Xylanase của nấm chịu nhiệt đang nhận được sự chú ý đáng kể vì nó có thể ứng dụng trong quá trình tẩy tắng bột giấy trong ngành công nghiệp giấy, bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để cải thiện khả năng tiêu hóa của động vật. Rất nhiều cơ chất đã được sử dụng để nuôi cấy nấm mốc sinh xylanase như xylan tinh khiết, các xylan tự nhiên như mùn cưa, lõi ngô, cám lúa mì, bột củ cải đường và bã mía. Giấy
kém chất lượng cũng là cơ chất tốt để lên men Thermoascus aurantiacus và Paecilomyces varioti. Trong khi đó, xylose được sử dụng để để sản xuất xylanase từ Melanocarpus albomyces và Thermomyces lanuginosus. Malbranchea pulchella var. sulfurea sản sinh xylosidase ngoại bào [52], trong khi đó xylosidase của H. grisea var. thermoidea [3] và Talaromyces emersonii [67] đều nằm trong tế bào chất. Điều thú vị là các loài sản xuất xylanase tốt nhất, T. lanuginosus chỉ tiết một
lượng nhỏ enzyme thủy phân xylan và không sản xuất enzyme phân cắt β-mannan và arabinan.
Cũng giống như nhóm nấm mốc ưa ấm, các chủng chịu nhiệt cũng sản xuất nhiều loại xylanase khác nhau về độ bền, hiệu quả xúc tác, khả năng hấp thu và hoạt động trên cơ chất [27], [48], [60], [67]. Phần lớn các xylanase hoạt động tối ưu ở
pH 4.5-6.5 trừ xylanase của Talaromyces emersonii, pH tối ưu nằm trong khoảng
trừ xylanase của một số chủng Thermoascus aurantiacus và Thermomyces lanuginosus hoạt động tối ưu ở 70-80˚C. Khối lượng phân tử của xylanase khoảng 21-78 kDa. Chỉ có Xyl I và Xyl II của Talaromyces emersonii có cấu trúc dimer còn lại hầu hết là monomer. Đặc biệt xylanase I của C. thermophile var. coprophile [57] và xylanase II của H. insolens [27] có khối lượng phân tử rất thấp (7 kDa). Các
enzyme xylanase đều là glycoprotein. Hàm lượng carbohydrate trong 3 loại
xylanase của Talaromyces byssochlamydoides khoảng 14 -37%. Hai endoxylanase của Talaromyces emersonii hoạt động khá đặc biệt và chỉ có hoạt tính thủy phân
xylan khi các nhóm thế arabinose bị loại bỏ. Không giống cellulase, các xylanase không kết hợp hoạt động trong quá trình thủy phân [35], [36], [48].
Xylanase đông khô của Thermomyces lanuginosus bị bất hoạt sau 2 tháng ở -
20°C, mặc dù các enzyme tinh khiết ở dạng lỏng không mất hoạt tính [4]. Một vài
xylanase đã được tinh chế và xác định cấu trúc như xylanase của Thermoascus aurantiacus (TAX) với 301 axit amin [46]. Cấu trúc bậc 1 của nó tương đồng với
cấu trúc xylanase của nấm ưa ấm. Vị trí bám vào cơ chất chứa glutamate và histidine và được tích điện âm như với các xylanase khác. Natesh và cộng sự cho rằng cầu disulfide và cầu muối làm bền protein bằng cách giữ các cấu trúc bậc hai, góp phần vào tính bền nhiệt của các nếp gấp. Tuy nhiên, khi TAX được so sánh với các xylanase khác của nấm mesophilic, không có mối tương quan giữa số lượng cầu muối và sự gia tăng tính bền nhiệt [50]. Thay vào đó, tính bền nhiệt của TAX xuất hiện chủ yếu là do sự đóng gói các đầu kỵ nước, các tương tác có lợi của các chuỗi bên với lưỡng cực xoắn, và sự có mặt của proline tại đầu N của cấu trúc xoắn làm giảm sự tự do tạo hình của phân tử protein.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt được phân lập từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn ủ, rơm ủ, lá cây mục… thu thập trên địa bàn các tỉnh Hà Nội, Hà Nam, Vĩnh Phúc.
2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 2.2.1. Hóa chất 2.2.1. Hóa chất
Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và chuyên dụng. Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các hãng: Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Difco (Mỹ), Invitrogen (Mỹ), Fermentas (Đức), Roth (Đức). Các hóa chất dùng cho nuôi cấy, phân tích có nguồn gốc từ Thụy Điển, Trung Quốc, Việt Nam.
Hóa chất dùng cho nuôi cấy: Agar; Glucose; Yeast extract; Peptone; Malt;
Phenolchlorofom; Malt extract.
