2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol
Thành phần: Malt (1%), glucose (1%), agar (2%), chloramphenicol (100
ppm, pha stock 1% trong ethanol).
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô.
Tác dụng: Làm môi trường phân lập 2.3.2. Môi trường PDA
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút sau đó để môi trường nguội xuống 70-80°C, đổ ra đĩa petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ mát sau khi môi trường khô. Để chuẩn bị thạch nghiêng cũng cân các thành phần như trên, quay nóng cho tan thạch bằng lò vi sóng, dùng pipet hút 4 ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút, bảo quản trong tủ mát.
Tác dụng: dùng làm môi trường nuôi cấy và giữ giống.
2.3.3. Môi trường lên men lỏng Thành phần: Thành phần:
- Môi trường (1000 ml): KH2PO4 (4 g), (NH4)2SO4 (13.6 g), CaCl2.2H2O (0.8 g), MgSO4.7H2O (0.6 g), Bacto peptone (6 g), Tween 80 1% (20 ml), cơ chất cám mì (20 g).
- Vi lượng (50 ml): FeSO4.7H2O (0.5 g), MnSO4.H2O (0.16 g), ZnSO4.7H2O (0.14 g), CoCl.6H2O (0.2 g).
Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Bổ sung 1ml vi lượng vào
1000 ml môi trường lên men sau đó hấp thanh trùng 121°C trong 15 phút. Tác dụng: môi trường lên men nấm mốc thu nhận enzyme.
2.3.4. Môi trường YM
Thành phần (1000 ml): Yeast extract (3 g), malt extract (3 g), glucose (10 g), pepton (1 g), nước cất.
Chuẩn bị: Các thành phần trên được cân và hòa tan trong nước, dùng pipet
hút 3ml vào mỗi ống nút xoáy mang hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Để môi trường ở điều kiện vô trùng tới nguội rồi bảo quản trong tủ lạnh. Tác dụng: làm môi trường nuôi giống tách ADN.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt
Các loại mẫu được thu thập ở các địa điểm và thời gian khác nhau. Mẫu được pha loãng bằng dung dịch nước muối NaCl 0.9% từ nồng độ 10-1 đến 10-5, votex đều. Dùng pipet hút lần lượt 100 µl mẫu nồng độ 10-2 đến 10-5 vào đĩa thạch môi trường Malt-glucose 2°Bx có kháng sinh như đã nêu ở mục 2.3.1. Dùng que chang vô trùng chang đều khắp bề mặt đĩa thạch sau đó đĩa được mang đi nuôi cấy ở tủ nuôi 50°C trong 2-3 ngày. Sau khi nuôi cấy 2-3 ngày mang các đĩa thạch ra quan sát. Các khuẩn lạc khác nhau được nhặt ra, làm sạch và giữ giống trên môi trường thạch nghiêng PDA.
2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 50˚C sau 2-3 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x.
2.4.3. Tách chiết enzyme
Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng PDA trong vòng 4-5 ngày. Sau đó bổ sung khoảng 3-5 ml dịch Tween 80 0.05% vào, Vortex đều cho bào tử long ra, dịch này có thể được pha loãng thêm 10 lần nữa, nhỏ vào buồng đếm hồng cầu, đếm số lượng bào tử. Tính toán số lượng bào tử cần tiếp vào môi trường nuôi cấy lỏng ở trên với nồng độ là 5.105 bào tử trên ml môi trường (20 ml/bình nón 100 ml), nuôi cấy lỏng 7 ngày (lắc 150 vòng, 50°C). Sau 7 ngày lên men, dịch nuôi cấy đem ly tâm 10 000 rpm/10’/4C để loại cặn. Dịch enzyme thô được bảo quản ở -20°C.
2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS Đường chuẩn Đường chuẩn
Đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C trong 2h. Cân 0.5g glucose hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến đụng 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20C).
Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml.
Tiến hành dựng đường chuẩn:
- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.
- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6 ml DNS. Phản ứng màu ở 100oC trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn y = ax + b
Tiến hành
Mẫu thí nghiệm:
- Cho vào Eppendorf khoảng 10-11 mg giấy lọc (5 mảnh giấy lọc) và 0.2 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 để dung dịch đệm thấm ướt hoàn toàn mảnh giấy, giữ 50°C trong 5 phút.
- Bổ sung vào Eppendorf chứa cơ chất 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỉ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C chính xác trong 60 phút.
- Bổ sung ngay 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm tuy nhiên dịch enzyme đã bị bất hoạt (đun sôi enzyme trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương: (dùng enzyme thương phẩm) phân tích 1 mẫu Novozymes 50013 pha loãng tới 500-1000 lần.
Hoạt tính cellulase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân giấy lọc trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS Cơ chất: Cơ chất:
- CMCase: CMC 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121˚C trong 15 phút, bảo quản ở 4˚C.
- Xylanase: xylan 1% pha trong đệm Natri-citrate 0.05M pH 5 thanh
trùng 121°C trong 15 phút, bảo quản ở 4°C.
Đường chuẩn
Đường D-glucose (EU–G7) cho CMCase và D-xylose cho xylanase được sấy 105˚C trong 2h. Cân 0.5g đường hòa với 40 ml đệm Na-citrate 0.05M pH 5 trong cốc đong thủy tinh, sau đó định mức đến 50 ml thu được dung dịch
stock 10mg/ml (bảo quản -20°C).
Từ dung dịch stock pha loãng ra các nồng độ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml. Tiến hành dựng đường chuẩn:
- Cho vào các Eppendorf 0.3 ml dung dịch đường.
- Bổ sung vào các Eppendorf 0.6ml DNS, phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm. Dựng được đường chuẩn: y = ax + b
Tiến hành Mẫu thí nghiệm:
- Hút 0.2 ml cơ chất vào eppendorf, giữ ở 50˚C trong 5 phút.
- Bổ sung 0.1 ml dịch enzyme (mẫu đã pha loãng với tỷ lệ thích hợp), cho enzyme phản ứng với cơ chất ở 50°C trong 20 phút.
- Bổ sung 0.6 ml DNS để ngừng phản ứng. Phản ứng màu ở 100°C trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0.2 ml dịch phản ứng + 0.9 ml nước cất. Đo OD 540 nm.
Mẫu đối chứng thí nghiệm: Các bước làm giống như mẫu thí nghiệm, tuy nhiên dịch enzyme bị bất hoạt (trước khi phản ứng đun sôi enzyme trong 10 phút).
Mẫu đối chứng dương: phân tích 1 mẫu enzyme thương phẩm.
Hoạt tính CMCase được tính bằng số µmol D-glucose tạo ra khi thủy phân CMC trong một phút bởi 1 ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
Hoạt tính xylanase được tính bằng số µmol D-xylose tạo ra khi thủy phân xylan trong một phút bởi một ml enzyme ở pH 5, nhiệt độ 50°C.
2.4.6. Điện di protein
2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE
Nguyên tắc: Dựa trên quá trình dịch chuyển của các phân tử protein tích điện trong một dung dịch đặt trong điện trường. Vận tốc dịch chuyển của các phân tử mang điện phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thước của phân tử do đó các phân tử protein khác nhau sẽ có vận tốc dịch chuyển khác nhau, nhờ đó mà có thể phân tách một hỗn hợp các protein.
Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein
STT Hóa chất Running gel 10% Stacking gel 5%
1 Nước cất 3 ml 1.385 ml 2 30% Acrylamide 2.5 ml 0.415 ml 3 1.5M Tris-HCl 1.9 ml (pH 8.8) 0.62 ml (pH 6.8) 4 10% SDS 80 µl 25 µl 5 30% APS 15 µl 7.5 µl 6 TEMED 15 µl 7.5 µl
Chuẩn bị mẫu: Mẫu enzyme được hòa tan trong sample buffer với tỉ lệ 4:1. Lắc đều và gia nhiệt 4 phút ở 100°C. Sau đó ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây. Mẫu chuẩn bị xong phải điện di ngay là tốt nhất hoặc để không quá 2 ngày ở 2°C.
