3.1.1. Kết quả phân lập
Nấm mốc chịu nhiệt thường có mặt trong các loại đất và bên trong sự phân hủy các chất hữu cơ được tích lũy trong môi trường ấm áp, ẩm ướt, và hiếu khí. Ví dụ quen thuộc nhất là đống phân ủ vườn, đặc biệt hơn là phân ủ của các nhà máy xử lý chất thải, và các compost được sử dụng để sản xuất nấm thương mại. Hệ vi sinh vật trong phân compost có khả năng thủy phân mạnh cellulose cũng như các hợp phần khác của lignocellulose. Nhiệt độ trung bình trong đống ủ khoảng 40°C-50°C và có thể lên tới 80°C-90°C vì vậy hệ vi sinh vật trong đống ủ chủ yếu là các chủng chịu nhiệt đặc biệt là nấm mốc và vi khuẩn đặc biệt là nhóm nấm mốc chịu nhiệt.Với mục đích tìm kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mạnh chúng tôi tiến hành phân lập các chủng nấm mốc chịu nhiệt trong các mẫu phân compost và đất thu thập từ các địa điểm khác nhau trên địa bản Hà Nội và một số tỉnh thành.
Các loại mẫu khác nhau được thu thập ở các địa điểm khác nhau trên địa bàn Hà Nội, Vĩnh Phúc, Hà Nam, Yên Bái. Môi trường dùng cho phân lập có thành phần như đã nêu ở phần 2.3.1. Từ 20 mẫu khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1.
Kết quả phân lập cho thấy các chủng nấm mốc chịu nhiệt được tìm thấy trong các mẫu chứa nguyên liệu hữu cơ được ủ lớn hơn và đa dạng hơn rất nhiều so với các mẫu đất và lá cây thông thường đặc biệt là các compost do bà con nông dân ủ đống rơm rạ, rác thải… với phân trâu bò, lợn gà và các mẫu compost xưởng trồng nấm là đa dạng hơn cả. Điều này cũng dễ hiểu do nguồn chất dinh dưỡng trong các mẫu này quá phong phú tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển. Các chủng nấm mốc sau khi phân lập sẽ được phân nhóm bằng hình thái tế bào, phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting.
Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được.
STT Tên mẫu Nơi lấy mẫu Ký hiệu chủng
1 Phân ủ Lý Nhân, Hà Nam FCH 5.1, FCH 5.2, FCH 5.3, FCH 5.4, FCH 5.5, FCH 5.6, FCH 5.7, FCH 6.1, FCH 6.2, FCH 6.3, FCH 6.4, FCH 6.5 Yên Bái FCH 12.1, FCH 14.1, FCH 14.3 Đông Anh- Hà Nội FCH 116.3
Nhội- Đông Anh- Hà Nội FCH 130.2
2 Nguyên liệu ủ xưởng trồng nấm
Yên Nghĩa, Hà Đông
FCH 7.1, FCH 7.2, FCH 8.1, FCH 8.2, FCH 9.1, FCH 9.2, FCH 9.3,
FCH 9.4 Tầm xá-Đông Anh- Hà Nội FCH 133.2, FCH 112.2 Nam Hồng-Đông Anh- Hà Nội FCH 143.4 3 Phân ủ nhà máy xử
lý rác Cầu Diễn Từ Liêm, Hà Nội
FCH 10.1, FCH 10.4, FCH 10.5, FCH 10.6
4 Đất và lá cây Ba vì, Hà Tây FCH 20.1, FCH 23.1, FCH 26.1, FCH 30.1, FCH 31.1, FCH 32.1 5 Rơm dạ mục Xuân Nộn-Đông Anh-
Hà Nội
FCH 102.1, FCH 121.3, FCH 121.4, FCH 136.2
6 Bịch nấm linh chi Công ty XNK nông sản ĐNA FCH 156.3 7 Mùn cưa ủ mục Lỗ khê-Đông Anh-Hà Nội FCH 142.4 8 Bã tinh bột sắn ủ Hoài Đức, Hà Nội FCH 149.2, FCH 151.3
3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào
Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường PDA thạch đĩa ở 50°C để quan sát hình thái khuẩn lạc và chụp ảnh tế bào. Sau 2-3 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, hình dạng và màu sắc của các chủng nấm mốc phân hóa khá rõ ràng. Hình thái tế bào và bào tử của các chủng được quan sát hình thái dưới kính hiển vi quang học Eclipse E600-Nikon ở vật kính 40 và được chụp thông qua camera JVC bằng phần mềm video capture. Quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc chúng tôi nhận thấy có sự phân hóa khá đa dạng. Khuẩn lạc ban đầu ở dạng sợi trắng sau 2-3 ngày nuôi cấy bắt đầu chuyển sang màu nâu, xám, xanh đen hoặc đen…Khuẩn lạc có nhiều dạng như nhung mịn, bông xốp…
Hình 3.1. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.1
Hình 3.2. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.3
Hình 3.4. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 10.4
Hình 3.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 112.2
Hình 3.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 23.1
Hầu hết các chủng nấm mốc phân lâp được đều có bào tử. Bào tử nấm mốc quen thuộc chỉ có ở một số chủng như FCH 5.1 cuống bào tử dạng bình không phân nhánh, bảo tử đính không có túi bao bao bọc hoặc có túi bao bọc như các chủng FCH 5.2. Một số chủng nấm mốc có bào tử như FCH 5.1, FCH 5.5 có mặt ở rất nhiều mẫu kể cả mẫu phân ủ và mẫu đất hay lá cây. Các chủng có hình thái khuẩn
lạc và tế bào giống nhau được nhóm chung vào một nhóm và tiếp tục được phân nhóm chính xác hơn nhờ kĩ thuật PCR-fingerprinting.
3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting
Để đánh giá tính đa dạng của các chủng nấm mốc phân lập được một cách chính xác, chúng tôi tiến hành phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 46 chủng phân lập được sử dụng mồi MST2 (có trình tự 5’-(GAC)5-3’). Chủng giống được nuôi cấy trên môi trường YM lỏng, lắc 150 rpm/ phút trong 2-3 ngày, sau đó tiến hành tách và tinh chế ADN. ADN sau khi tinh chế được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR. Sản phẩm được điện di trên agarose 1% trong TAE với hiệu điện thế 50V. Kết quả thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc phân lập được Bảng 3.2. Ký hiệu các chủng trong phổ fingrprinting
Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng Kí hiệu Chủng 1 FCH 5.1 13 FCH 5.7 25 FCH 133.2 37 FCH 102.1 2 FCH 6.1 14 FCH 6.4 26 FCH 130.2 38 FCH 136.2 3 FCH 9.1 15 FCH 5.4 27 FCH 14.1 39 FCH 149.2 4 FCH 10.1 16 FCH 151.3 28 FCH 151.3 40 FCH 121.3 5 FCH 5.3 17 FCH 7.1 29 FCH 23.1 41 FCH 12.1 6 FCH 6.2 18 FCH 7.2 30 FCH 30.1 42 FCH 20.1
7 FCH 5.5 19 FCH 8.2 31 FCH 142.4 43 FCH 31.1 8 FCH 6.5 20 FCH 9.2 32 FCH 112.2 44 FCH 116.3 9 FCH 8.1 21 FCH 9.3 33 FCH 14.3 45 FCH 143.4 10 FCH 10.6 22 FCH 9.4 34 FCH 156.3 46 FCH 26.1 11 FCH 5.2 23 FCH 10.4 35 FCH 121.4 12 FCH 6.3 24 FCH 10.5 36 FCH 32.1
Từ kết quả thể hiện ở phổ fingerprinting cho thấy, sản phẩm PCR nhân với mồi MTS2 của các chủng nấm mốc có các phổ băng khác nhau và khá đa dạng do sự phân bố về số lượng bản sao cũng như vị trí của ADN vệ tinh trong genome. Kỹ thuật phân nhóm sử dụng mồi thiết kế dựa trên ADN vệ tinh cho độ phân giải đến dưới loài. Các chủng có cùng một phổ băng chắc chắn sẽ thuộc cùng một loài, các chủng có phổ băng khác nhau có thể sẽ thuộc các loài khác nhau tùy theo mức độ khác biệt. Các chủng có cùng phổ băng sau đó được xếp cùng một nhóm.