Hóa chất dùng cho phân tích: 3,5 Dinitrosalicylic acid; Sodium hydroxide;
Sodium potassium tartrate; Phenol tinh thể; Sodium metabisulfite; Citric acid monohydrate; Glucose, Ammonium sulfate; Urea; Potassium dihydrogen phosphate; Calcium chloride; Magnesium sulfate heptahydrate; Cobalt (II) chloride hexahydrate; Tween 80%; Cacboxymethyl cellulase; Congo red. Hóa chất dùng cho điện di protein: Acrylamide; Tris-base; Amonium per
sulfate; Glycine; Methanol; N’N’-bis-methylene-acrylamide; HCl; Sodium dodecyl sulfate; Acetic acid.
Hóa chất dùng cho tách chiết và tinh chế DNA: dd SSC 2; Nước cất 2 lần thanh trùng; phenol + chloroform (1:1); Kit Silica Bead DNA Gel Extraction (Silica powder suspension, TBE conversion buffer, Concentrated Washing buffer, Binding buffer).
Hóa chất dùng cho PCR: Enzyme Taq ADN Polymease; dNTPs; Thang
ADN mẫu dùng trong điện di; Agarose dùng trong điện di; Ethidium Bromide để nhuộm gen. .
2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
Máy móc, thiết bị: bộ điện di ngang (Pharmacia Biotech, Gibco), box cấy (BioblockScientific, Pháp), cân điện tử (Precisa, Thụy Điển), kính hiển vi quang học (Eclipse E600, Nikon, Nhật), lò vi sóng (LG, Hàn Quốc), máy đo pH (Toledo, Anh), máy lắc ổn nhiệt (Eppendorf, Đức), máy ly tâm cao tốc (Heraeus–Sepatech), máy PCR (PE-GeneAmp PCR System 9700), máy soi gel (Benchtop UV- Transilluminator, VWR), Nồi hấp thanh trùng (Himayatoko, Nhật), tủ lạnh giữ giống (Electrolux, Thụy Điển), tủ nuôi cấy (Sanyo, Nhật), máy phá tế bào (Mini Beadbeater, Biospec Products)…
Dụng cụ: Đĩa Petri, pipette tự động các loại, ống falcon, ống nghiệm, ống eppendorf, ống đong, đèn cồn, bình tam giác (loại từ 20-1000), bình Schott, que cấy,....
2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol 2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol
Thành phần: Malt (1%), glucose (1%), agar (2%), chloramphenicol (100
ppm, pha stock 1% trong ethanol).
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô.
Tác dụng: Làm môi trường phân lập 2.3.2. Môi trường PDA
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô. Để chuẩn bị thạch nghiêng cũng cân các thành phần như trên, quay nóng cho tan thạch bằng lò vi sóng, dùng pipet hút 4 ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, bảo quản trong tủ mát.
Tác dụng: dùng làm môi trường nuôi cấy và giữ giống.
2.3.3. Môi trường lên men lỏng Thành phần: Thành phần:
- Môi trường (1000 ml): KH2PO4 (4 g), (NH4)2SO4 (13.6 g), CaCl2.2H2O (0.8 g), MgSO4.7H2O (0.6 g), Bacto peptone (6 g), Tween 80 1% (20 ml), cơ chất cám mì (20 g).
- Vi lượng (50 ml): FeSO4.7H2O (0.5 g), MnSO4.H2O (0.16 g), ZnSO4.7H2O (0.14 g), CoCl.6H2O (0.2 g).
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Bổ sung 1ml vi lượng vào
1000 ml môi trường lên men sau đó hấp thanh trùng 121°C trong 15 phút. Tác dụng: môi trường lên men nấm mốc thu nhận enzyme.
2.3.4. Môi trường YM
Thành phần (1000 ml): Yeast extract (3 g), malt extract (3 g), glucose (10 g), pepton (1 g), nước cất.
Chuẩn bị: Các thành phần trên được cân và hòa tan trong nước, dùng pipet
hút 3ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Để môi trường ở điều kiện vô trùng tới nguội rồi bảo quản trong tủ lạnh. Tác dụng: làm môi trường nuôi giống tách ADN.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt
Các loại mẫu được thu thập ở các địa điểm và thời gian khác nhau. Mẫu được pha loãng bằng dung dịch nước muối NaCl 0.9% từ nồng độ 10-1 đến 10-5, votex đều. Dùng pipet hút lần lượt 100 µl mẫu nồng độ 10-2 đến 10-5 vào đĩa thạch môi trường Malt-glucose 2°Bx có kháng sinh như đã nêu ở mục 2.3.1. Dùng que chang vô trùng chang đều khắp bề mặt đĩa thạch sau đó đĩa được mang đi nuôi cấy ở tủ nuôi 50°C trong 2-3 ngày. Sau khi nuôi cấy 2-3 ngày mang các đĩa thạch ra quan sát. Các khuẩn lạc khác nhau được nhặt ra, làm sạch và giữ giống trên môi trường thạch nghiêng PDA.