Nạp mẫu:
- Mẫu đã chuẩn bị trên được load vào giếng với thể tích thích hợp. Đánh dấu thứ tự các giếng vào sổ để phân biệt được các mẫu. Chạy 120 V. Khi mẫu chạy cách mép dưới của gel còn 0.5 cm nữa thì dừng máy. Lấy gel ra một cách cẩn thận tránh bị rách.
Tiến hành nhuộm gel:
- Nhuộm gel trong 50 ml CBB ở 50°C trong 1 giờ hoặc lâu hơn để CBB bắt
mầu với protein.
- Tẩy màu bằng dung dịch tẩy I ở 50°C trong 30 phút, lặp lại 2 lần mỗi lần 50
ml.
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch tẩy II ở nhiệt độ thường, kèm theo lắc tới khi thấy rõ các vạch protein. Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết
quả.
2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram
Nguyên tắc: Hỗn hợp gồm các enzyme và protein được phân tách trên gel SDS-PAGE có bổ sung cơ chất (CMC hoặc xylan). Sau khi phân tách, phản ứng enzyme được tiến hành trong gel, enzyme có mặt sẽ thuỷ phân cơ chất. Sau phản ứng, bản gel sẽ được nhuộm Congo Red. Những phần cơ chất bị enzyme thuỷ phân sẽ không bắt màu thuốc nhuộm, và do đó tạo nên các băng màu sáng hơn so với màu nền của gel.
Thành phần gel: Giống với thành phần gel SDS-PAGE chỉ khác ở phần running gel thay nước cất bằng dung dịch cơ chất.
Tiến hành tương tự như điện di SDS-PAGE nhưng phần nhuộm gel làm như sau:
- Ngâm gel trong 100 ml 2% Triton X-100, lắc 30 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) lạnh, lắc 15 phút (làm 2 lần).
- Ngâm gel trong 100 ml dung dịch đệm (0.1M natri acetate, pH 5) ấm 30 phút ở 50°C (hoặc lâu hơn đến 12 giờ).
- Nhuộm gel trong 100 ml dung dịch Congo red 0.1%, lắc 30 phút.
- Cố định màu bằng cách rửa gel trong 200 ml NaCl 1M, rửa 2 lần mỗi lần 15 phút.
- Quan sát, chụp ảnh hoặc scan gel để lưu kết quả. 2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc
Tế bào nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường YM dịch ở 50°C trong 2-3 ngày. Lấy 2 vòng que cấy tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2 vào mỗi ống. Lắc đều và đun ở 100°C trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 l nước cất vô trùng, 100 l hạt thủy tinh, 150 l dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1 phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có chứa ADN, sau đó ADN được giữ ở -20°C.
2.4.8. Phương pháp tinh chế ADN
Do ADN của nấm mốc còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi dùng ADN làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế ADN bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 l dịch trong chứa ADN cho vào Eppendorf vô trùng. Bổ sung 150 l dung dịch Binding buffer có chứa Silica. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 2 phút. Hút bỏ dịch do ADN đã bám trên bề mặt các hạt thủy tinh. Rửa 3 lần bằng Washing buffer. Sau đó phơi khô rồi bổ sung 15 l nước cất vô trùng dùng cho PCR. Ly tâm ở 12000 rpm trong 1 phút, ADN ở phần dịch nổi là
ADN đã được tinh chế. ADN sau khi tinh chế có thể dùng làm khuôn cho phản ứng PCR, phần còn lại giữ ở -20C.
