Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua có tiềm năng làm chủng khởi động

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - NGUYỄN NGỌC HOÀNG OANH PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ NEM CHUA CÓ TIỀM NĂNG LÀM CHỦNG KHỞI ĐỘNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60540101 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2020 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS TRẦN THỊ NGỌC YÊN Cán chấm nhận xét 1: TS Lê Minh Hùng Cán chấm nhận xét 2: PGS.TS Lê Nguyễn Đoan Duy Luận văn thạc sĩ bảo vệ trường Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc Gia TP.HCM ngày 10 tháng 01 năm 2020 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ tịch Hội đồng: GS.TS Đống Thị Anh Đào Phản biện 1: TS Lê Minh Hùng Phản biện 2: PGS.TS Lê Nguyễn Đoan Duy Ủy viên: PGS.TS Lê Trung Thiên Ủy viên, Thư ký: PGS.TS Nguyễn Thị Lan Phi Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Học viên thực hiện: Nguyễn Ngọc Hoàng Oanh MSHV: 1770583 Ngày, tháng, năm sinh: 09/01/1993 Nơi sinh: Đăk Lăk Chuyên nghành: Công Nghệ Thực Phẩm Mã số: 60540101 I Tên đề tài: Phân lập vi khuẩn lactic từ Nem chua có tiềm làm chủng khởi động II Nhiệm vụ nội dung - Tổng quan Nem chua hệ vi sinh vật nem chua Khảo sát phát triển vi khuẩn lactic nem chua lên men truyền thống Phân lập vi khuẩn lactic từ mẫu nem chua lên men truyền thống Xác định hoạt tính vi khuẩn lactic bao gồm: hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng mốc, hoạt tính tạo acid lactic giảm pH Định danh vi sinh lactic có tiềm làm chủng khởi động Ứng dụng chủng vi khuẩn lactic có tiềm làm chủng khởi động để sản xuất nem chua, so sánh với nem chua không bổ sung chủng khởi động III Ngày giao nhiệm vụ: 19/08/2019 IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/12/2019 V Cán hƣớng dẫn: TS Trần Thị Ngọc Yên Tp Hồ Chí Minh, ngày CÁN BỘ HƢỚNG DẤN tháng năm 2020 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy cô giáo trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM, đặc biệt thầy cô khoa Kỹ thuật hóa học, mơn Cơng nghệ thực phẩm tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu, cung cấp kiến thức kinh nghiệm để có vốn tri thức vững vàng trước rời khỏi trường Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn bảo tận tình TS Trần Thị Ngọc Yên – người trực tiếp hướng dẫn suốt q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Phịng kiểm nghiệm thực phẩm - Cơng ty TNHH TUV-SUD Việt Nam hỗ trợ sở vật chất trang thiết bị, tạo điều kiện để tơi thực nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp đồng hành, động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt để tham gia học tập hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc nhất! TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Học viên cao học Nguyễn Ngọc Hoàng Oanh i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung luận văn thực hướng dẫn trực tiếp TS Trần Thị Ngọc Yên Các kết nghiên cứu kết luận luận văn trung thực không chép từ nguồn nào, hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo theo yêu cầu Mọi chép không hợp lệ, vi phạm qui chế đào tạo, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Học viên cao học Nguyễn Ngọc Hồng Oanh ii TĨM TẮT LUẬN VĂN Nghiên cứu nhằm mục tiêu phân lập vi khuẩn lactic (LAB) từ nem chua có đặc điểm thích hợp để làm chủng khởi động, cải thiện q trình lên men vệ sinh an tồn thực phẩm cho nem chua Khảo sát số lượng mật độ LAB trình lên men nem chua truyền thống từ ngày đến ngày 4, kết cho thấy LAB có khả thích ứng nhanh chiếm ưu trình lên men Nghiên cứu phân lập 18 dạng khuẩn lạc khác có đặc điểm LAB sau: kích thước 1-4mm, màu trắng kem, lồi, trịn có vịng phân giải với CaCO3, nhiên có 11 khuẩn lạc xác định LAB qua phản ứng catalase, oxidase, nhuộm gram quan sát hình thái tế bào kính hiển vi, 11 chủng xác định lên men đồng hình qua thử nghiệm tạo khí CO2 11 chủng thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC với 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538, kháng mốc Aspergillus niger ATCC 16888, khả tạo acid lactic độ giảm pH, kết cho thấy LAB A P có hoạt tính tốt tất thử nghiệm Sử dụng phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA, chủng LAB A P xác định Lactobacillus plantarum chủng A P sử dụng làm chủng khởi động cho nem chua với tỉ lệ 1:1, nồng độ bổ sung 107CFU/g, so sánh với mẫu nem chua không sử dụng chủng khởi động, ủ lên men ngày Kết cho thấy, LAB mẫu nem chua có cấy chủng khởi động cao chiếm ưu tổng số vi sinh vật hiếu khí, nồng độ vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm Escherichia coli, Staphylococcus aureus tổng số nấm mốc nem chua cấy chủng khởi động thấp so với nem chua không cấy chủng khởi động Nem chua cấy chủng khởi động có giảm pH nhanh hơn, sử dụng lượng đường nhiều tạo acid lactic nhiều so với nem chua không cấy chủng khởi động iii ABSTRACT The aim of this study was to isolate lactic acid bacteria (LAB) from nem chua, a Vietnamese traditional uncooked fermented sausauge, isolated LAB must has properties suitable for use as starter cultures, improve fermentation and food safety hygiene for nem chua Investigating the number and density of LAB during the traditional fermented nem chua from day to day 4, the results showed that LAB has the ability to adapt quickly and dominate during fermentation A total of 18 different colonies of LAB were found colony morphology characteristics as follows: size 1-4mm, white or cream color, slightly convex, round and disintegration of CaCO3, but there are only 11 colonies were identified as LAB by catalase reaction, oxidase reaction, gram staining and observation of cell morphology on a microscope, 11 strains were identified as homofermentative through CO2 production test 11 strains were studied for antibacterial activity with Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538, antifungal Aspergillus niger ATCC 16888, lactic acid production and pH reduction ability, the results showed LAB A and P had the best activity at all Using 16S rRNA gene sequence analysis for identification, LAB A and P strains were identified as Lactobacillus plantarum Two strains A and P were used as starter cultures for nem chua at a ratio of 1: 1, an additional concentration of 107CFU/g, compared with non-starter culture nem chua, incubated for days The results showed that the LAB of the starter cultures nem chua was always higher and dominated in total aerobic bacteria, the concentration of foodpoisoning bacteria such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus and total molds in starter cultures nem chua was less than those of non-starter culture nem chua Starter cultures nem chua had a faster reducing of pH, used more sugar and produced more lactic acid than the non- starter culture men chua iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii TÓM TẮT LUẬN VĂN iii ABSTRACT iv DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ẢNH .ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x Chƣơng Mở đầu Chƣơng Tổng quan 2.1 Nem chua 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Thành phần nguyên liệu 2.2 Vi sinh vật điển hình nem chua .9 2.2.1 Escherichia coli 2.2.2 Staphylococcus aureus 10 2.2.3 Salmonella 11 2.2.4 Nấm mốc 11 2.2.5 Vi khuẩn lactic (LAB) 12 2.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 20 2.3.1 Nghiên cứu LAB sản phẩm nem chua .20 2.3.2 Nghiên cứu LAB sản phẩm lên men khác 23 Chƣơng Nguyên liệu phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.1 Nguyên liệu 25 v 3.1.1 Nguyên liệu để phân lập vi khuẩn lactic 25 3.1.2 Nguyên liệu sản xuất nem chua 25 3.1.3 Chủng vi sinh vật thị .26 3.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 26 3.2.1 Hóa chất 26 3.2.2 Thiết bị 29 3.2.3 Dụng cụ 29 3.3 Phương pháp nghiên cứu .30 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 30 3.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 32 3.3.3 Bố trí thí nghiệm 33 3.4 Phương pháp hoạt hóa giữ giống LAB .38 3.5 Chuẩn bị chủng chị thị xác định nồng độ chủng thị 39 3.6 Chuẩn bị giống cấy làm chủng khởi động .40 3.7 Quy trình sản xuất nem chua 41 3.8 Phương pháp xử lý số liệu .44 Chƣơng Kết bàn luận 45 4.1 Khảo sát phát triển LAB nem chua lên men truyền thống .45 4.2 Phân lập LAB từ nem chua 46 4.3 Tuyển chọn chủng LAB có khả kháng khuẩn 53 4.4 Tuyển chọn chủng LAB có khả kháng mốc 63 4.5 Xác định khả sinh acid lactic làm giảm pH LAB tuyển chọn .64 vi 4.6 Định danh LAB .66 4.7 So sánh nem chua cấy chủng khởi động nem chua không cấy chủng khởi động .66 4.7.2 Sự phát triển LAB TVSVHK nem chua không cấy chủng khởi động nem chua cấy chủng khởi động 68 4.7.3 Ảnh hưởng chủng khởi động đến phát triển vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm .70 4.7.4 Sự thay đổi pH, hàm lượng acid lactic đường tổng trình lên men .72 Chƣơng Kết luận kiến nghị 76 5.1 Kết luận 76 5.2 Kiến nghị .77 Tài liệu tham khảo 78 PHỤ LỤC 85 vii Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1) trường hợp sản phẩm dạng khác vào tâm hai đĩa thạch Lặp lại quy trình với dịch pha loãng thập phân cần Dàn chất cấy nhanh tốt lên khắp bề mặt đĩa thạch, không để dàn mẫu chạm vào thành đĩa Nếu có thể, sử dụng dàn mẫu cho tất độ pha loãng từ mẫu có độ pha lỗng cao Để đĩa đậy nắp khoảng 15 nhiệt độ môi trường Lật úp đĩa chuẩn bị đặt vào tủ ấm 25 °C 5-7 ngày Đếm khuẩn lạc tính kết Đếm đĩa có 150 khuẩn lạc Tính kết N C ; V  1.1  d N: số vi sinh vật có 1milimit gam (CFU/ml CFU/g) ∑C: tổng số khuẩn lạc tính hai đĩa từ hai lần pha lỗng liên tiếp số chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc V: thể tích cấy đĩa, tính ml d: nồng độ pha lỗng Làm trịn kết tính tốn thành số Nếu số thứ ba nhỏ 5, không sửa đổi số trước, chữ số thứ ba lớn 5, tăng số trước lên đơn vị B.7 Phát Salmonella spp Môi trƣờng nuôi cấy, thuốc thử kháng huyết 105 - Môi trường lỏng tăng sinh sơ không chọn lọc: Buffer peptone water (BPW) - Môi trường lỏng chọn lọc thứ 1: mơi trường Rappaport-Vassiliadis có đậu tương (canh thang RSV) - Môi trường lỏng chọn lọc thứ 2: canh thang Muller-Kauffmann Tetrathionatenovobiocin (canh thang MKTTn) - Môi trường đặc chọn lọc: Xylose Lysine Deoxycholate (thạch XLD) - Môi trường thạch chọn lọc thứ 2:Hektoen Enteric Agar (HE) - Môi trường thạch dinh dưỡng không chọn lọc: Nutrient Agar (NA) - Thạch TSI, môi trường Lysin decarboxylase (LDC), thạch Urea, đĩa giấy βgalactosidase (ONPG), môi trường tryptone - Nước muối sinh lý: NaCl 0.85% - Kháng huyết thanh: H đa giá, O đa giá, Vi đơn giá Thiết bị dụng cụ thủy tinh - Autoclave - Tủ ấm, vận hành (37±1) °C (có thể dao động từ 34°C đến 38°C) - Nồi cách thủy, vận hành (41.5±1)°C (có thể dao động từ 47 °C đến 50 °C) - Que cấy vòng - Ống nghiệm, bình chai - Đĩa petri - Pipet tự động 1ml 10ml - Máy đo pH Quy trình Phần mẫu thử huyền phù ban đầu Sử dụng BPW làm dịch pha loãng, làm ấm BPW đến nhiệt độ phòng trước sử dụng 106 Trộn 25g phần mẫu thử với 225ml BPW để thu độ pha loãng 10 lần Ủ nhiệt độ từ 34oC đến 38oC (18±2)h Tăng sinh chọn lọc - Chuyển 0.1ml dịch cấy tăng sinh vào ống chứa 10ml canh thang RVS ủ (41.5±1) oC (24±3)h - Chuyển 1ml dịch cấy tăng sinh vào ống chứa 10ml canh thang MKTTn ủ (37±1) oC for (24±3)h Nuôi cấy môi trƣờng thạch chọn lọc nhận biết - Cấy dịch cấy thu từ canh thang RVS lên XLD HE que cấy vịng 10 µl cho thu khuẩn lạc riêng rẽ - Cấy dịch cấy thu từ canh thang MKTTn lên XLD HE que cấy vịng 10 µl cho thu khuẩn lạc riêng rẽ - Ủ đĩa XLD HE 37 oC (24±3) h Các khuẩn lạc Salmonella điển hình có đặc tính hình thái sau: + XLD: tâm màu đen, vùng ngồi có màu đỏ nhạt suốt khuẩn lạc màu hồng với tâm màu hồng đậm (S Paratyphi A) khuẩn lạc màu vàng, có khơng có tâm đen (Salmonella dương tính Lactose) + HE: khuẩn lạc xanh lam đến xanh dương, có khơng có tâm đen Nhiều dịch cấy Salmonella hình thành khuẩn lạc có tâm lớn, đen bóng xuất khuẩn lạc đen hoàn toàn Khẳng định sinh hóa Sau ủ, đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ đĩa Chọn khuẩn lạc điển hình nghi ngờ để khẳng định chọn thêm khuẩn lạc khuẩn lạc âm tính 107 Cấy ria khuẩn lạc chọn lên đĩa NA cho thu khuẩn lạc riêng rẽ Ủ 34 oC đến 38oC (24±3) h Sử dụng khuẩn lạc đĩa NA để thực phép thử sinh hóa TSI, LDC, ure agar, tryptone, ONPG - Thạch TSI: Cấy ria bề mặt nghiêng thạch cấy đâm sâu xuống đáy Ủ (37±1) oC (24±3) h Chủng Salmonella điển hình sinh màu đỏ mặt nghiêng (tính kiềm) màu vàng đáy (tính acid) có sinh khí (bọt khí) sinh H2S (thạch bị đen cấy đâm sâu) - Thạch Ure: Cấy ria bề mặt nghiêng thạch Ủ (37±1) oC (24±3) đánh giá sau 2-4 Ure phân giải thành amoniac, làm phenol đỏ chuyển thành màu hồng sau chuyển thành màu đỏ anh đào sẫm  Phản ứng dương tính - LDC: Cấy bên bề mặt môi trường lỏng ủ (37±1) oC (24±3) h Mơi trường đục có màu đỏ tía sau ủ cho thấy phản ứng dương tính Màu vàng cho thấy phản ứng âm tính - Phát β-galactosidase: Dùng đĩa giấy thương mại Đặt đĩa vào ống nghiệm tiệt trùng Thêm 0.1ml nước muối 0.85% tiệt trùng (nước muối sinh lý) Lấy sinh khối khuẩn lạc cần test que cấy vòng hòa vào ống nghiệm chứa đĩa nước muối sinh lý Ủ 35oC Đánh giá sau đến tối đa để phát lên men lactose Phản ứng âm tính sau ủ thêm đến 24 phát lên men lactose - Phản ứng Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml tryptone Ủ (37±1) oC (24±3) h Sau thời gian ủ, thêm 1ml thuốc thử Kowac’s vòng màu đỏ (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng dương tính (1 vịng màu nâu vàng (lớp bề mặt) chứng tỏ phản ứng âm tính Phép thử huyết - Kiểm tra tự ngưng kết: 108 Cho giọt nước muối lên lam kính thủy tinh Trộn dung dịch nước muối với khuẩn lạc cần thử nghiệm để thi huyền phù đục đồng Lắc nhẹ lam kính từ đến 60 giây Quan sát dịch huyền phù đen Nếu vi khuẩn kết dính thành hạt chủng xem tự ngưng kết Các phản ứng sau không thực - Kiểm tra kháng nguyên O, H, Vi Cho giọt huyết kháng nguyên O đa giá, huyết kháng