3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra chủng đại Dựa vào kết quả phân nhóm bằng fingerprinting chúng tôi chọn ra chủng đại diện để phân tích trình tự. Chúng tôi chọn vùng ITS của rDNA để phân tích. Đoạn gen này có kích thước khoảng 600 bp và thường được dùng trong phân loại định tên nấm mốc. Chúng tôi đã tách ADN tổng số của các chủng nấm mốc sau đó dùng PCR nhân đặc hiệu đoạn ADN (kích thước khoảng 1200bp) chứa vùng ITS bằng cặp mồi ITS1, ITS4. Sản phẩm PCR được tinh chế và đọc trình tự. Kết quả đọc trình tự sau đó được xử lý bằng phần mềm BioEdit và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng BLAST. Tên loài cho các chủng được gán dựa trên sự tương đồng với trình tự gần nhất đăng ký trên GenBank.
Bảng 3.3. Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt
STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Căn cứ xác định tên loài 1 FCH 5.1 Aspergillus fumigatus rDNA sequencing ITS
2 FCH 6.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
3 FCH 9.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
4 FCH 10.1 Aspergillus fumigatus Finger MST2
5 FCH 5.2 Rhizomucor miehei rDNA sequencing ITS
6 FCH 6.3 Rhizomucor miehei Finger MST2
7 FCH 116.3 Rhizomucor miehei rDNA sequencing ITS
STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Căn cứ xác định tên loài
9 FCH 6.4 Rhizomucor pusillus Finger MST2
10 FCH 20.1 Rhizomucor pusillus rDNA sequencing ITS
11 FCH 26.1 Rhizopus microsporus rDNA sequencing ITS
12 FCH 5.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
13 FCH 6.2 Scytalidium thermophilum Finger MST2
14 FCH 121.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
15 FCH 121.4 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
16 FCH 14.3 Scytalidium thermophilum rDNA sequencing ITS
17 FCH 5.5 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
18 FCH 6.5 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
19 FCH 8.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
20 FCH 10.6 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
21 FCH 12.1 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
22 FCH 30.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
23 FCH 31.1 Thermomyces lanuginosus Finger MST2
24 FCH 32.1 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
25 FCH 130.2 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
26 FCH 143.4 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
27 FCH 149.2 Thermomyces lanuginosus rDNA sequencing ITS
28 FCH 7.1 Chaetomium thermophilum rDNA sequencing ITS
29 FCH 7.2 Chaetomium thermophilum Finger MST2
30 FCH 8.2 Chaetomium thermophilum Finger MST2
31 FCH 23.1 Myceliophthora thermophila rDNA sequencing ITS
32 FCH 5.4 Myceliophthora fergusii rDNA sequencing ITS
33 FCH 102.1 Myceliophthora thermophila Finger MST2
34 FCH 112.2 Myceliophthora thermophila rDNA sequencing ITS
35 FCH 133.2 Myceliophthora thermophila Finger MST2
36 FCH 156.3 Myceliophthora thermophila Finger MST2
37 FCH 9.2 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
38 FCH 9.3 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
39 FCH 9.4 Thielavia terrestris rDNA sequencing ITS
40 FCH 136.2 41 FCH 142.4 42 FCH 151.3 43 FCH 14.1
44 FCH 10.5 Malbranchea cinnamomea rDNA sequencing ITS
45 FCH 5.6 Melanocarpus albomyces rDNA sequencing ITS
46 FCH 10.4 Talaromyces thermophilus rDNA sequencing ITS Kết quả đọc trình tự cho thấy thành phần các loài nấm mốc chịu nhiệt khá đa
dạng trong đó có một số loài rất phổ biến như Aspergillus fumigatus, Thermomyces lanuginosus, hay Rhizomucor. Có thể dễ dàng bắt gặp những nhóm này trong đất hay đống ủ với số lượng lớn nhưng do Aspergillus fumigatus là một loài nấm nguy
hiểm nên chúng tôi chỉ lấy đại diện một số chủng ở một số mẫu. 2 nhóm nấm mốc
chịu nhiệt được phát hiện sớm nhất Rhizomucor và Thermomyces lanuginosus cũng
được tìm thấy khá nhiều trong các loại mẫu thu thập được. Ngoài 3 nhóm chủng trên, chúng tôi cũng phân lập được một số nhóm hoạt động thủy phân lignocellulose
khá tốt như Scytalidium thermophilum, Chaetomium thermophilum, Myceliophthora thermophila. Các chủng này đã được nghiên cứu khá nhiều về gen và protein,
enzyme. Tuy nhiên chúng tôi cũng tìm thấy một số chủng nấm với số lượng ít (hầu
như chỉ 1 chủng/ 1loài) Malbranchea cinnamomea, Melanocarpus albomyces, Talaromyces thermophilus. Hầu hết các chủng này được phân lập từ phân ủ đặc biệt
là phân ủ các xưởng trồng nấm.
