 Cellobiohydrolase (EC 3.3.1.91, exocellulase)

Cellobiohydrolase (CBH) là enzym phong phú nhất trong secretome của nấm cellulolytic ưu tiên thủy phân liên kết β-1,4-glycoside từ đầu chuỗi giải phóng cellobiose là sản phẩm chính và các saccharide nhỏ như cellotriose và cellotetraose

từ chuỗi cellulose Tương tự như các EG, CBH là monomer hầu như không hoặc bị glycosyl hóa thấp với pH tối ưu khoảng 4.0-5.0, nhưng phổ nhiệt độ tối ưu rộng hơn, 37-60˚C (Bảng 1.2) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số CBH có thể hoạt

động từ đầu không khử và một số khác từ đầu khử trong những chuỗi cellulose, làm

tăng sức mạnh hoạt động giữa các enzyme có tính năng trái ngược Ví dụ, T reesei

có hai CBH phân cắt một từ đầu khử (CBHII/Cel6A) và một từ đầu không khử (CBHI/Cel7A) [8], [26], [61] Tuy nhiên đã có một cuộc tranh luận rằng CBH có thể được gọi là exocellulase hay không, kể từ khi các phương pháp phân tích hoạt tính gần đây chỉ ra rằng các CBH có thể thực hiện phân cắt nội chuỗi cellulose, tạo

ra hai đầu chuỗi mới mà từ đó chúng có thể tiến hành hoạt động dễ dàng hơn [7], [17]

 β-glucosidase (EC 3.2.1.21)

glucosidase thủy phân cellobiose hòa tan và cellodextrins thành glucose glucosidase được đặt trong họ GH 1 và GH 3 dựa trên trình tự axit amin Họ GH 3 bao gồm β-glucosidase từ nấm, vi khuẩn và thực vật trong khi họ GH 1 bao gồm β-glucosidase từ vi khuẩn, thực vật và động vật có vú có hoạt động galactosidase β-glucosidase của cả 2 họ thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic bằng cơ chế giữ [24] β-glucosidase là enzyme thay đổi nhiều nhất trong số các enzyme thủy phân lignocellulose do cấu trúc và sự phân bố không gian Một số β-glucosidase có cấu

β-trúc monomer đơn giản với khối lượng phân tử khoảng 35 kDa (từ Pleurotus ostreatus) [54], một số khác lại có cấu trúc dimer (từ Sporobolomyces singularis với

146 kDa) [42], thậm chí cấu trúc trimer với khối lượng hơn 450 kDa (từ Pisolithus tinctorius) [20] Hầu hết các β-glucosidase bị glycosyl hóa và trong một số trường hợp, chẳng hạn như β-glucosidase monomer 300 kDa từ Trametes versicolor, mức

độ glycosyl hóa lên đến 90% [21] pH tối ưu cho các enzym khác nhau dựa trên vị trí không gian, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu chỉ dao động khoảng 45-75°C (Bảng 1.2) Liên quan đến vị trí không gian, β-glucosidase có thể được nhóm lại thành ba loại khác nhau bao gồm β-glucosidase nội bào, liên kết thành tế bào và ngoại bào [19]

Trong nấm mốc T reesei, có hai β-glucosidases (BGLI/Cel3A & BGLII/Cel1A)

được tách chiết từ môi trường nuôi cấy, nhưng các enzyme được tìm thấy chủ yếu được liên kết với thành tế bào [47]

1.1.2.2 Hemicellulase

Hemicellulose chứa liên kết đường xương sống β-1,4 có thể được acetyl hóa hoặc thay thế bằng đường mạch nhánh [62] Với sự đa dạng của hemicellulose, phải cần rất nhiều hydrolase glycoside, cũng như esterase carbohydrate tham gia phân hủy chúng Ví dụ, để phân cắt xylan yêu cầu hoạt động tổng hợp của xylanase, xylosidase, arabinofuranosidase, galactosidase, deacetylase, glucuronidase, esterase glucuronyl, và esterase feruloyl Cũng giống như cellulase, rất nhiều các enzyme hoạt động và được liên kết với các module carbohydrate để thúc đẩy hoạt động của enzym trên cơ chất [25], [40] Cho đến nay, hemicellulase nấm mốc đã được xác định trong 19 họ GH: 1, 2, 3, 5, 10, 11, 26, 27, 36, 39, 43, 51, 53, 54, 62, 67, 74,

GH 3, 39, 43,

52, 54 α-L-

Arabinofuranosidase

α-Arabinofuranosyl Xylooligomer α-1,5-arabinan

3.2.1.55 GH 3, 43, 51,

54, 62 Endo-α-1,5-arabinanase α-1,5-arabinan 3.2.1.99 GH 43

α-Glucuronidase 4-O-methyl-α-glucuronic

acid Xylooligomer 3.2.1.139 GH 67 Endo-β-1,4-mannanase β-1,4-mannan 3.2.1.78 GH 5, 26

Exo-β-1,4-mannosidase β-1,4-mannooligomer

α-galactosidase α-galactopyranose

Mannooligomer 3.2.1.22 GH 4, 27, 36, 57 β-glucosidase β-glucopyranose

Mannopyranose 3.2.1.21 GH 1, 3 Endo-galactanase β-1,4-galactan 3.2.1.89 GH 53

Acetyl xylan esterase 2- hoặc 3-O-acetyl xylan 3.1.1.72 CE 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7 Acetyl mannan esterase 2- or 3-O-acetyl mannan 3.1.1.6

Ferulic and p-cumaric

 Xylanase/Xylosidase

Xylanase (EC 3.2.1.8) thủy phân liên kết β-1,4 xylan mạch chính, tạo ra các xylooligomer ngắn Hầu hết các xylanase được biết đến thuộc họ GH 10 và 11 (trên

300 trình tự gen được phát hiện), và khoảng 20 gen xylanase được phân bố giữa các

họ GH 5, 8 và 43 Xylanase GH 10 đặc hiệu cơ chất ít hơn so với họ enzym GH 11

và có thể thủy phân xylan có chứa mạch nhánh, trong khi xylanase họ GH 11 chỉ có thể thủy phân xylan khi các mạch nhánh bị loại bỏ Liên quan đến cơ chất đặc trưng của xylanase, thông thường sự hiện diện 4-O-methyl-glucuronic acid và arabinofuranose chuỗi bên cản trở sự liên kết và thủy phân của xylanase [5], [23] β-Xylosidase (EC 3.2.1.37) là exo-glycosidase thủy phân các xylo-oligosaccharide và xylobiose hòa tan thành xylose được tìm thấy trong các họ GH

3, 39, 43 , 52 và 54 (Bảng 1.3) Hầu hết các β-xylosidase được nghiên cứu cho đến nay đều bị ức chế bởi xylose, sản phẩm thủy phân của chúng Các enzyme này đóng một vai trò quan trọng trong sư thủy phân xylan bằng cách giảm bớt sự ức chế sản phẩm cuối cùng của endoxylanase [5], [23]

 β-Mannanase

β-Mannanase (EC 3.2.1.78) thủy phân mannan trên hemicellulose và giải phóng chuỗi ngắn β-1,4-mannooligomer, hợp chất này có thể được tiếp tục thủy phân thành mannose bởi β-mannosidase (EC 3.2.1.25) Hiện tại có khoảng 50 trình

tự gen β-mannanase trong họ GH 5 và 26 và khoảng 15 trình tự gen β- mannosidase trong GH 1, 2 và 5 Điều thú vị là β-mannosidase cũng được tìm thấy trong động vật bậc cao và có liên quan đến sự suy thoái glycoprotein lysosome [23]

 α-L-Arabinofuranosidase

L-Arabinose được tìm thấy trong các thành phần sinh khối hemicellulosic khác nhau, chủ yếu là arabinoxylan, trong đó trục chính β-1,4-D-xylopyranosyl được liên kết chuỗi bên với arabinose α-L-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) và α-L-arabinanase (EC 3.2.1.99) thủy phân liên kết arabinofuranosyl trên hemicelluloses và được phân loại vào các họ GH 3, 43, 51, 54, 62 Cấu trúc tinh thể

của một α-L-arabinanase từ Cellvibrio japonicus là cấu trúc ba chiều đầu tiên được

biết đến của họ GH 43 Enzyme này có nếp gấp β năm cánh, và là enzym đầu tiên được biết đến có cấu trúc liên kết này [5], [23]

 α-D-Glucuronidase

α-D-Glucuronidase phân cắt liên kết α-1,2-glycoside trong chuỗi bên methyl-D-glucuronic acid của xylan và chỉ được phân loại vào họ GH 67 Tính đặc hiệu của α-D-glucuronidase khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme Cấu trúc tinh thể đầu tiên của một glycosidase GH67 được biết đến là một α-glucuronidase từ

4-O-Cellvibrio japonicus [23]

 Hemicellulolytic esterase

Hemicellulolytic esterases bao gồm acetyl xylan esterases (EC 3.1.1.72) thủy phân nhóm thế acetyl trên nửa phân tử xylose, và feruloyl esterases (EC 3.1.1.73) thủy phân liên kết este giữa nhóm thế arabinose và ferulic acid Đây là liên kết este cuối cùng kết nối xylan với lignin [23]

1.1.2.3 Ligninase

Hệ thống enzyme của sự phân hủy đại phân tử ligin hoạt động trong điều kiện rất khó khăn Cơ chất là những polymer lớn không đồng nhất đòi hỏi phải được tấn công bằng những tác nhân enzyme ngoại bào Lignin không chứa những liên kết

có thể thủy phân, tức là các enzyme phải là enzyme oxi hóa

Năm 1938, Davidson phát hiện ra loại enzyme có khả năng thủy phân lignin

có tên là: phenoloxydase Enzyme này được sinh tổng hợp bởi 1 số chủng nấm mốc Hiện nay các nhà khoa học đã chứng minh có 15 loại enzyme phenoloxydase và được gọi chung là ligninase Khi nghiên cứu về cơ chế tác dụng thì hệ enzyme này hoàn toàn khác với các hệ enzyme khác Ligninase không thủy phân lignin thành các tiểu phần hòa tan như các hệ enzyme khác Do cấu trúc của lignin rất chặt chẽ,

số liên kết yếu không nhiều nên enzyme rất khó tác động vào cơ chất Mặt khác enzyme ligninase lại rất khó hòa tan khiến phản ứng diễn ra rất hạn chế Hệ thống

các enzyme liên quan tới quá trình phân hủy lignin khá đa dạng và không được đề cập trong trong khuôn khổ của bản luận văn này

1.2 Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose

1.2.1 Nấm mốc chịu nhiệt

1.2.1.1 Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt

Khái niệm “ưa nhiệt” được sử dụng với vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ cao, thường khoảng 45-122°C Khái niệm này thường chỉ được sử dụng đối với vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn cổ (vi khuẩn ở miệng phun núi lửa, suối nước nóng…) Trong giới nấm cũng có một nhóm nhỏ có thể sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ lên đến 45-62°C Tuy nhiên, dải nhiệt độ này đôi khi không tối thích cho sinh trưởng của nấm mà chỉ là giới hạn nhiệt độ phát triển Vì vậy, khái niệm ưa nhiệt có vẻ sẽ không được sử dụng chính xác trong trường hợp này Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi sẽ sử dụng khái niệm “chịu nhiệt” thay cho khái niệm “ưa nhiệt” khi đề cập tới nhóm nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao

Trong hơn bốn thập kỷ qua, nhiều loài nấm chịu nhiệt đã được phát hiện và nghiên cứu [56] Nấm mốc chịu nhiệt có mặt trong các loại đất và bên trong khối thực vật đang phân hủy Nấm mốc chịu nhiệt có thể tìm thấy trong phân ủ, đống cỏ khô, ngũ cốc được lưu trữ, vật liệu làm tổ của các loài chim và động vật, rác thải thành phố Các chất hữu cơ khi được tích lũy trong môi trường ấm áp, ẩm ướt và hiếu khí cung cấp điều kiện sinh lý cơ bản cho phát triển của nấm mốc chịu nhiệt Nấm mốc chịu nhiệt phổ biến trong môi trường axit hơn nhiều hơn so với môi trường trung tính hoặc kiềm Chúng thuộc các nhóm phân loại không đồng nhất của các chi của Zygomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes và Mycelia Sterilia (nhóm nấm không tạo bào tử) [56]

Khả năng chịu nhiệt của nấm không phải quá cao như với vi khuẩn thật hoặc

vi khuẩn cổ khi mà một số loài trong số đó có thể phát triển gần hoặc trên 100ºC trong suối nước nóng, các miệng núi lửa phun khí sunfua đioxit, hoặc miệng phun

thủy nhiệt Có lẽ vì mức độ chịu nhiệt vừa phải và môi trường sống không quá đặc biệt nên nhóm nấm chịu nhiệt đã không nhận được nhiều sự chú ý Khác với vi khuẩn, sự thật là phần lớn các sinh vật nhân chuẩn không thể tồn tại lâu dài ở nhiệt

độ 40-45°C Chỉ có khoảng 30 loài trong số khoảng 50.000 loài nấm được biết có thể sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ nêu trên Trong số đó, một số loài nấm cũng

có thể phát triển được ở nhiệt độ 60-62°C

1.2.1.2 Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến

Hình 1.5 Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus (Bộ sưu tập giống -

Viện Công nghiệp Thực phẩm)

 Rhizomucor pusillus

Rhizomucor pusillus là loài nấm mốc chịu nhiệt đầu tiên được tìm thấy Loài

này được phân lập từ bánh mì và được Lindt mô tả từ khoảng hơn một thế kỷ trước

49 Rhizomucor pusillus thường được tìm thấy trong đất và cát, mỏ than, đống cỏ

khô, lúa mạch lưu trữ hoặc đống phân ủ…[56]

Khuẩn lạc Rhizomucor pusillus lúc đầu trắng, sau chuyển sang màu xám nâu

Loại nấm này tạo ra nhiều "lông tơ" sợi nấm trên không, thân có chứa bào tử (bào tử nang) được phân nhánh và có túi bào tử nằm trên đầu nhánh Các túi bào tử dễ vỡ

và giải phóng rất nhiều bào tử, để lại chỉ có một khu vực trung tâm phình ra (trụ giữa) và còn sót lại thành của túi bào tử [56] Với phạm vi nhiệt độ hoạt động từ 20-

55°C, Rhizomucor pusillus xuất hiện sớm trong đống ủ compost, sử dụng các loại

đường đơn giản, axit amin có mặt ban đầu trong nguyên liệu thực vật

Hình 1.6 Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus (Bộ sưu tập giống - Viện

Công nghiệp Thực phẩm)

 Thermomyces lanuginosus (Humicola lanuginosus)

Thermomyces lanuginosus là loài nấm chịu nhiệt thứ hai được tìm thấy ngay sau Rhizomucor pusillus Thermomyces lanuginosus rất phổ biến và là đại diện điển

hình cho cộng đồng vi sinh vật chịu nhiệt Loại nấm này phân bố rộng rãi trong đất, hạt ngũ cốc, các loại đất mỏ than, phân ủ trồng nấm, cỏ khô, phân bón, lá cây mục, đống ủ vườn, phân trâu bò, không khí và đống ủ cá thực vật khác nhau

Thermomyces lanuginosus phát triển trong dải nhiệt từ 30C tới 52-55°C [56]

Khuẩn lạc nấm ban đầu màu trắng, sau đó chuyển sang màu xám đến tím nâu, bắt đầu từ trung tâm khuẩn lạc, tiết sắc tố đỏ thẫm vào môi trường Sợi nấm không màu, có vách ngăn, đường kính từ 1.5-4 m Loại nấm này tạo bào tử hình cầu ở đầu các nhánh Lúc trưởng thành các bào tử có màu nâu, có lớp thành bọc ngoài, đường kính khoảng 6-10 µm [56]

Hình 1.7 Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus (Bộ sưu tập giống -

Viện Công nghiệp Thực phẩm)

 Scytalidium thermophilum

Các loài nấm được mô tả với khả năng thủy phân polysaccharide và trehalose

như Humicola insolens, H grisea var thermoidea hay Torula thermophila, thường

được tìm thấy trong compost nấm hoặc đất Tất cả chúng ngày nay đều được biết

đến với tên duy nhất là Scytalidium thermophilum [34], [58] Trong khuôn khổ luận

văn khi xem xét các bài báo, tên của các loại nấm này như báo cáo trong các bài báo ban đầu được giữ lại

Khuẩn lạc nấm có màu trắng lúc đầu nhưng ngay sau đó chuyển sang xám và đen tuyền như bào tử trưởng thành Sợi nấm không màu, phủ phục, phân nhánh, có vách ngăn rộng 2-5 m Bào tử màu nâu sẫm, có thành nhẵn bao quanh, mờ, thường hình cầu, đường kính 7-12,5 m, hoặc hình bầu dục 11,2-14,6 x 7,5-10 m [56].

Hình 1.8 Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum (Bộ sưu tập giống -

Viện Công nghiệp Thực phẩm)

1.2.2 Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt

1.2.2.1 Hoạt tính cellulase

Hệ thống cellulase của nấm mốc chịu nhiệt cũng bao gồm ba enzym thủy phân: endo-(1,4)–β-D-glucanase, cellobiohydrolase và β-glucosidase [13] Một số loài nấm chịu nhiệt phân hủy cellulose mạnh nhưng cellulase tách chiết từ canh trường lại có hoạt tính rất thấp do sự phân hủy cellulose liên quan mật thiết tới hệ sợi [51] Cellulase của nấm mốc chịu nhiệt tác động ưu tiên lên cellulose tinh thể

hơn là cellulose vô định hình Trừ một số trường hợp ngoại lệ như Thermoascus aurantiacus [44], Humicola insolens [39], và H grisea var thermoidea [69], các

chủng nấm mốc này sản sinh cellulase và xylanase mạnh ngay cả trên cơ chất

hemicellulose không chứa cellulose Với một số chủng Spothermophile rotrichum,

các disaccharide, cellobiose và lactose cũng cảm ứng quá trình sinh tổng hợp cellulase, mặc dù hiệu quả thấp [37]

Thời điểm xuất hiện của các thành phần cellulase khác nhau thay đổi tùy vào

loài Ở Humicola insolens [38] và Thermoascus aurantiacus [45], cả ba enzyme cellulase xuất hiện đồng thời, trong khi đó với Chaetomium thermophile var coprophile [33], β-glucosidases được sản sinh trước, sau đó mới đến endo- và

exoglucanase Với Sporotrichum thermophile, endoglucanase và exoglucanase được

hình thành sau cùng trong quá trình phát triển của nấm Hoạt tính β-glucosidases trong môi trường trùng hợp với thời điểm phát triển của sợi nấm [16], [32]