2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 50˚C sau 2-3 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x.
2.4.3. Tách chiết enzyme
Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng PDA trong vòng 4-5 ngày. Sau đó bổ sung khoảng 3-5 ml dịch Tween 80 0.05% vào, Vortex đều cho bào tử long ra, dịch này có thể được pha loãng thêm 10 lần nữa, nhỏ vào buồng đếm hồng cầu, đếm số lượng bào tử. Tính toán số lượng bào tử cần tiếp vào môi trường nuôi cấy lỏng ở trên với nồng độ là 5.105 bào tử trên ml môi trường (20 ml/bình nón 100 ml), nuôi cấy lỏng 7 ngày (lắc 150 vòng, 50°C). Sau 7 ngày lên men, dịch nuôi cấy đem ly tâm 10 000 rpm/10’/4C để loại cặn. Dịch enzyme thô được bảo quản ở -20°C.
2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS Đường chuẩn Đường chuẩn
Đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C trong 2h. Cân 0.5g glucose hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến đụng 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20C).
Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml.
Tiến hành dựng đường chuẩn:
- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.
- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6 ml DNS. Phản ứng màu ở 100oC trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn y = ax + b
Tiến hành
Mẫu thí nghiệm:
- Cho vào Eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (5 mảnh giấy lọc) và 0.2 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50°C trong 5 phút.
- Bổ sung vào Eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút.
- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên dịch enzyme đã bị bất hoạt (đun sôi enzyme trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozymes 50013 pha loãng tới 500-1000 lần.
Hoạt tính cellulase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS Cơ chất: Cơ chất:
- CMCase: CMC 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121˚C trong 15 phút, bảo quản ở 4˚C.
- Xylanase: xylan 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121°C trong 15 phút, bảo quản ở 4°C.
Đường chuẩn
Đường D-glucose (EU–G7) cho CMCase và D-xylose cho xylanase được sấy 105˚C trong 2h. Cân 0.5g đường hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch
stock 10mg/ml (bảo quản -20°C).
Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml. Tiến hành dựng đường chuẩn:
- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.
- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6ml DNS, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn: y = ax + b
Tiến hành Mẫu thí nghiệm:
- Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50˚C trong 5 phút.
- Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C trong 20 phút.
- Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên dịch enzyme bị bất hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương: phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.
Hoạt tính CMCase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
Hoạt tính xylanase được tính bằng số µmol D-xylose tạo ra khi thủy phân xylan trong một phút bởi một ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
2.4.6. Điện di protein
2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE
Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường. Vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vận tốc dịch chuyển khác nhau, nhờ đó mà có thể phân tách một hỗn hợp các protein.
Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein
STT Hóa chất Running gel 10% Stacking gel 5%
1 Nước cất 3 ml 1.385 ml 2 30% Acrylamide 2.5 ml 0.415 ml 3 1.5M Tris-HCl 1.9 ml (pH 8.8) 0.62 ml (pH 6.8) 4 10% SDS 80 µl 25 µl 5 30% APS 15 µl 7.5 µl 6 TEMED 15 µl 7.5 µl
Chuẩn bị mẫu: Mẫu enzyme được hòa tan trong sample buffer với tỉ lệ 4:1. Lắc đều và gia nhiệt 4 phút ở 100°C. Sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây. Mẫu chuẩn bị xong phải điện di ngay là tốt nhất hoặc để không quá 2 ngày ở 2°C.
Nạp mẫu:
- Mẫu đã chuẩn bị trên được load vào giếng với thể tích thích hợp. Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy. Lấy gel ra một cách cẩn thận tránh bị rách.
Tiến hành nhuộm gel:
- Nhuộm gel trong 50 ml CBB ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để CBB bắt
mầu với protein.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50
ml.
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein. Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết
quả.
2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram
Nguyên tắc: Hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất (CMC hoặc xylan). Sau khi phân tách, phản ứng enzyme được tiến hành trong gel, enzyme có mặt sẽ thuỷ phân cơ chất. Sau phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm Congo Red. Những phần cơ chất bị enzyme thuỷ phân sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, và do đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với màu nền của gel.
Thành phần gel: Giống với thành phần gel SDS-PAGE chỉ khác ở phần running gel thay nước cất bằng dung dịch cơ chất.
Tiến hành tương tự như điện di SDS-PAGE nhưng phần nhuộm gel làm như sau:
- Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X-100, lắc 30 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) ấm 30 phút ở 50°C (hoặc lâu hơn đến 12 giờ).
- Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0.1%, lắc 30 phút.
- Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200 ml NaCl 1M, rửa 2 lần mỗi lần 15 phút.
- Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả. 2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc
Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 50°C trong 2-3 ngày. Lấy 2 vòng que cấy tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2 vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua