Quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi thường phải trải qua công đoạn ép viên ở nhiệt độ khoảng 70°C trong vòng 15-20 phút cho nên nếu enzyme không bền ở khoảng nhiệt độ này thì sẽ không có giá trị khi bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi. Chính vì vậy, bên cạnh việc phân tích hoạt tính enzyme của 46 chủng nấm mốc ở 3 pH khác nhau chúng tôi còn tiến hành nghiên cứu về độ bền nhiệt của enzyme.
Chúng tôi lấy một thể tích mẫu enzyme thô như nhau của tất cả 46 chủng nấm mốc, giữ ở 70°C và nhiệt độ phòng trong 20 phút sau đó enzyme được giữ lạnh ở 4°C qua đêm. Sau đó phân tích hoạt tính CMCase và xylanase. Kết quả thể hiện ở bảng 3.9, 3.10.
CMCase
Bảng 3.9. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng và 70°C 20 phút.
STT Kí hiệu
chủng Tên phân loại
CMCase (IU/ml) Tỉ lệ % T°70 /T°Phòng T°Phòng T°70 1 FCH 5.1 Aspergillus fumigatus 0.349 0.171 49.1 2 FCH 6.1 Aspergillus fumigatus 0.431 0.131 30.4 3 FCH 9.1 Aspergillus fumigatus 0.304 0.224 73.5 4 FCH 10.1 Aspergillus fumigatus 0.300 0.135 45.1 5 FCH 5.2 Rhizomucor miehei 0.019 0.000 KXĐ 6 FCH 6.3 Rhizomucor miehei 0.028 0.003 KXĐ 7 FCH 116.3 Rhizomucor miehei 0.014 0.024 KXĐ 8 FCH 5.7 Rhizomucor pusillus 0.019 0.000 KXĐ 9 FCH 6.4 Rhizomucor pusillus 0.009 0.021 KXĐ 10 FCH20.1 Rhizomucor pusillus 0.000 0.009 KXĐ 11 FCH 26.1 Rhizopus microsporus 0.003 0.017 KXĐ 12 FCH 5.3 Scytalidium thermophilum 0.564 0.316 56.1 13 FCH 6.2 Scytalidium thermophilum 0.659 0.420 63.7 14 FCH 121.3 Scytalidium thermophilum 0.398 0.212 53.2 15 FCH 121.4 Scytalidium thermophilum 0.376 0.232 61.7 16 FCH 14.3 Scytalidium thermophilum 0.610 0.364 59.7 17 FCH 5.5 Thermomyces lanuginosus 0.024 0.014 KXĐ 18 FCH 6.5 Thermomyces lanuginosus 0.049 0.000 KXĐ 19 FCH 8.1 Thermomyces lanuginosus 0.000 0.040 KXĐ 20 FCH 10.6 Thermomyces lanuginosus 0.008 0.000 KXĐ 21 FCH 12.1 Thermomyces lanuginosus 0.003 0.000 KXĐ 22 FCH 30.1 Thermomyces lanuginosus 0.026 0.007 KXĐ 23 FCH31.1 Thermomyces lanuginosus 0.047 0.000 KXĐ 24 FCH 32.1 Thermomyces lanuginosus 0.030 0.026 KXĐ 24 FCH 130.2 Thermomyces lanuginosus 0.012 0.000 KXĐ 26 FCH 143.4 Thermomyces lanuginosus 0.036 0.029 KXĐ 27 FCH 149.2 Thermomyces lanuginosus 0.063 0.041 KXĐ 28 FCH 7.1 Chaetomium thermophilum 0.551 0.404 73.3 29 FCH 7.2 Chaetomium thermophilum 0.522 0.387 74.2 30 FCH 8.2 Chaetomium thermophilum 0.529 0.440 83.1 31 FCH 23.1 Myceliophthora thermophila 0.268 0.105 39.0 32 FCH 5.4 Myceliophthora fergusii 0.533 0.362 67.8 33 FCH 102.1 Myceliophthora thermophila 0.428 0.306 71.5 34 FCH112.2 Myceliophthora thermophila 0.536 0.429 80.0 35 FCH 133.2 Myceliophthora thermophila 0.478 0.348 72.9 36 FCH 156.3 Myceliophthora thermophila 0.501 0.375 74.8 37 FCH 9.2 Thielavia terrestris 0.332 0.271 81.7 38 FCH 9.3 Thielavia terrestris 0.456 0.383 84.0 39 FCH 9.4 Thielavia terrestris 0.487 0.412 84.6 40 FCH 136.2 0.432 0.377 87.2 41 FCH 142.4 0.381 0.361 94.7
