Phân Lập Vi Khuẩn Lactic Trong Khoang Miệng Có Khả Năng Ức Chế Sự Tạo Màng Sinh Học Của Một Số Lactobacillus Spp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TRONG KHOANG MIỆNG CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SỰ TẠO MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ Lactobacillus spp Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương TS Nguyễn Hoàng Dũng Sinh viên thực : Nguyễn Tuấn Anh MSSV: 1311100148 - Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Người thực đề tài: Nguyễn Tuấn Anh Sinh viên trường: Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa: Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Lớp: 13DSH02 MSSV: 1311100148 Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân hướng dẫn TS Nguyễn Hoài Hương TS Nguyễn Hoàng Dũng, thực Viện Sinh học Nhiệt đới phòng thí nghiệm lầu trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Những số liệu kết phân tính đề tài hồn tồn trung thực, khơng chép từ nguồn tài liệu tham khảo khác hình thức Một số nội dung đồ án tốt nghiệp có tham khảo sử dụng liệu trích dẫn cơng bố cơng khai báo khoa học, website, tác phẩm theo danh mục tài liệu tham khảo đồ án Nếu có chép khơng trung thực báo này, người thực đề tài xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trươc ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Tuấn Anh i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong suốt trình học tập, rèn luyện trau dồi kiến thức em gặp phải khơng lần khó khăn nhờ có quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn tận tình TS Nguyễn Hoài Hương, kiến thức kỹ cần thiết Cơ truyền dạy mà em hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp lần Từ tận đáy tim, em xin chân thành cám ơn Hồi Hương Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Tiến sĩ Nguyễn Hồng Dũng mở lòng nhận hướng dẫn em thực đề tài tốt nghiệp Viện Sinh học Nhiệt đới (VSHND) Đây hội quý báu mà thầy dành cho em, em xin cám ơn thầy Dũng nhiều Ngồi ra, VSHND em nhận khơng giúp đỡ từ Thạc sĩ Lê Quỳnh Loan Suốt thời gian làm việc nghiên cứu VSHND, chị người bên cạnh nhắc nhở em nhiều điều cần thiết thực thí nghiệm nghiên cứu Em xin cám ơn chị Loan Ngoài ra, xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, người bên tạo điều kiện tốt cho trình thực đồ án tốt nghiệp Lời cuối cùng, em xin gửi lời chúc tới toàn thể quý thầy quý cô giảng dạy, nghiên cứu Viện Sinh học Nhiệt Đới Đại học thành phố Hồ Chí Minh, thật dồi sức khỏe, để tiếp tục thực sứ mệnh cao đẹp truyền đạt kiến thức cho hệ mai sau TP.HCM, ngày … tháng … năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Tuấn Anh ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU 10 CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN .14 1.1 SÂU RĂNG .14 1.1.1 Bệnh học 14 1.1.2 Men 20 1.2 VI KHUẨN RĂNG MIỆNG .27 1.2.1 Streptococcus spp 27 1.2.2 Lactobacillus spp 29 1.2.3 Vi khuẩn lactic .35 1.3 MÀNG SINH HỌC 36 1.3.1 Sự hình thành 36 1.3.2 Thành phần .38 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng lên hình thành màng sinh học 40 1.3.4 Tính chất màng sinh học 42 1.3.5 Phân bố 43 1.3.6 Giả thuyết chế bảo vệ miệng probiotic LAB nói chung 45 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 47 1.4.1 Ngoài nước .47 1.4.2 Trong nước .50 CHƯƠNG 2:PHƯƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 51 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu .51 2.2 Vật liệu nghiên cứu 51 iii Đồ án tốt nghiệp 2.2.1 Dụng cụ thiết bị 51 2.2.2 Giống vi khuẩn .51 2.2.3 Hóa chất 51 2.2.4 Các