3.2. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose
Lignocellulose là một hợp chất phức tạp và không dễ dàng để xử lý. Mối quan hệ giữa cellulose và hemicellulose trong thành tế bào thực vật bậc cao chặt chẽ hơn chúng ta tưởng rất nhiều. Để thủy phân hiệu quả lignocellulose đòi hỏi một hệ thống các enzyme khác nhau hoạt động kết hợp. Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau có thể kể đến vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn tuy nhiên có thể nói nấm mốc là nhóm vi sinh vật sinh hệ enzyme thủy phân lignocellulose đầy đủ nhất trong hệ vi sinh vật có khả năng phân giải lignocellulose vì vậy đây là đối tượng nghiên cứu chính và cũng là nguồn thu nhận enzyme thủy phân đầy tiềm năng, đặc biệt là nhóm nấm mốc chịu nhiệt. Với các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập được chúng tôi cũng tiến hành nghiên cứu khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose bằng cách nuôi cấy lên men thu nhận enzyme để kiểm tra hoạt tính. 46 chủng nấm mốc được nuôi lắc trong môi trường đã nêu ở phần phương pháp ở 50°C, 140 rpm/phút trong 7 ngày. Sau đó dịch nuôi cấy được ly tâm 10000 rpm/10 phút để loại cặn thu được dịch enzyme thô và tiến hành phân tích hoạt tính enzyme.
Dịch enzyme thô được phân tích theo phương pháp DNS đã nêu ở phần 2.4. Kết quả phân tích dịch nuôi cấy nấm mốc cho thấy hoạt tính enzyme cellulase rất thấp. Hoạt tính trung bình của các chủng nấm mốc chỉ khoảng 0.03-0.04 IU/ml và sai khác giữa các chủng là không lớn. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Cellulase (IU/ml)
1 FCH 5.1 Aspergillus fumigatus 0.049 2 FCH 6.1 Aspergillus fumigatus 0.056 3 FCH 9.1 Aspergillus fumigatus 0.042 4 FCH 10.1 Aspergillus fumigatus 0.034 5 FCH 5.2 Rhizomucor miehei 0.031 6 FCH 6.3 Rhizomucor miehei 0.063 7 FCH 116.3 Rhizomucor miehei 0.008 8 FCH 5.7 Rhizomucor pusillus 0.044 9 FCH 6.4 Rhizomucor pusillus 0.036 10 FCH 20.1 Rhizomucor pusillus 0.002 11 FCH 26.1 Rhizopus microsporus 0.033 12 FCH 5.3 Scytalidium thermophilum 0.051 13 FCH 6.2 Scytalidium thermophilum 0.073 14 FCH 121.3 Scytalidium thermophilum 0.012 15 FCH 121.4 Scytalidium thermophilum 0.012 16 FCH 14.3 Scytalidium thermophilum 0.003 17 FCH 5.5 Thermomyces lanuginosus 0.042 18 FCH 6.5 Thermomyces lanuginosus 0.047 19 FCH 8.1 Thermomyces lanuginosus 0.043 20 FCH 10.6 Thermomyces lanuginosus 0.040 21 FCH 12.1 Thermomyces lanuginosus 0.002 22 FCH 30.1 Thermomyces lanuginosus 0.000 23 FCH 31.1 Thermomyces lanuginosus 0.000 24 FCH 32.1 Thermomyces lanuginosus 0.003 25 FCH 130.2 Thermomyces lanuginosus 0.001 26 FCH 143.4 Thermomyces lanuginosus 0.010 27 FCH 149.2 Thermomyces lanuginosus 0.006 28 FCH 7.1 Chaetomium thermophilum 0.041 29 FCH 7.2 Chaetomium thermophilum 0.055 30 FCH 8.2 Chaetomium thermophilum 0.031 31 FCH 23.1 Myceliophthora thermophila 0.044 32 FCH 5.4 Myceliophthora fergusii 0.049 33 FCH 102.1 Myceliophthora thermophila 0.016