STT Kí hiệu
chủng Tên phân loại
CMCase (IU/ml) Tỉ lệ % T°70 /T°Phòng T°Phòng T°70 42 FCH151.3 0.443 0.408 92.2 43 FCH 14.1 0.255 0.223 87.5 44 FCH 10.5 Malbranchea cinnamomea 0.352 0.299 85.0 45 FCH 5.6 Melanocarpus albomyces 0.355 0.368 103.9 46 FCH 10.4 Talaromyces thermophilus 0.000 0.045 KXĐ (KXĐ: không xác định)
Không tính đến 19 chủng nấm mốc thuộc các nhóm Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Rhizopus microsporus, Thermomyces lanuginosus và Talaromyces thermophilus hầu như không có hoạt tính CMCase thì kết quả phân
tích CMCase cho thấy hầu hết các chủng khi giữ ở nhiệt độ 70°C trong 20 phút hoạt tính đều giảm đi so với khi lưu giữ ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên tỉ lệ hoạt tính enzyme ở nhiệt độ 70°C/T°phòng hầu như đều đạt trên 50%. Có thể thấy rằng các chủng nấm mốc này đều có CMCase khá bền nhiệt đặc biệt một số nhóm có thể bền đến khoảng 70-90%. Trong số 46 chủng nấm mốc nghiên cứu chỉ có duy nhất một
chủng Melanocarpus albomyces FCH 5.6 vẫn giữ được hoạt tính CMCase sau khi
giữ ở 70°C trong 20 phút. Xylanase
Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc cũng được kiểm tra độ bền nhiệt. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng và 70°C 20 phút.
STT Kí hiệu
chủng Tên phân loại
Xylanase, (IU/ml) Tỉ lệ % T°70 /T°Phòng T°Phòng T°70 1 FCH 5.1 Aspergillus fumigatus 2.07 0.925 44.6 2 FCH 6.1 Aspergillus fumigatus 1.46 0.444 30.3 3 FCH 9.1 Aspergillus fumigatus 1.42 0.376 26.5 4 FCH 10.1 Aspergillus fumigatus 1.60 0.583 36.4 5 FCH 5.2 Rhizomucor miehei 0.27 0.085 32.1 6 FCH 6.3 Rhizomucor miehei 0.27 0.090 33.6 7 FCH 116.3 Rhizomucor miehei 0.29 0.098 33.5
STT Kí hiệu
chủng Tên phân loại
Xylanase, (IU/ml) Tỉ lệ % T°70 /T°Phòng T°Phòng T°70 8 FCH 5.7 Rhizomucor pusillus 0.22 0.066 29.4 9 FCH 6.4 Rhizomucor pusillus 0.27 0.072 26.7 10 FCH20.1 Rhizomucor pusillus 0.27 0.056 20.9 11 FCH 26.1 Rhizopus microsporus 0.32 0.090 28.5 12 FCH 5.3 Scytalidium thermophilum 5.58 0.312 5.6 13 FCH 6.2 Scytalidium thermophilum 5.05 0.288 5.7 14 FCH 121.3 Scytalidium thermophilum 2.65 0.125 4.7 15 FCH 121.4 Scytalidium thermophilum 3.32 1.052 31.7 16 FCH 14.3 Scytalidium thermophilum 18.21 0.562 38.0 17 FCH 5.5 Thermomyces lanuginosus 55.80 11.703 21.0 18 FCH 6.5 Thermomyces lanuginosus 70.69 9.575 13.6 19 FCH 8.1 Thermomyces lanuginosus 61.94 11.230 18.1 20 FCH 10.6 Thermomyces lanuginosus 71.64 11.230 15.7 21 FCH 12.1 Thermomyces lanuginosus 66.43 14.067 21.2 22 FCH 30.1 Thermomyces lanuginosus 64.07 13.712 21.4 23 FCH31.1 Thermomyces lanuginosus 61.82 9.339 15.1 24 FCH 32.1 Thermomyces lanuginosus 42.79 7.920 18.5 25 FCH 130.2 Thermomyces lanuginosus 47.52 7.447 15.7 26 FCH 143.4 Thermomyces lanuginosus 57.57 9.811 17.0 27 FCH 149.2 Thermomyces lanuginosus 57.10 12.176 21.3 28 FCH 7.1 Chaetomium thermophilum 7.03 2.832 40.3 29 FCH 7.2 Chaetomium thermophilum 8.52 3.479 40.8 30 FCH 8.2 Chaetomium thermophilum 8.45 3.345 39.6 31 FCH 23.1 Myceliophthora thermophila 0.96 0.513 53.5 32 FCH 5.4 Myceliophthora fergusii 7.60 3.747 49.3 33 FCH 102.1 Myceliophthora thermophila 1.15 0.314 27.3 34 FCH112.2 Myceliophthora thermophila 1.89 0.492 26.0 35 FCH 133.2 Myceliophthora thermophila 1.20 0.563 46.9 36 FCH 156.3 Myceliophthora thermophila 3.37 0.662 19.7 37 FCH 9.2 Thielavia terrestris 1.84 0.783 42.5 38 FCH 9.3 Thielavia terrestris 1.47 0.851 57.9 39 FCH 9.4 Thielavia terrestris 1.55 1.147 74.1 40 FCH 136.2 4.59 0.563 12.3 41 FCH 142.4 4.36 2.515 57.7 42 FCH151.3 4.36 1.513 34.7 43 FCH 14.1 3.85 0.449 11.7 44 FCH 10.5 Malbranchea cinnamomea 6.64 1.726 26.0 45 FCH 5.6 Melanocarpus albomyces 4.67 1.017 21.8 46 FCH 10.4 Talaromyces thermophilus 44.43 18.799 42.3 (KXĐ: không xác định)
Qua kết quả phân tích, chúng tôi nhận thấy tất cả các chủng nghiên cứu đều có hoạt tính xylanase ở 70°C thấp hơn khá nhiều so với ở nhiệt độ phòng. Có 4
chủng nhóm Scytalidium thermophilum có thể coi là mất hết hoạt tính xylanase khi
mà tỷ lệ % hoạt tính ở 70°C so với nhiệt độ phòng chỉ đạt dưới 6%. Nhóm nấm mốc
có hoạt lực xylanase cao như Thermomyces lanuginosus cũng không còn giữ được hoạt tính ở nhiệt độ này, tỉ lệ hoạt tính chỉ đạt khoảng 15-20%. Nhóm Chaetomium thermophilum FCH 7.1, FCH 7.2, FCH 8.2, Talaromyces thermophilus FCH 10.4
đều chỉ giữ lại được 40 % hoạt tính xylanase. Những nhóm chủng được coi là giữ được hoạt tính tương đối khi giữ ở 70°C trong 20 phút cũng chỉ đạt tỉ lệ khoảng
50% và rất khác nhau giữa các chủng trong cùng một loài. Nhóm Myceliophthora
chỉ có 2 chủng FCH 5.4, FCH 133.2 vẫn có thể giữ được khoảng 50% hoạt tính, 3 chủng còn lại chỉ còn 20% hoạt tính. Nhóm nấm mốcThielavia terrestris FCH 9.2,
FCH 9.3, FCH 9.4 là nhóm hoạt động ở nhiệt độ cao khá tốt, enzyme xylanase của cả 3 chủng đều còn hoạt lực trên 40%. FCH 9.2 giữ được 42.5%, FCH 9.3 là 57.9%, đặc biệt trong đó chủng FCH 9.4 là chủng giữ lại được hoạt tính enzyme tốt nhất là
74.1%. Chủng nấm mốc duy nhất có CMCase bền nhiệt ở 70°C Melanocarpus albomyces FCH 5.6 lại không có xylanase bền nhiệt khi hoạt tính giảm chỉ còn
21.8%.
Kết quả phân tích độ bền nhiệt của enzyme CMCase và xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt cho thấy các chủng có hoạt tính CMCase đều bền nhiệt tương đối sau khi gia nhiệt ở 70°C trong 20 phút, còn hoạt tính xylanase của chúng
thì không như vậy. Nhóm Thielavia terrestris FCH 9.2, FCH 9.3, FCH 9.4 là nhóm
có hệ enzyme đang nghiên cứu khá bền nhiệt khi mà CMCase có thể bền đến hơn 80 % và xylanase bền trên 50%.
Qua quá trình nghiên cứu trên 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt được phân lập trên địa bàn các tỉnh Hà Nôi, Hà Nam, Yên Bái chúng tôi đã tìm hiểu được sơ bộ về đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose của 46 chủng nấm, tên phân loại và vị trí của chúng trong cộng đồng vi sinh vật chịu nhiệt.
Trong 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt, nhóm Thermomyces lanuginosus chiếm
số lượng lớn nhất (11 chủng), và cũng là nhóm nấm mốc đã được tập trung nghiên cứu rất từ rất lâu do khả năng sinh xylanase hoạt tính cao. Xylanase của
Thermomyces lanuginosus đã được tinh chế và xác định đặc tính ,các gen mã hóa
xylanase (XynA) cũng đã được clone và biểu hiện. Với mục tiêu tìm kiếm những enzyme mới thì đây không phải là nhóm nấm mốc chúng tôi tập trung đẩy sâu
nghiên cứu. Tương tự các nhóm Scytalidium thermophilum, Chaetomium thermophilum, Myceliophthora thermophila cũng đã được nghiên cứu khá chi tiết
về khả năng thủy phân lignocellulose.
Khi xem xét kết quả đánh giá hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau và khả
năng bền nhiệt chúng tôi nhận thấy nhóm Thielavia terrestris tuy khả năng sinh
tổng hợp CMCase và xylanase không quá cao nhưng các enzyme này lại bền nhiệt và có thể hoạt động được ở pH axit. Nhóm nấm mốc này đã được nghiên cứu về khả năng thủy phân thủy phân lignocellulose tuy nhiên chưa có nhiều báo cáo về việc clone và biểu hiện các gen cellulase và xylanase. Đây là kết quả tốt trong quá trình phân lập và tìm kiếm chủng nấm mốc chịu nhiệt, chịu pH và cũng mở ra một triển vọng để chúng tôi thực hiện những nghiên cứu chuyên sâu về enzyme này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Phân lập được 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt từ 20 mẫu khác nhau thu thập trên địa bàn các tỉnh Hà Nội, Hà Nam, Yên Bái.
2. Phân nhóm 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào, phổ fingerpriting và phân tích trình tự rDNA xác định tên loài của các chủng nấm mốc phân lập được.
3. Nghiên cứu một số đặc tính enzyme thủy phân lignocellulose của 46 chủng nấm mốc phân lập được:
- Hầu hết các chủng nâm mốc chịu nhiệt đều có hoạt tính CMCase trừ nhóm
Thermomyces lanuginosus và Talaromyces thermophilus tuy nhiên 2 nhóm
nấm mốc này lại hoạt động thủy phân xylan rất tốt.
