Sàng lọc vi khuẩn vùng lúa ngập mặn có khả năng kiểm soát một số nấm gây bệnh khóa luận tốt nghiệp đại học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HCM  BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SÀNG LỌC VI KHUẨN VÙNG LÚA NGẬP MẶN CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ VI SINH GVHD: ThS Nguyễn Văn Minh SVTT: Đinh Thị Hiền MSSV: 1153010241 Khóa: 2011 – 2015 Tp Hồ Chí Minh, Tháng 05 Năm 2015 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN  Để hoàn thành đề tài này, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt năm vừa qua để em làm tốt đề tài khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Minh, cô Dương Nhật Linh tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm cho em suốt thời gian thực đề tài Con xin cảm ơn gia đình động viên, quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt để hoàn thành việc học Em xin cảm ơn chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, bạn em phòng vi sinh ủng hộ, quan tâm giúp đỡ em suốt thời gian em thực đề tài Một lần nữa, em xin gửi đến thầy cô, bạn em lời chúc sức khỏe, lời biết ơn chân thành Chúc người may mắn, gặt hái nhiều thành công Em xin chân thành cảm ơn Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực ĐINH THỊ HIỀN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Nấm Pyricularia oryzae (A) biểu bệnh đạo ôn lúa gây nên (B, C) 11 Hình 1.2: Nấm Rhizoctonia solani (A) biểu bệnh khô vằn lúa gây nên (B) 14 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 27 Hình 3.1: Phân lập mẫu nước (A) đất vùng trồng lúa (B) 53 Hình 3.2: Phân lập vi khuẩn nội sinh mẫu thân lúa (A) đĩa TSA đối chứng (B) 53 Hình 3.3: Hình thái vi thể (A) đại thể chủng LĐ7 (B) 54 Hình 3.4: Hình thái vi thể (A) đại thể chủng LN5 (B) 54 Hình 3.5: Hình thái vi thể (40X) (A) đại thể (B) chủng nấm BP1 61 Hình 3.6: Hình thái vi thể (40X) (A) đại thể (B) chủng nấm CR1 63 Hình 3.7: Các dấu hiệu bệnh đạo ôn lô bệnh (A, B) lô đối chứng (C) 64 Hình 3.8: Các dấu hiệu bệnh khô vằn lô bệnh (A, B) lô đối chứng (C) 64 Hình 3.9: Hình thái vi thể (40X) (A) đại thể chủng nấm Pyricularia BP3 (B) 65 Hình 3.10: Hình thái vi thể (40X) (A) đại thể chủng nấm Rhizoctonia CR1 (B) 66 Hình 3.11: Khả kháng nấm Pyricularia BP3 chủng LN6 (A) đối chứng (B) 68 Hình 3.12: Khả kháng nấm Rhizoctonia CR1 chủng LN6 (A)và đối chứng (B) 68 Hình 3.13: Khả kiểm soát nấm Pyricularia BP3 chủng LD5 (A) đĩa đối chứng (B) 70 Hình 3.14: Khả kiểm soát nấm Rhizotocnia CR1 chủng LD5 (A) đĩa đối chứng (B) 70 Hình 3.15: Đĩa cấy thạch vuông góc chủng LS6 LD5 73 Hình 3.16: Đĩa ủ hạt giống sau ngày đĩa agar (A) lúa cấy ngày (B) 76 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN i KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Hình 3.18: Nghiệm thức bổ sung chủng vi khuẩn N-2C2 (A) nghiệm thức bổ sung chủng Pyricularia BP3 (B) 76 Hình 3.17: Nghiệm thức bổ sung chủng vi khuẩn N-2C1 (A) nghiệm thức bổ sung chủng Rhizotocnia CR1 (B) 77 Hình 4.1: Định danh Bacillus sp theo khóa phân loại Cowan Steels 98 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN ii KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sản lượng lúa nước Châu Á sản lượng, diện tích lúa giới Bảng 1.1: Khả chịu mặn số loại 17 Bảng 3.1: Đặc điểm đại thể chủng vi khuẩn phân lập 45 Bảng 3.2: Kết quan sát vi thể chủng phân lập 49 Bảng 3.3: Khả chịu muối chủng vi khuẩn thử nghiệm 55 