phần mềm sử dụng 54 2.3 Phương pháp nghiên cứu 55 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 55 2.3.2 Thu mẫu 56 2.3.3 Tăng sinh 58 2.3.4 Chọn lọc vi khuẩn lactic .59 2.3.5 Bảo quản 59 2.3.6 Chọn lọc chủng có khả tạo màng sinh học mạnh 59 2.3.7 Định danh chủng BG .60 2.3.8 Khảo sát khả ức chế màng sinh học NBG 64 CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 3.1 Tình trạng miệng đối tượng thu mẫu 65 3.2 Phân lập vi khuẩn Lactic 65 3.3 Chọn lọc chủng có khả tạo màng sinh học mạnh .67 3.4 Định danh 71 3.4.1 Ly trích, thu nhận DNA 71 3.4.2 Nhân sợi DNA phương pháp PCR 71 3.4.3 Xác định trình tự DNA – So sánh với ngân hàng liệu gen NCBI 72 3.5 Khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học vi khuẩn NBG L fermentum 76 CHƯƠNG 4:KẾT LUẬN 82 4.1 Kết luận .82 4.2 Kiến nghị 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC BẢNG .1 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS Extracellular polymeric substance DT Decayed teeth FT Filled teeth MT Missing teeth DFMT Decayed teeth, filled teeth, and missing teeths HA Hydroxyapatite LBS Lactobacillus Selection medium LAB Lactic acid batería MRS deMan, Rogosa and Sharpe LBM Lactobacillus biofilm medium OD600 Opical density at 600 nm BG Biofilm group NBG Non-biofilm group v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Lactobacillus spp phân lập từ người lớn mắc bệnh sâu 33 Bảng 1.2 Lactobacillus spp phân lập từ trẻ em 4-7 tuổi mắc bệnh sâu 34 Bảng 1.3 Tổng hợp nghiên cứu khảo sát số chủng probiotic việc bảo vệ miệng 48 Bảng 2.1 Thành phần môi trường LBS (g/l) 52 Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS (g/l) 52 Bảng 2.3 Thành phần môi trường tạo màng sinh học Lactobacillus spp – Lactobacillus biofilm medium (LBM) 52 Bảng 2.4 Thành phần môi trường thử khả lên men nguồn carbohydrates khác (g/l) 53 Bảng 2.5 Mô tả nghiệm thức (NT) thí nghiệm khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học 64 Bảng 3.1 Thông kê khảo sát tình trạng miệng đối tượng thu mẫu 65 Bảng 3.2 Danh sách chủng vi khuẩn lactic phân lập hình thái tế bào chúng 66 Bảng 3.3 Kết định lượng khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn lactic .69 Bảng 3.5 So sánh kết thử khả lên men nguồn carbonhydrates khác chủng 1B, 12R2 30B2 với số lồi Lactobacillus có kết hiển thị so sánh DNA ngân hàng gen NCBI 75 Bảng 3.4 So sánh độ tương đồng DNA chủng L fermentum 1B, 12R2 30B2 (%) 76 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Đốm trắng – dấu hiệu khử khống men .15 Hình 1.2 Răng bị tổn thương nghiêm trọng q trình khử khống 16 Hình 1.3 Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu 17 Hình 1.4 Cấu trúc người 20 Hình 1.5 Các cấp kết cấu men 21 Hình 1.6 Mơ cột tinh thể HA 22 Hình 1.7 Sơ đồ cấu trúc lục giác HA nhìn dọc theo hướng trục C 22 Hình 1.8 Hình chụp cột tinh thể kính hiển vi điện tử [37] 23 Hình 1.9 Hình vẽ mơ tả hướng phát triển rod 24 Hình 1.10 Mặt cắt dọc men .24 Hình 1.11 Mơ tả hình thành lỗ khóa Rod Interrod 25 Hình 1.12 Các giai đoạn cột tinh thể HA bị bào mòn acid A: cột tinh thể bình thường; B: giai đoạn đầu ăn mòn: C: bị ăn mòn hồn tồn 26 Hình 1.13 Cơ chế bảo vệ ion F- 26 Hình 1.14 Một số kiểu hình thái Lactobacillus spp 30 Hình 1.15 Tỷ lệ Lactobacillus spp phân lập miệng trẻ bị sâu người mẹ 34 Hình 1.16 Sự thay đổi cấu trúc màng sinh học bước qua giai đoạn phát tán 37 Hình 1.17 Các giai đoạn hình thành màng sinh học 38 Hình 1.18 Mơ tả mạng lưới EPS ngoại bào lực tương tác polysaccharides 39 Hình 1.19 Mạng lưới EPS tế bào vi khuẩn màng sinh học, hình thành đáy chai thủy tinh chụp kính hiển vi điện tử 40 Hình 1.20 Vi sinh vật, bùn đất bám đáy tàu thơng qua hình thành màng sinh học .44 vii Đồ án tốt nghiệp Hình 1.21 Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm hồ nước nóng Mickey, Oregon 44 Hình 1.22 Cơ chế tác động Lactobacillus spp lên vi khuẩn khoang miệng 47 Hình 2.1 Mơ tả phương pháp thu mẫu nước bọt .57 Hình 2.2 Một số vị trí lấy mẫu mảng bám 58 Hình 2.3 Dùng lực chảy dịch mơi trường để tác động lên màng sinh học 60 Hình 2.4 Mô tả giai đoạn loại bỏ protein tủa DNA 62 Hình 2.5 Chu trình phản ứng PCR 16S rRNA 63 Hình 3.1 Hình thái tế bào số chủng nhóm vi khuẩn lactic phân lập vật kính 100x 67 Hình 3.2 Mật độ màng sinh học hình thành đáy giếng của chủng 1Ba, 12R2a, 30B2b nhiều so với chủng 21B2i 68 Hình 3.3 Các ống giống khảo sát khả hình thành màng sinh học sau 24 ủ: 70 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm tách chiết DNA chủng vi khuẩn Nhìn vệt màu kéo dài cho thấy hệ DNA vi khuẩn bị gãy thành nhiều đoạn có kích thước khác 71 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR chủng vi khuẩn cho vệt DNA đơn rõ hẳn kết điện di sản phẩm tách DNA 72 Hình 3.6 Cây phát sinh lồi dựa phân tích trình tự vùng gen 16S rRNA chủng 1B, 12R2 30B2 với số chủng khác ngân hàng gen NCBI .73 Hình 3.7 Hình thái tế bào chủng 1B, 12R2, 30B2 L fermentum YB5 74 Hình 3.8 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 1B 78 Hình 3.9 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 12R2 78 Hình 3.10 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên L fermentum 30B2 79 viii Đồ án tốt nghiệp Hình 3.11 Kết khả kháng màng sinh học NBG lên C.albicans .79 Hình 3.12 Kết so sánh khả tạo màng sinh học số chủng NBG BG thí nghiệm chọn lọc vi khuẩn lactic có khả tạo màng sinh học 80 Hình 3.13 Tổng hợp khả kháng tạo thành màng sinh học chủng NBG .81 ix Đồ án tốt nghiệp [79] A F P J W Mark Keen, "The clinical significance of nasal irrigation bottle contamination," 2010 [80] P M R P J P I B H C J W G E P Davies D G., "The involvement of cell-tocell signals in the Science,development of a bacterial biofilm," Science, pp 295-298., 1998 [81] K P Watnick P., "Biofilm, city of microbes," Journal of Bacteriology, pp 182(10), pp 2675-2679, 2000 [82] C W G., "Biofilm processes," Biofilms, pp 195-231., 1990 [83] R H H M A K Z A J B Bendinger B., "Physicochemical cell surface and adhesive properties of coryneform bacteria related to the presence and chain length of mycolic acids," in Applied, 1993, pp 59, pp 3973-3977 [84] J W U S P S S A R & S K Hans-Curt Flemming, "Biofilms: an emergent form of bacterial life," Nature Reviews Microbiology, p 563–575, 11 August 2016 [85] C D Nadell, J B Xavier and K R Foster, "The sociobiology of biofilms," in FEMS Microbiology Reviews, January 2009, p 33 (1): 206–224 [86] C J Stewart PS, "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms," Lancet, p 358 (9276): 135–8, July 2001 [87] E J R K E P a R P Kristi L Frank, "In Vitro Effects of Antimicrobial Agents on Planktonic and Biofilm Forms of Staphylococcus lugdunensis Clinical Isolates," ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, p 888–895, Mar 2007 [88] D A W., "Microbial exopolymer secretion in ocean environment:," Oceanography and Marine, pp 73-153, 1990 [89] B B O S S A L B Andersen PC, "Influence of xylem fluid chemistry on planktonic growth, biofilm formation and aggregation of Xylella fastidiosa," FEMS Microbiology Letters, p 274 (2): 210–7, September 2007 [90] W Characklis, M Nevimons and B Picologlou, "Influence of Fouling Biofilms on Heat Transfer," Heat Transfer Engineering, p 3: 23–37, 1981 [91] "Wikipedia," 11 July 2017 [Online] https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm [Accessed 04 08 2009] 90 Available: Đồ án tốt nghiệp [92] R Bollinger, A Barbas, E Bush, S Lin and W Parker, "Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix," The Journal of Theoretical Biology, p 249 (4): 826–831, 24 June 2007 [93] D J B P D Marsh, "Dental plaque as a biofilm," Journal of Industrial Microbiology Volume 15, p 169, 1995 [94] S P & W R T Humphrey, " A review of saliva: normal composition, flow, and function," The Journal of prosthetic dentistry, pp 85(2), 162–69., 2001 [95] M A D D Marsh PD, "Dental plaque biofilms: communities, conflict, and control," Periodontology 2000, pp 55(1), 16–35., 2011 [96] K K V S M J Stamatova I, "In vitro evaluation of yoghurt starter lactobacilli and Lactobacillus rhamnosus GG adhesion to saliva-coated surfaces.," Oral Microbiol Immunol 2009, p 24:218–223., 2009 [97] Y T M M Kato I, "Macrophage activation by Lactobacillus casei in mice," Micr Immunol , p 27: 611–618, 1983 [98] A H S S Meurman JH, "Recovery of Lactobacillus strain GG (ATCC 53103) from saliva of healthy volunteers after consumption of yoghurt prepared with the bacterium," Microb Ecol Health Dis, p 7: 295–298., 1994 [99] J N D C G S Silva M, "Antimicrobial substance from a human Lactobacillus strain.," Antimicrob Agents Chemother, p 31: 1231–1233, 1987 [100] G Y J A V D M H C G G B K R & B H J REID, "Microbiota restoration: natural and supplemented recovery of human microbial communities.," Nat Rev Microbiol, pp 9, 27-38 , 2011 [101] H L S Y.-L T D G HALLSTROM, "Effect of probiotic lozenges on inflammatory reactions and oral biofilm during experimental gingivitis.," Acta Odontol Scand., Jan 2013 [102] P Hasslöf, "Use of probiotics in the oral cavity," Probiotic Lactobacilli in the context of dental caries as a biofilm-mediated disease , pp 13 - 17, 2013 [103] "Oral health surveys - basic methods," in World Health Organization 4th edition, 1997 [104] e a Tran Van Truong, National oral health survey of Vietnam 2001, Hanoi, Vietnam: Medical Publishing House, 2002, 2002 91 Đồ án tốt nghiệp [105] T Le, "Người Lao Động," 24 2003 [Online] Available: http://nld.com.vn/suckhoe/tren-90-nguoi-viet-nam-bi-benh-rang-mieng-49913.htm [106] M a W Rogosa, "J Bacteriol," 1951 [107] T S R Sudhir K Shuklaa, "An Improved Crystal Violet Assay for Biofilm Quantification in 96-Well Microtitre Plate" [108] G A O'Toole, "Microtiter Dish Biofilm Formation Assay," Journal of Visualized Experiments, 30 Jan 2011 [109] Y Z & X J Li X, "Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans," in Microbiology,, 2003, p 353 [110] Z W T H W a Q Y Wu, "A simplified method for chromosome DNA preparation from filamentous Fungi.," Mycosystema 20, p 575–577, 2001 [111] B S P D L D Weisberg WG, " 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study," in J Bacteriol, 1991, p 173: 697–703 [112] S N a N M., "The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees.," in Molecular Biology and Evolution , 1987, pp 4:406-425 [113] F J., "onfidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap.," in Evolution, 1985, pp 39:783-791 [114] N M a K S Tamura K., "Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method.," in Proceedings of the National Academy of Sciences , 2004, pp 101:11030-11035 [115] G H J G Carlsson