- CMCase của Scytalidium thermophilum, Myceliophthora thermophila, nhóm
FCH 136.2, 142.4, 151.3, và chủng FCH 14.1 có thể hoạt động ở pH 7 trong
khi ở pH3 chỉ có Chaetomium thermophilum, Thielavia terrestris và nhóm
FCH 136.2, 142.4, 151.3 có hoạt tính enzyme.
- Xylanase của các chủng chịu nhiệt hầu như đều hoạt động tốt hơn ở pH 7
trong khi tại pH 3 chỉ có xylanase của Thielavia terrestris có hoạt tính.
- Các chủng nấm mốc hầu như đều có CMCase bền nhiệt đặc biệt loài
Melanocarpus albomyces vẫn giữ được nguyên hoạt tính nhưng chỉ một số chủng sinh xylanase bền nhiệt tương đối như nhóm Chaetomium thermophilum, Thielavia terrestris.
KIẾN NGHỊ
1. Chọn một chủng trong số 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt có khả năng hoạt động enzyme ổn định ở nhiệt độ cao và pH thấp tiến hành nuôi cấy trên các môi trường cơ chất khác nhau để xác định hoạt tính và biểu hiện enzyme.
2. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp, lên men chủng nấm mốc được lựa chọn với thể tích lớn để tinh chế enzyme.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Hồ Sĩ Tráng (2006), Cơ sở hóa học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản khoa học và kĩ
thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB đại học quốc gia TP. Hồ
Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh. Tiếng Anh
3. Almeida Elzira Maria, Maria de Lourdes T.M. Polizeli, Héctor Francisco Terenzi andJoão Atilio Jorge (1995), “Purification and biochemical characterization
of β-xylosidase from Humicola grisea var. thermoidea”, FEMS Microbiology Letters, 130, pp. 171–176.
4. Anand L, Krishnamurthy S, Vithayathil PJ (1990), “Purification and properties of
xylanase from the thermophilic fungus, Humicola lanuginosa (Griffon and Maublanc) Bunce”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 276(2), pp.
546-553.
5. Anthi Karnaouri, Evangelos Topakas, Io Antonopoulou, Paul Christakopoulos (2014), “Genomic insights into the fungal lignocellulolytic system of
Myceliophthora thermophila”, Frontiers in Microbiology, 5: 281.
6. Anthony Levasseur, Elodie Drula, Vincent Lombard, Pedro M Coutinho and Bernard Henrissat (2013), “Expansion of the enzymatic repertoire of the
CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes”, Biotechnology for Biofuels, 6(1), pp. 1-2.
7. Armand S, Drouillard S, Schülein M, Henrissat B, Driguez H (1997) “A bifunctionalized fluorogenic tetrasaccharide as a substrate to study
8. Baldrian P, Valaskova V. (2008), “Degradation of cellulose by basidiomycetous
fungi”, FEMS Microbiology Reviews, 32(3), pp. 501–521.
9. Bayer EA, Chanzy H, Lamed R, Shoham Y. (1998), “Cellulose, cellulases and
cellulosome”, Current Opinion in Structural Biology, 8(5), pp. 548–557.
10. Bernard Henrissat (1991), ” A classification of glycosyl hydrolases based on
amino acid sequence similarities”, Biochemical Journal, 280, pp. 309-316.
11. Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1993), “New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities”,
Biochemical Journal, 293, pp. 781-788.
12. Bernard Henrissat and Amos Bairoch (1996), “Updating the sequence-based
classification of glycosyl hydrolases”, Biochemical Journal, 316, pp. 695-
696.
13. Bhat MK, Bhat S (1997), “Cellulose degrading enzymes and their potential
industrial applications”, Biotechnology Advances, 15(3-4), pp. 583-620.
14. Bhat MK, Bhat S (1998), “Clostridium thermocellum cellulosome: dissociation, isolation and characterisation of subunits and the potential biotechnological
implications”, Recent Res Devel Biotech Bioeng, 1(1), pp. 59-84.
15. Bhat MK, Joel Solomon Gaikwad and Ramesh Maheshwari (1993), “Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase from the
thermophilic fungus Sporotrichum thermophile and its influence on cellulase activity”, General Microbiology, 139, pp. 2825–2832.
16. Bhat MK, R. Maheshwari (1987), “Sporotrichum thermophile: growth, cellulose
degradation, and cellulase activity”, Applied and Environmental Microbiology, 53, pp. 2175–2182.
17. Boisset C, Fraschini C, Schülein M, Henrissat B, Chanzy H (2000), “Imaging the enzymatic digestion of bacterial cellulose ribbons reveals the endo character of the cellobiohydrolase Cel6A from Humicola insolens and its
mode of synergy with cellobiohydrolase Cel7A”, Applied and Environmental Microbiology, 66(4), pp. 1444-1452.
18. Brandi L. Cantarel, Pedro M. Coutinho, Corinne Rancurel, Thomas Bernard, Vincent Lombard and Bernard Henrissat (2009), “The Carbohydrate-Active
EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics”, Nucleic Acids Research, 37, pp. 233–238.
19. Cai YJ, Chapman SJ, Buswell JA, Chang ST (1999), “Production and distribution of endoglucanase, cellobiohydrolase, and beta-glucosidase
components of the cellulolytic system of Volvariella volvacea, the edible straw mushroom”, Appl Environ Microbiol, 65(2), pp. 553-559.
20. Cao WG, Crawford DL (1993), “Purification and some properties of β-
glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius strain SMF”, Canadian Journal of Microbiology, 39(1), pp. 125-129.
21. Christine S. Evans (1985), “Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase)
from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor”, Applied Microbiology and Biotechnology, 22(2), pp 128-131.
22. Coutts A D and Smith R E (1976), “Factors influencing the production of
cellulases by Sporotrichum thermophile”, Appl Environ Microbiol, 31(6), pp.
819–825.
23. Dalia Shallom, Yuval Shoham (2003), “Microbial hemicellulase”, Current
Opinion in Microbiology, 6(3), pp. 219–228.
24. Dan S, Marton I, Dekel M, Bravdo BA, He S, Withers SG, Shoseyov O (2000), “Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of
family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase”, J Biol Chem, 275(7), pp.
25. de Vries RP, Kester HCM, Poulsen CH, Benen JAE, Visser J (2000), ‘Synergy
between enzymes from Aspergillus involved in the degradation of plant cell wall polysaccharides”, Carbohydrate Research, 327(4), pp. 401-410.
26. Divne C, Stahlberg J, Teeri TT, Jones TA (1998), “High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of
cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei”, J Mol Biol, 275(2), pp. 309–
325.
27. E.M Düsterhöft, V.A.J.M Linssen, A.G.J Voragen, G Beldman (1997), “Purification, characterization, and properties of two xylanases from
Humicola insolens”, Enzyme and Microbial Technology, 20(6), pp. 437–445. 28. Eriksen J, Goksoyr J. (1997), “Cellulases from Chaetomium thermophile var.
dissitum”, Eur J Biochem, 77 (3), pp. 445-50.
29. Fengel, D., Wegener, G. (1989) Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions,
Walter de Gruyter, Berlin, Germany.
30. Folan M. A., and M. P. Coughlan (1978), “The cellulase complex in the culture
filtrate of the thermophyllic fungus, Talaromyces emersonii”, International Journal of Biochemistry, 9, pp. 717–722.
31. Foreman PK, Brown D, Dankmeyer L, Dean R, Diener S, Dunn-Coleman NS, Goedegebuur F, Houfek TD, England GJ, Kelley AS, Meerman HJ, Mitchell T, Mitchinson C, Olivares HA, Teunissen PJ, Yao J, Ward M (2003), “ Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the filamentous
fungus Trichoderma reesei”, J Biol Chem, 278(34), pp. 31988–31997.