2.4.9. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing
Phản ứng PCR fingerprinting được tiến hành với thành phần phản ứng: Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR fingerprinting. Thành phần Thể tích Đệm phản ứng (10x) 10 l MgCl2 (25 mM) 4 µl dNTPs (20 mM mỗi loại) 2 l Mồi MST2 (GAC)5 (20 M) 4 l
Taq DNA polymerase (5 u/l) 0,5 l
ADN khuôn 1,5 l
Nước dùng cho PCR 78 l
Tổng cộng 100 l
Tùy vào các mục đích khác nhau thể tích thành phần phản ứng có thể thay đổi khi đó thể tích của các thành phần được điều chỉnh sao cho tỉ lệ giữa chúng không thay đổi. Sau khi trộn các thành phần phản ứng như trên, phản ứng được tiến hành trên máy PE-GeneAmp PCR system 9700 với chu trình nhiệt như sau: Biến tính 94°C trong vòng 2 phút. Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94°C trong vòng 40 giây, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút 30 giây và kéo dài ở 72°C trong 2 phút.
2.4.10. Phương pháp điện di ADN
Các sản phẩm sau khi chạy PCR được điện di trên gel agarose 1.5% với dung dịch đệm là 0.5TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1.5% được đun tan trong đệm TAE bằng lò vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60-70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho bản gel chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE. Dùng micropipette nhỏ các sản phẩm sau PCR vào các giếng của bản
gel. Với các gel sử dụng răng lược nhỏ, dùng 3-5 l mẫu cho mỗi giếng. Điện di với hiệu điện thế 50V.
2.4.11. Nhuộm gel và đọc kết quả
Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromit 0.5 g/ml pha trong nước cất (trong 30 phút), sau đó vớt bản gel ra và rửa qua bằng nước cất để loại bỏ ethidium bromide bám không đặc hiệu. Sau khi rửa, các băng DNA được quan sát bằng máy soi gel Benchtop UV-Transilluminator VWR. Ảnh được chụp bằng máy ảnh Olympus 4040Z.
2.4.12. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA
ADN sau khi được tách và tinh chế như trên, tiến hành phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của rDNA với thành phần và tỷ lệ như sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS.
Thành phần Thể tích Đệm phản ứng (10x) 10 l MgCl2 (25 mM) 4 µl dNTPs (20mM mỗi loại) 4 l Mồi ITS1 (10 M) 2 l Mồi NL4 (10 M) 2 l
Taq DNA polymerase (5u/l) 0,5 l
DNA khuôn 1 l
Nước dùng cho PCR 76,5 l
Tổng cộng 100 l
Tiến hành nhân đoạn ADN bằng kĩ thuật PCR trên máy Gene Amp, System 9700 (PE). Chu trình gia nhiệt như sau: Biến tính 94°C trong vòng 2 phút. Tiếp theo mẫu được nhân lên bởi 35 chu kì liên tiếp với các bước: biến tính ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi ở 52°C trong 1 phút và kéo dài ở 72°C trong 2 phút.
Sản phẩm PCR sau đó cũng được kiểm tra bằng điện di và nhuộm bằng ethidium bromit như trên, và soi bằng máy soi gel. Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng Silica bead DNA Gel extraction Kit. Sau đó sản phẩm PCR được đọc
trình tự với mồi ITS4 và NL1. Kết quả đọc trình tự được xử lý với phần mềm BioEdit.
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt 3.1.1. Kết quả phân lập 3.1.1. Kết quả phân lập
Nấm mốc chịu nhiệt thường có mặt trong các loại đất và bên trong sự phân hủy các chất hữu cơ được tích lũy trong môi trường ấm áp, ẩm ướt, và hiếu khí. Ví dụ quen thuộc nhất là đống phân ủ vườn, đặc biệt hơn là phân ủ của các nhà máy xử lý chất thải, và các compost được sử dụng để sản xuất nấm thương mại. Hệ vi sinh vật trong phân compost có khả năng thủy phân mạnh cellulose cũng như các hợp phần khác của lignocellulose. Nhiệt độ trung bình trong đống ủ khoảng 40°C-50°C