J, "Lactobacilli and streptococci in the mouth of children.," in Caries Res, 1975, pp 9(5):333-9 [116] J K a Y Q X Zhang, "Isolation and characterization of a Lactobacillus fermentum temperate bacteriophage from Chinese yogurt," The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology, p 857–863, 2006 [117] B A P A P Z MATTHEW D COLLINS, "Deoxyribonucleic Acid Homology Studies of Lactobacillus casei,Lactobacillus paracasei sp nov., subsp paracasei and subsp tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp nov., comb nov.," INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol 39, No , pp 105-108 , April 1989 92 Đồ án tốt nghiệp [118] P V U S W H Joanna Koort, "Lactobacillus curvatus subsp melibiosus is a later synonym of Lactobacillus sakei subsp carnosus," International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, pp 54, 1621–1626, 2004 [119] J A E F A M D COLLINS, "Lactobacillus oris sp nov from the Human Oral Cavity," INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY Vol 38, No , pp 116-118 , Jan 1988 [120] D M WHEATER, "The Characteristics of Lactobacillus plantarum, L helveticus and L casei," J gen Microbial, pp 12, 133-139, 1955 [121] A C W Ratih Dewanti, "Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli 0157:H7," International Journal of Food Microbiology 26, pp 147164 , 1995 [122] D C V B K K Z J Elleni Michu, "Biofilm formation on stainless steel by Staphylococcus epidermidis in milk and influence of glucose and sodium chloride on the development of ica-mediated biofilms," in International Dairy Journal, Volume 21, Issue 3, March 2011, pp 179-184 [123] S S K S a M J F M A Patrauchan, "Calcium influences cellular and extracellular product formation during biofilm-associated growth of a marine Pseudoalteromonas sp.," in Microbiology, 2005, pp 151, 2885–2897 [124] S A M E B V L L a R S S Maria I Rockenbach, "Salivary flow rate, pH, and concentrations of calcium, phosphate, and sIgA in Brazilian pregnant and nonpregnant women," Head Face Med, p 44, 28 Nov 2006 [125] D T Z M e a Rozkiewicz D, "Oral Candida albicans carriage in healthy preschool and school children.," in Adv Med Sci., 2006, p 51:187–90 [126] H S S N N T H U H Kubota, " Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress.," J Biosci Bioeng, pp 106, 381–386., 2008 [127] H Silk, "Diseases of the mouth," in Primary care, March 2014, p 75–90 [128] H O H M Y B Yimin Cai, "Lactobacillus paralimentarius sp nov., isolated from sourdough," International Journal of Systematic Bacteriology, pp 49, 1451-1455 , 1999 [129] P H F J A S E A M.-S S S C S C B R Leverett DH, "Caries risk assessment in a longitudinal discrimination study.," J Dent Res., p 72(2):538–543, 1993 93 Đồ án tốt nghiệp [130] R A C.-V C D S D C e a C C C Ribeiro, "The effect of iron on Streptococcus mutans biofilm and on enamel demineralization," in Brazilian Oral Research, vol 26, no 4, 2012, p 300–305 [131] S a K M Twetman, "Probiotics for caries," Adv Dent Res, p 24: 98–102, 2012 [132] S I W., "Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky," Microbiology, pp 147, pp 3-9., 2001 [133] T T Hằng, "PHÂN LẬP, NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG SINH HỌC Ở VIỆT NAM," 2011 [134] D T Truyền, "Hiệu biện pháp chăm sóc miệng cho," Y Học Thực Hành, pp 48-50, 2004 [135] e a Dickson, " A novel species-specific PCR assay for identifying Lactobacillus fermentum," J Med Microbiol 54, pp 299-303, 2005 [136] P J a P Sharma, "Probiotics and Their Efficacy