Talaromyces emersonii sản xuất nhiều loại endoglucanase, exoglucanase và

β-glucosidase khác nhau Có 4 endoglucanase khác biệt về mức độ glycosyl hóa (28-51%) đã được tinh chế Chúng có khối lượng phân tử, điểm đẳng điện, pH và nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt và hoạt tính gần tương tự nhau Các endoglucanase (30-100 kDa) của nấm mốc chịu nhiệt đều bền nhiệt, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 55-80°C, pH 5.0-5.5 và hàm lượng carbohydrate khoảng 2-50% Exoglucanase (40-70 kDa) hoạt động tối ưu ở 50-75°C, các enzyme này đều là glycoprotein Các loại β-glucosidase không đồng nhất và có khối lượng phân tử khoảng 45-250 kDa, hàm lượng carbohydrate khoảng 9-50% Nói chung, trừ tính bền nhiệt, đặc điểm phân tử của cellulase nấm mốc chịu nhiệt và nấm mốc ưa ấm tương tự nhau [58]

Một tính năng đáng chú ý của hệ thống cellulase là sự đồng bộ, nghĩa là hoạt động của một hỗn hợp của hai hay nhiều loại cellulase tốt hơn nhiều so với hoạt động riêng rẽ của mỗi một loại Eriksen và Goksoyr (1997) đã tinh chế được các

enzyme endoglucanase, exoglucanase, và β-glucosidase từ Chaetomium thermophile var dissitum Mỗi loại cellulase khi hoạt động đơn lẻ trên bông cho

thấy khả năng phân giải kém, nhưng khi tất cả các loại enzyme thành phần được kết hợp, sự phân cắt bông trở nên dễ dàng hơn rất nhiều [28], [43] Yoshioka và cộng

sự (1982) cũng đã tinh chế được một endoglucanase từ Humicola grisea var thermoidea, không giống như endoglucanase từ các loài nấm khác nó được hấp thụ

hoàn toàn vào cellulose tinh thể nhưng không có hoạt động phân giải Tuy nhiên, khi endoglucanase này được ủ với một exoglucanase, thậm chí của một chủng nấm mốc khác, chúng lại có hoạt động thủy phân rất tốt trên cellulose tinh thể [69] Trong những năm 1970-1980, các nghiên cứu thực tế về khả năng phân giải cellulose của các enzyme cellulase cho thấy việc bổ sung β-glucosidase vào hỗn hợp phản ứng kích thích thủy phân cellulose tốt hơn [66] Ảnh hưởng của β-

glucosidase được giải thích trên cơ sở khả năng thủy phân cellobiose vốn ức chế

hoạt động của các enzyme cellulase khác Tuy nhiên, với Sporotrichum thermophile, β-glucosidase kích thích quá trình thủy phân cellulose của một số

endo- và exoglucanase ngay cả khi rất ít hoặc không có cellobiose tích lũy trong hỗn hợp phản ứng [15] Một giả thuyết được đưa ra là β-glucosidase có thể kết hợp với endo- và exoglucanases để tạo thành một phức hợp cellulase hoạt động phân giải tốt hơn Phức hợp enzyme này liên kết với thành tế bào nấm, tương tự như cellulosome trong vi khuẩn [14] Điều này có thể giải thích khả năng phân giải cellulose mạnh mẽ của một số nấm chịu nhiệt

1.2.2.2 Hoạt tính xylanase

Xylanase của nấm chịu nhiệt đang nhận được sự chú ý đáng kể vì nó có thể ứng dụng trong quá trình tẩy tắng bột giấy trong ngành công nghiệp giấy, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện khả năng tiêu hóa của động vật Rất nhiều cơ chất đã được sử dụng để nuôi cấy nấm mốc sinh xylanase như xylan tinh khiết, các xylan tự nhiên như mùn cưa, lõi ngô, cám lúa mì, bột củ cải đường và bã mía Giấy

kém chất lượng cũng là cơ chất tốt để lên men Thermoascus aurantiacus và Paecilomyces varioti Trong khi đó, xylose được sử dụng để để sản xuất xylanase từ Melanocarpus albomyces và Thermomyces lanuginosus Malbranchea pulchella var sulfurea sản sinh xylosidase ngoại bào [52], trong khi đó xylosidase của H grisea var thermoidea [3] và Talaromyces emersonii [67] đều nằm trong tế bào chất Điều thú vị là các loài sản xuất xylanase tốt nhất, T lanuginosus chỉ tiết một

lượng nhỏ enzyme thủy phân xylan và không sản xuất enzyme phân cắt β-mannan

và arabinan

Cũng giống như nhóm nấm mốc ưa ấm, các chủng chịu nhiệt cũng sản xuất nhiều loại xylanase khác nhau về độ bền, hiệu quả xúc tác, khả năng hấp thu và hoạt động trên cơ chất [27], [48], [60], [67] Phần lớn các xylanase hoạt động tối ưu ở

pH 4.5-6.5 trừ xylanase của Talaromyces emersonii, pH tối ưu nằm trong khoảng

pH axit Nhiệt độ tối ưu của hầu hết các xylanase dao động trong khoảng 55-65°C,

trừ xylanase của một số chủng Thermoascus aurantiacus và Thermomyces lanuginosus hoạt động tối ưu ở 70-80˚C Khối lượng phân tử của xylanase khoảng 21-78 kDa Chỉ có Xyl I và Xyl II của Talaromyces emersonii có cấu trúc dimer còn lại hầu hết là monomer Đặc biệt xylanase I của C thermophile var coprophile [57]

và xylanase II của H insolens [27] có khối lượng phân tử rất thấp (7 kDa) Các

enzyme xylanase đều là glycoprotein Hàm lượng carbohydrate trong 3 loại

xylanase của Talaromyces byssochlamydoides khoảng 14 -37% Hai endoxylanase của Talaromyces emersonii hoạt động khá đặc biệt và chỉ có hoạt tính thủy phân

xylan khi các nhóm thế arabinose bị loại bỏ Không giống cellulase, các xylanase không kết hợp hoạt động trong quá trình thủy phân [35], [36], [48]

Xylanase đông khô của Thermomyces lanuginosus bị bất hoạt sau 2 tháng ở

-20°C, mặc dù các enzyme tinh khiết ở dạng lỏng không mất hoạt tính [4] Một vài

xylanase đã được tinh chế và xác định cấu trúc như xylanase của Thermoascus aurantiacus (TAX) với 301 axit amin [46] Cấu trúc bậc 1 của nó tương đồng với

cấu trúc xylanase của nấm ưa ấm Vị trí bám vào cơ chất chứa glutamate và histidine và được tích điện âm như với các xylanase khác Natesh và cộng sự cho rằng cầu disulfide và cầu muối làm bền protein bằng cách giữ các cấu trúc bậc hai, góp phần vào tính bền nhiệt của các nếp gấp Tuy nhiên, khi TAX được so sánh với các xylanase khác của nấm mesophilic, không có mối tương quan giữa số lượng cầu muối và sự gia tăng tính bền nhiệt [50] Thay vào đó, tính bền nhiệt của TAX xuất hiện chủ yếu là do sự đóng gói các đầu kỵ nước, các tương tác có lợi của các chuỗi bên với lưỡng cực xoắn, và sự có mặt của proline tại đầu N của cấu trúc xoắn làm giảm sự tự do tạo hình của phân tử protein

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt được phân lập

từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn ủ, rơm ủ, lá cây mục… thu thập trên địa bàn các tỉnh

 Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar; Glucose; Yeast extract; Peptone; Malt;

Phenolchlorofom; Malt extract

 Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 Dinitrosalicylic acid; Sodium hydroxide;

Sodium potassium tartrate; Phenol tinh thể; Sodium metabisulfite; Citric acid monohydrate; Glucose, Ammonium sulfate; Urea; Potassium dihydrogen phosphate; Calcium chloride; Magnesium sulfate heptahydrate; Cobalt (II) chloride hexahydrate; Tween 80%; Cacboxymethyl cellulase; Congo red

 Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide; Tris-base; Amonium per

sulfate; Glycine; Methanol; N’N’-bis-methylene-acrylamide; HCl; Sodium dodecyl sulfate; Acetic acid

 Hóa chất dùng cho tách chiết và tinh chế DNA: dd SSC 2; Nước cất 2 lần

thanh trùng; phenol + chloroform (1:1); Kit Silica Bead DNA Gel Extraction (Silica powder suspension, TBE conversion buffer, Concentrated Washing buffer, Binding buffer)

 Hóa chất dùng cho PCR: Enzyme Taq ADN Polymease; dNTPs; Thang

ADN mẫu dùng trong điện di; Agarose dùng trong điện di; Ethidium Bromide để nhuộm gen

2.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc

Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang (Pharmacia Biotech, Gibco), box cấy (BioblockScientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600, Nikon, Nhật), lò vi sóng (LG, Hàn Quốc), máy đo pH (Toledo, Anh), máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm cao tốc (Heraeus–Sepatech), máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel (Benchtop UV-Transilluminator, VWR), Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products)…

Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống falcon, ống nghiệm, ống eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que cấy,

2.3 Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1 Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol

 Thành phần: Malt (1%), glucose (1%), agar (2%), chloramphenicol (100

ppm, pha stock 1% trong ethanol)

 Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Cho hỗn hợp vào bình

Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô

 Tác dụng: Làm môi trường phân lập

2.3.2 Môi trường PDA

 Thành phần: Glucose (1%), agar (2%), dịch chiết khoai tây

 Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Cho hỗn hợp vào bình

Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô Để chuẩn bị thạch nghiêng cũng cân các thành phần như trên, quay nóng cho tan thạch bằng lò vi sóng, dùng pipet hút 4 ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, bảo quản trong tủ mát

 Tác dụng: dùng làm môi trường nuôi cấy và giữ giống

2.3.3 Môi trường lên men lỏng

 Thành phần:

- Môi trường (1000 ml): KH2PO4 (4 g), (NH4)2SO4 (13.6 g), CaCl2.2H2O (0.8 g), MgSO4.7H2O (0.6 g), Bacto peptone (6 g), Tween 80 1% (20 ml), cơ chất cám mì (20 g)

- Vi lượng (50 ml): FeSO4.7H2O (0.5 g), MnSO4.H2O (0.16 g), ZnSO4.7H2O (0.14 g), CoCl.6H2O (0.2 g)

 Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên Bổ sung 1ml vi lượng vào

1000 ml môi trường lên men sau đó hấp thanh trùng 121°C trong 15 phút

 Tác dụng: môi trường lên men nấm mốc thu nhận enzyme

2.3.4 Môi trường YM

 Thành phần (1000 ml): Yeast extract (3 g), malt extract (3 g), glucose (10 g), pepton (1 g), nước cất

 Chuẩn bị: Các thành phần trên được cân và hòa tan trong nước, dùng pipet

hút 3ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút

Để môi trường ở điều kiện vô trùng tới nguội rồi bảo quản trong tủ lạnh

 Tác dụng: làm môi trường nuôi giống tách ADN

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt

Các loại mẫu được thu thập ở các địa điểm và thời gian khác nhau Mẫu được pha loãng bằng dung dịch nước muối NaCl 0.9% từ nồng độ 10-1 đến 10-5, votex đều Dùng pipet hút lần lượt 100 µl mẫu nồng độ 10-2 đến 10-5 vào đĩa thạch môi trường Malt-glucose 2°Bx có kháng sinh như đã nêu ở mục 2.3.1 Dùng que chang vô trùng chang đều khắp bề mặt đĩa thạch sau đó đĩa được mang đi nuôi cấy

ở tủ nuôi 50°C trong 2-3 ngày Sau khi nuôi cấy 2-3 ngày mang các đĩa thạch ra quan sát Các khuẩn lạc khác nhau được nhặt ra, làm sạch và giữ giống trên môi trường thạch nghiêng PDA

2.4.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào

Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 50˚C sau 2-3 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Làm tiêu bản

và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x

2.4.3 Tách chiết enzyme

Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng PDA trong vòng 4-5 ngày Sau đó bổ sung khoảng 3-5 ml dịch Tween 80 0.05% vào, Vortex đều cho bào tử long ra, dịch này có thể được pha loãng thêm 10 lần nữa, nhỏ vào buồng đếm hồng cầu, đếm số lượng bào tử Tính toán số lượng bào tử cần tiếp vào môi trường nuôi cấy lỏng ở trên với nồng độ là 5.105 bào tử trên ml môi trường (20 ml/bình nón 100 ml), nuôi cấy lỏng 7 ngày (lắc 150 vòng, 50°C) Sau 7 ngày lên men, dịch nuôi cấy đem ly tâm 10 000 rpm/10’/4C để loại cặn Dịch enzyme thô được bảo quản ở -20°C

2.4.4 Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS

 Đường chuẩn

Đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C trong 2h Cân 0.5g glucose hòa với

40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến đụng 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20C)

Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml

Tiến hành dựng đường chuẩn:

- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường

- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6 ml DNS Phản ứng màu ở 100oC trong

5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất Đo OD 540 nm

Dựng được đường chuẩn y = ax + b

 Tiến hành

Mẫu thí nghiệm:

- Cho vào Eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (5 mảnh giấy lọc) và 0.2 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50°C trong 5 phút

- Bổ sung vào Eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút

- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất Đo OD 540 nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên dịch enzyme đã bị bất hoạt (đun sôi enzyme trong 10 phút)

Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozymes 50013 pha loãng tới 500-1000 lần

Hoạt tính cellulase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C

2.4.5 Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS

 Cơ chất:

- CMCase: CMC 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh

trùng 121˚C trong 15 phút, bảo quản ở 4˚C

- Xylanase: xylan 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh

trùng 121°C trong 15 phút, bảo quản ở 4°C

 Đường chuẩn

Đường D-glucose (EU–G7) cho CMCase và D-xylose cho xylanase được sấy 105˚C trong 2h Cân 0.5g đường hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch

stock 10mg/ml (bảo quản -20°C)

Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml Tiến hành dựng đường chuẩn:

- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường

- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6ml DNS, phản ứng màu ở 100°C trong

5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất Đo OD 540 nm

Dựng được đường chuẩn: y = ax + b

 Tiến hành

Mẫu thí nghiệm:

- Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50˚C trong 5 phút

- Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp),

- Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá

- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất Đo OD 540 nm

Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên dịch enzyme bị bất hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút)

Mẫu đối chứng dương: phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm

Hoạt tính CMCase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C

Hoạt tính xylanase được tính bằng số µmol D-xylose tạo ra khi thủy phân xylan trong một phút bởi một ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C

2.4.6 Điện di protein

2.4.6.1 Phương pháp điện di SDS-PAGE

 Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường Vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vận tốc dịch chuyển khác nhau, nhờ đó mà có thể phân tách một hỗn hợp các protein

Bảng 2.1 Thành phần gel chạy điện di protein STT Hóa chất Running gel 10% Stacking gel 5%

 Chuẩn bị mẫu: Mẫu enzyme được hòa tan trong sample buffer với tỉ lệ 4:1 Lắc đều và gia nhiệt 4 phút ở 100°C Sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây Mẫu chuẩn bị xong phải điện di ngay là tốt nhất hoặc để không quá 2 ngày ở 2°C

 Nạp mẫu:

- Mẫu đã chuẩn bị trên được load vào giếng với thể tích thích hợp Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu Chạy 120 V Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy Lấy gel ra một cách cẩn thận tránh bị rách

 Tiến hành nhuộm gel:

- Nhuộm gel trong 50 ml CBB ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để CBB bắt

mầu với protein

- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50

ml

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết

quả

2.4.6.2 Phương pháp điện di Zymogram

 Nguyên tắc: Hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất (CMC hoặc xylan) Sau khi phân tách, phản ứng enzyme được tiến hành trong gel, enzyme có mặt sẽ thuỷ phân cơ chất Sau phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm Congo Red Những phần cơ chất bị enzyme thuỷ phân sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, và do đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với màu nền của gel

 Thành phần gel: Giống với thành phần gel SDS-PAGE chỉ khác ở phần running gel thay nước cất bằng dung dịch cơ chất

 Tiến hành tương tự như điện di SDS-PAGE nhưng phần nhuộm gel làm như sau:

- Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X-100, lắc 30 phút (làm 2 lần)

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15 phút (làm 2 lần)

- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) ấm 30 phút

ở 50°C (hoặc lâu hơn đến 12 giờ)

- Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0.1%, lắc 30 phút

- Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200 ml NaCl 1M, rửa 2 lần mỗi lần 15 phút

- Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả

2.4.7 Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc

Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 50°C trong 2-3 ngày Lấy 2 vòng que cấy tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2 vào mỗi ống Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi Thêm 100 l nước cất

vô trùng, 100 l hạt thủy tinh, 150 l dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN, sau đó ADN được giữ ở -20°C

2.4.8 Phương pháp tinh chế ADN

Do ADN của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng ADN làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế ADN bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit Hút 50 l dịch trong chứa ADN cho vào Eppendorf

vô trùng Bổ sung 150 l dung dịch Binding buffer có chứa Silica Đem ly tâm ở

12000 rpm trong 2 phút Hút bỏ dịch do ADN đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh Rửa 3 lần bằng Washing buffer Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 l nước cất vô trùng dùng cho PCR Ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút, ADN ở phần dịch nổi là

ADN đã được tinh chế ADN sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở -20C

2.4.9 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing

Phản ứng PCR fingerprinting được tiến hành với thành phần phản ứng:

2.4.10 Phương pháp điện di ADN

Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1.5% với dung dịch đệm là 0.5TAE Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1.5% được đun tan trong đệm TAE bằng lò vi sóng Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60-70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản

gel Với các gel sử dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 l mẫu cho mỗi giếng Điện di với hiệu điện thế 50V

2.4.11 Nhuộm gel và đọc kết quả

Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0.5

g/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước cất để loại bỏ ethidium bromide bám không đặc hiệu Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel Benchtop UV-Transilluminator VWR Ảnh được chụp bằng máy ảnh Olympus 4040Z

2.4.12 Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA

ADN sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của rDNA với thành phần và tỷ lệ như sau:

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS

Tiến hành nhân đoạn ADN bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System

9700 (PE) Chu trình gia nhiệt như sau: Biến tính 94°C trong vòng 2 phút Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút và kéo dài ở 72°C trong 2 phút

Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit Sau đó sản phẩm PCR được đọc

trình tự với mồi ITS4 và NL1 Kết quả đọc trình tự được xử lý với phần mềm BioEdit