Bảng 3.4: Tóm tắt kết phân lập sàng lọc chủng vi khuẩn 59 Bảng 3.5: Kết phân lập vi nấm gây bệnh đạo ôn lúa 61 Bảng 3.6: Kết phân lập vi nấm gây bệnh khô vằn lúa 62 Bảng 3.6: Khảo sát khả kháng nấm chủng vi khuẩn thử nghiệm 67 Bảng 3.8: Phần trăm ức chế nấm gây bệnh dịch vi khuẩn thử nghiệm nồng độ 0,4% NaCl 69 Bảng 3.9: Các thử nghiệm định danh Bacillus 71 Bảng 3.10: Kết thử nghiệm kháng nấm in vivo 74 Bảng 3.7: Khả ức chế nấm gây bệnh dịch vi khuẩn thử nghiệm nồng độ 0,4% NaCl 93 Bảng 4.1: Kết thử nghiệm khả kiểm soát nấm bệnh mô hình lúa thực nghiệm 99 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN iii GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LPCB: Lactophenol Cotton Blue Slide Mounths NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth PDA: Potato Dextrose Agar TSA: Trypticase Soy Agar CFU : Colony Forming Unit – Đơn vị hình thành khuẩn lạc SVTH: ĐINH THỊ HIỀN iv KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH………………………………………………………………….i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lúa 1.1.1 Sơ lược lúa 1.1.2 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 1.1.3 Tình hình sản xuất lúa gạo nước 1.2 Bệnh nấm lúa 1.2.1 Bệnh đạo ôn 1.2.2 Bệnh khô vằn 11 1.3 Tình hình xâm nhập mặn đồng sông Cửu Long 15 1.4 Khả chịu mặn lúa 16 1.4.1 Ảnh hưởng độ mặn đến trồng 16 1.4.2 Cơ chế chống chịu lúa 18 1.5 Vi sinh vật nội sinh 20 1.5.1 Sơ lược vi sinh vật nội sinh 20 1.5.2 Các nghiên cứu giới 21 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN v KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH 1.5.3 Các nghiên cứu nước 21 1.6 Vi khuẩn tự vùng rễ giúp thúc đẩy thực vật phát triển (PGPR) 22 1.6.1 Sơ lược vi khuẩn tự vùng rễ thúc đẩy thực vật phát triển (PGPR) 21 1.6.2 Các nghiên cứu giới 23 1.6.3 Các nghiên cứu nước 23 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Địa điểm th i gian nghiên cứu 25 2.2 Vật liệu 25 2.3 Thiết bị, dụng cụ môi trư ng 25 2.3.1 Thiết bị 25 2.3.2 Dụng cụ 25 2.3.3 Môi trư ng - Hóa chất 26 2.4 Phương pháp thực 26 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 26 2.4.2 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu 28 2.4.3 Phương pháp phân lập làm vi khuẩn chịu mặn 29 2.4.4 Phân lập làm vi nấm gây bệnh lúa 29 2.4.5 Định danh sơ nấm bệnh 30 2.4.6 Gây bệnh nhân tạo mô hình lúa 31 2.4.7 Định tính khả kháng nấm gây bệnh lúa chủng vi khuẩn thử nghiệm 32 2.4.8 Định lượng khả kháng nấm gây bệnh lúa dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm 33 2.4.9 Phương pháp định danh vi khuẩn 34 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN vi KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH 2.4.10 Khảo sát khả tương thích chủng vi khuẩn thử nghiệm 41 2.4.11 Khảo sát khả kiểm soát sinh học nấm bệnh mô hình trồng lúa 41 2.4.12 Xử lý kết 43 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết phân lập vi khuẩn 45 3.2 Kết khảo sát khả chịu muối chủng vi khuẩn 54 3.3 Tóm tắt kết phân lập sàng lọc 59 3.4 Phân lập vi nấm gây bệnh đạo ôn khô vằn lúa 60 3.4.1 Kết thu thập mẫu bệnh 60 3.4.2 Kết phân lập vi nấm gây bệnh 61 3.5 Gây bệnh mô hình trồng lúa 63 3.6 Định danh vi nấm gây bệnh 65 3.7 Khả kháng nấm bệnh vi khuẩn thử nghiệm 66 3.8 Định lượng khả kháng nấm gây bệnh lúa dịch lọc vi khuẩn thử nghiệm 68 3.9 Định danh vi khuẩn 71 3.10 Khảo sát khả tương thích chủng vi khuẩn thử nghiệm 72 3.11 Khảo sát khả kiểm soát sinh học nấm bệnh mô hình trồng lúa 73 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 4.1 Kết luận 79 4.2 Kiến nghị 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 PHỤ LỤC 90 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN vii KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: ĐINH THỊ HIỀN KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH http://www.haugiang.gov.vn/Portal/HtmlView.aspx?pageid=113&ItemID=23412&mid =7340&pageindex=&siteid=8 75 Sở Nông Nghiệp Hà Tĩnh (2013), Thông tin xuất gạo số nước 7/2013 Link: http://nongthonmoihatinh.vn/vi/news/Nha-nong-can-biet/Thong-tin-xuat-khau-gaomot-so-nuoc-thang-7-2013-19256/ 76 Trung Nghĩa (2014), Xuất gạo 2013: Việt Nam lùi xuống vị trí thứ ba link: http://ndh.vn/xuat-khau-gao-nam-2013-viet-nam-lui-xuong-vi-tri-thu-ba20140113103455816p150c171.news 77 Viện Khoa Học Thủy Lợi Miền Nam (2011), Nước mặn xâm nhập sâu 70 km ĐBSCL Link: http://www.dichvuthuyloi.com.vn/vn/Tin-Tuc/thong-tin-ve-linh-vucnong-nghiep/nuoc-man-xam-nhap-sau-70km-tai-dbscl/ SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 89 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hóa chất môi trƣờng Hóa chất Crystal violet: a) Crystal violet 0,4 g Cồn 96o 10 mL b) Phenol 1g Nước cất 100 mL Lưu ý: trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đem lọc Bảo quản chai màu tránh ánh sáng Lugol: KI 2g Iod tinh thể 1g Nước cất 300 mL Lưu ý: hòa tan 2g KI vào mL nước cất, sau thêm 1g Iod Ch cho Iod tan hết them nước vừa đủ 300 mL Safranin O Safranin O (dung dịch 2% cồn 96o) 25 mL Nước cất 75 mL Lƣu ý: Bảo quản chai màu Môi trƣờng Môi trường NB (Nutrient Broth) Cao thịt 5g Pepton 10g NaCl 5g Nước cất 1000 mL pH = 7,4 – 7.6 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 90 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Môi trường NA (Nutrient Agar) Cao thịt 5g Pepton 10g NaCl 5g Agar 20g Nước cất 1000mL pH = 7,4 – 7,6 Môi trường PDA ( Potato Dextrose Agar) Potato 200g Mantose hay Glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000 mL pH = 5,5 – 6,0 Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) Trypticase 15g Thytone 5g NaCl 5g Agar 20g Nước cất 1000 mL pH = 7,3 Môi trường YEM (Yeast Extract Mannitol) Mannitol CaCO3 K2HPO4 10g 4g 0,5g Cao nấm men 1g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,1g Agar 15g SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 91 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP pH = 6,8-7,0 Môi trường Clark –Lubs Pepton 3g K2HPO4 5g Glucose 5g Nước cất 1000mL pH = 6,8-7,0 Môi trường k khí (Wilson Blair Agar Base) Pepton 10g Cao thịt 5g Dextrose 10g NaCl 5g Agar 30g Môi trường tinh bột NA 23g Tinh bột tan 10g Nước cất 1000mL Phụ lục 2: Kết xử lý ANOVA yếu tố thí nghiệm xác định phần trăm ức chế dịch vi khuẩn thử nghiệmbằng phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 92 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Bảng 3.7: Khả ức chế nấm gây bệnh dịch vi khuẩn thử nghiệm nồng độ 0,4% NaCl STT Kết đƣờng kính nấm (mm) MÃ CHỦNG Rhizotocnia Pyricularia LĐ2 L1 - L2 - L3 - L1 30,0 L2 30,0 L3 28,0 LĐ5 4,0 6,0 6,0 20,0 19,0 19,0 TĐ13 - - - 12,0 12,0 14,0 LS4 60,0 61,0 61,0 46,0 45,0 45,0 LS6 5,0 6,0 5,0 - - - TS3 11,0 11,0 10,0 14,0 14,0 13,0 TS5 18,0 18,0 18,0 20,0 20,0 19,0 LN1 22,0 21,0 21,0 18,0 17,0 17,0 LN3 75,0 75,0 76,0 - - - 10 LN6 13,0 13,0 13,0 17,0 17,0 17,0 11 LN8 15,0 15,0 16,0 - - - 12 LN10 - - - 58,0 58,0 58,0 13 TN3 - - - 53,0 53,0 53,0 14 TN4 - - - 62,0 62,0 63,0 15 DC 87,0 90,0 90,0 68,0 70,0 70,0 Rhizotocnia: SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 93 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: ĐINH THỊ HIỀN GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH 94 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Pyricularia SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 95 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Phụ lục 3: Một số thử nghiệm sinh hóa định danh theo khóa phân loại Cowan Steel Thử nghiệmVPP SVTH: ĐINH THỊ HIỀN Thử nghiệm khả sử dụng citratP Thử nghiệmkhả phát triển 10% NaCl 96 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Thử nghiệm khả lên men loại đƣờng Thử nghiệm Casein SVTH: ĐINH THỊ HIỀN Thử nghiệm Catalase 97 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Hình 4.1: Định danh Bacillus sp theo khóa phân loại Cowan Steels SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 98 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Phụ lục 4: Kết thử nghiệm khả kiểm soát nấm bệnh mô hình lúa thực nghiệm Bảng 4.1: Kết thử nghiệm khả kiểm soát nấm bệnh mô hình lúa thực nghiệm STT Nghiệm Lô thí Mức độ Mức độ Mức độ Mức độ Tổng số Chỉ số thức 1/ 2/ 3/ 4/ (0 – (20 - (50 – (80 – 20%) 50%) 80%) 100%) nghiệm cây/ lô bệnh (%) Mức độ nhiễm Rhizotocnia N-LD5 N-LS6 N-2C1 N-DC1 20 0 20 50,00 20 0 20 50,00 20 0 20 50,00 16 20 55,00 15 20 56,25 14 20 52,50 15 20 48,75 2 17 20 48,75 17 20 48,75 0 16 20 80,00 0 14 20 82,50 0 13 20 83,75 Mức độ nhiễm Pyricularia N-TS3 N-TD13 17 20 53,75 20 0 20 50,00 19 20 51,25 16 20 50,00 20 0 20 50,00 SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 99 GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP STT 19 20 51,25 Nghiệm Lô thí Mức độ Mức độ Mức độ Mức độ Tổng số Chỉ số thức 1/ 2/ 3/ 4/ (0 – (20 - (50 – (80 – 20%) 50%) 80%) 100%) nghiệm cây/ lô bệnh (%) Mức độ nhiễm Pyricularia N-2C2 N-DC2 15 20 46,25 17 0 20 46,25 3 17 0 20 46,25 1 13 20 80,00 10 20 77,50 0 17 20 78,75 Mức độ nhiễm Pyricularia Rhizotocnia N– 4C N–DC3 20 0 20 50,00 19 0 20 48,75 19 0 20 48,75 0 16 20 80,00 0 16 20 80,00 14 20 77,50 Phụ lục 5: Kết thử nghiệm khả kiểm soát nấm bệnh mô hình lúa thực nghiệmbằng phần mềm STATGRAPHICS Plus 3.0 Rhizotocnia: SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 100 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Pyricularia SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 101 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH Rhizotocnia Pyricularia SVTH: ĐINH THỊ HIỀN 102 KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: ĐINH THỊ HIỀN GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH 103 ... tài “SÀNG LỌCVI KHUẨN VÙNG LÚA NGẬP MẶN CÓ KHẢ NĂNG KIỂM SOÁT MỘT SỐ VI NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY LÚA” nhằm sàng lọc chủng vi khuẩn vùng rễ nội sinh hoạt tính cao có tiềm sản xuất chế phẩm sinh học. .. giúp tăng khả chống chịu bệnh cho lúa vùng đất nhiễm mặn  Nội dung thực hiện:  Phân lập vi khuẩn vùng rễ nội sinh vùng lúa ngập mặn  Phân lập vi nấm gây bệnh đạo ôn khô vằn lúa  Gây bệnh nhân... mô hình trồng lúa  Sàng lọc chủng có khả kháng nấm  Sàng lọc chủng có hoạt tính cao  Định danh vi khuẩn  Thử nghiệm khả kiểm soát bệnh chủng vi khuẩn thử nghiệm mô hình trồng lúa SVTH: ĐINH