STT Kí hiệu chủng Tên phân loại Cellulase (IU/ml) 34 FCH 112.2 Myceliophthora thermophila 0.015 35 FCH 133.2 Myceliophthora thermophila 0.060 36 FCH 156.3 Myceliophthora thermophila 0.017 37 FCH 9.2 Thielavia terrestris 0.064 38 FCH 9.3 Thielavia terrestris 0.049 39 FCH 9.4 Thielavia terrestris 0.045 40 FCH 136.2 0.029 41 FCH 142.4 0.023 42 FCH 151.3 0.034 43 FCH 14.1 0.022 44 FCH 10.5 Malbranchea cinnamomea 0.034 45 FCH 5.6 Melanocarpus albomyces 0.063 46 FCH 10.4 Talaromyces thermophilus 0.027
Một số nghiên cứu đã chỉ ra ràng một số loài nấm chịu nhiệt có thể thủy phân cellulose nhanh chóng nhưng cellulase tách chiết từ môi trường nuôi cấy lại có hoạt tính rất thấp [51] tương tự như kết quả phân tích. Điều này mâu thuẫn với một số
báo cáo trên loài nấm Spothermophile rotrichum [22] và Talaromyces emersonii
[30], hai chủng nấm mốc này có thể sản xuất cellulase gần tương đương
Trichoderma reesei, được coi là nguồn cellulase tốt nhất từ nấm mốc mesophilic.
Mặc dù năng suất cellulase thay đổi giữa các dòng nhưng khi sử dụng thống nhất các phương pháp phân tích cellulase, Bhat và Maheshwari (1987) đã chứng minh được rằng hoạt tính endoglucanase và exoglucanase trong dịch môi trường lên men
tối ưu của Spothermophile rotrichum thấp hơn khoảng 10 lần và hoạt tính β- glucosidase thấp hơn khoảng 1,6 lần so với nấm Trichoderma reesei. Mặc dù hoạt tính cellulase thấp hơn, Spothermophile rotrichum lại cho thấy khả năng phân giải cellulose nhanh hơn và tăng trưởng gấp năm lần so với nấm T. reesei. Spothermophile rotrichum có hệ thống cellulase mạnh mẽ đã được chứng thực bởi
các nghiên cứu sự tăng trưởng của nó trên cellulose không hòa tan và glucose. Ý nghĩa hơn, những nghiên cứu này đưa ra một sự nghi ngờ mạnh mẽ về quan điểm cho rằng mức độ tiết cellulase quyết định mức độ cellulolysis. Một câu hỏi được đặt ra mà chưa có lời giải là sự hình thành cellulase trong nấm liệu có tương quan trực tiếp với sự tăng trưởng sợi nấm, nghĩa là các enzyme được tạo ra trong trophophase
Comment [HB1]: Chuyển sang tiếng việt: thuỷ phân cellulose
hay idiophase? Để xác định điều này, sự sinh trưởng của Spothermophile rotrichum
trên cellulose được tạm ngừng tại các thời điểm khác nhau nhờ bổ sung