nguyên H đa giá, huyết kháng ngun Vi lên lam kính thủy tinh sạch.Hịa lẫn sinh khối vi khuẩn vào giọt kháng huyết Nếu xuất ngưng kết phản ứng coi dương tính Thử nghiệm sinh hóa Tự ngƣng kết Phản ứng kháng huyết Giải thích kết Kháng ngun O- HĐiển hình dương tính Khơng (và Vi dương tính thử Các chủng coi Salmonella nghiệm) Điển hình Điển hình Phản ứng khơng điển hình Khơng Khơng Kháng ngun O- H- âm tính Có thể Khơng thử nghiệm tự Salmonella ngưng kết - - 109 Không coi Salmonella B.8 Định lƣợng LAB Môi trường nuôi cấy : De Mann Rogosa and Sharpe agar (MRS) bổ sung 1% CaCO3 Proteose peptone 10.0g HM Peptone B # 10.0g Yeast extract 5.0g Dextrose (Glucose) 20.0g Tween 80 (Polysorbate 80) 1.0g Ammonium citrate 2.0g Sodium acetate 5.0g Magnesium sulphate 0.1g Manganese sulphate 0.05g Dipotassium hydrogen phosphate 2.0g Agar 12.0g Nước vừa đủ 1000ml Hòa tan mơi trường hồn chỉnh khơ vào nước, đun nóng cần Trộn kỹ để yên vài phút Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 °C, sử dụng máy đo pH Phân phối mơi trường vào bình chai có dung tích thích hợp Khử trùng nồi hấp áp lực 121 °C 15 Chuẩn bị đĩa thạch Làm nguội môi trường nồi cách thủy trì nhiệt độ từ 47 °C đến 50 °C trước sử dụng Rót từ 15 ml đến 20 ml môi trường vào dãy đĩa Petri vô trùng đông đặc 110 Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch: Các đĩa thạch làm khơ với bề mặt thạch hướng lên để tủ cấy (ở nhiệt độ phòng) từ 30 đến 60 phút đậy nắp để qua đêm nhiệt độ phòng Thiết bị, dụng cụ Nồi hấp áp lực Tủ ấm, trì nhiệt độ (30 ± 1) °C Đĩa Petri, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm Pipet, có dung tích danh định 0.1ml 1ml Nồi cách thủy, trì nhiệt độ từ 44 °C đến 47 °C Máy đếm khuẩn lạc Máy đo pH Ống nghiệm, bình chai Quy trình Cân 10g nguyên liệu, bổ sung 90ml dung dịch đệm pepton 0.1% để tạo dung dịch huyền phù ban đầu Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử sản phẩm dạng lỏng huyền phù ban đầu (độ pha loãng 10-1) trường hợp sản phẩm dạng khác vào tâm hai đĩa thạch Lặp lại quy trình với dịch pha loãng thập phân cần Dàn chất cấy nhanh tốt lên khắp bề mặt đĩa thạch, không để dàn mẫu chạm vào thành đĩa Nếu có thể, sử dụng dàn mẫu cho tất độ pha loãng từ mẫu có độ pha lỗng cao Để đĩa đậy nắp khoảng 15 phút nhiệt độ môi trường Lật úp đĩa chuẩn bị đặt vào tủ ấm 30 °C (48±2)h Đếm khuẩn lạc tính kết 111 Đếm đĩa có 150 khuẩn lạc: 1-4mm, màu trắng kem, lồi, trịn có vịng phân giải với CaCO3 Tính kết N C ; V  1.1  d N: số vi sinh vật có 1milimit gam (CFU/ml CFU/g) ∑C: tổng số khuẩn lạc tính hai đĩa từ hai lần pha lỗng liên tiếp số chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc V: thể tích cấy đĩa, tính ml d: nồng độ pha lỗng Làm trịn kết tính tốn thành số Nếu số thứ ba nhỏ 5, không sửa đổi số trước, chữ số thứ ba lớn 5, tăng số trước lên đơn vị 112 PHỤ LỤC C: Kết gửi mẫu thử nghiệm 113 114 115 116 117 118 119 ... Định danh vi sinh lactic có tiềm làm chủng khởi động Ứng dụng chủng vi khuẩn lactic có tiềm làm chủng khởi động để sản xuất nem chua, so sánh với nem chua không bổ sung chủng khởi động III Ngày... Tên đề tài: Phân lập vi khuẩn lactic từ Nem chua có tiềm làm chủng khởi động II Nhiệm vụ nội dung - Tổng quan Nem chua hệ vi sinh vật nem chua Khảo sát phát triển vi khuẩn lactic nem chua lên men... lên men nem chua khơng cấy chủng khởi động nem chua cấy chủng khởi động 69 Hình 4.8 Sự thay đổi pH trình lên men nem chua cấy chủng khởi động nem chua không cấy chủng khởi động