in Improving Oral Health: A Review," Journal of Applied Pharmaceutical Science Vol 2, pp pp 151-163, November 2012 94 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC BẢNG Trình tự DNA L fermentum 1B đem so sánh với ngân hàng gen: ATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGG TGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGA AACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTA AAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATCT TGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGGGATGATGCATAGCCAAGTTGA CAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGC AACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTA AAGAATAACACGTATGACAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAAC CAAAATGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAACCTCGGTAATACGTACGT GGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT TCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA AACTGGATAACTTGAGTGCAG Trình tự DNA L fermentum 12R2 đem so sánh với ngân hàng gen: TGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGT GAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAA ACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAA AAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTT GTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTGAG AGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCA ACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAA AGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACC AAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT GGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTT Đồ án tốt nghiệp TCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGA AACTGGATAACTTGAGTGCAGA Trình tự DNA L fermentum 30B2 đem so sánh với ngân hàng gen: GATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGG GTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGG AAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTT AAAAAATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTATC TTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCAAGTTG ACAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAG CAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTT AAGGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACTTTGACGGTATTTAA CCAAAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTACG TGGCAAGGGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTT TTCTAACTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGG AAACTGGATAACTTGAGT Đồ án tốt nghiệp Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 1B: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 1.24 ± 2.14 2.04 ± 3.51 18B2 4.85 ± 3.71 2R2 2.92 ± 4.04 0.1 ± 0.17 20R 4.08 ± 3.51 0.04 ± 0.07 4R2 0.5 ± 0.54 5.57 ± 5.38 21R2 2.46 ± 1.86 0.25 ± 0.44 5R1 2.2 ± 2.85 8.34 ± 2.25 21B2 6.03 ± 1.6 1.52 ± 2.03 5B1 3.8 ± 5.04 10.2 ± 3.57 23R 0.4 ± 0.69 0.28 ± 0.48 7R2 7.92 ± 8.23 1.57 ± 1.5 23B1 10.09 ± 9.88 16.53 ± 7.57 7B2 2.39 ± 2.7 3.59 ± 0.42 23B2 4.91 ± 5.03 13.7 ± 5.71 8R2 5.6 ± 3.02 18.14 ± 6.18 26R1 7.14 ± 2.49 12.16 ± 3.06 8B 70.03 ± 10.5 2.77 ± 1.21 26R2 0.77 ± 0.74 2.28 ± 2.6 9B1 7.49 ± 7.07 8.61 ± 7.5 27R 4.66 ± 1.89 16.62 ± 18.45 10B2 3.89 ± 1.43 10.76 ± 3.67 27B2 20.89 ± 24.93 11B2 6.03 ± 6.08 0.93 ± 1.6 30R2 7.72 ± 3.02 0.17 ± 0.3 12R1 7.86 ± 5.21 0.61 ± 1.05 30B1 0.23 ± 0.29 0.62 ± 1.07 16B 72.36 ± 5.76 71.44 ± 3.68 Đồ án tốt nghiệp Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 12R2: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 18B2 1.92 ± 3.33 2R2 0 20R 3.41 ± 5.9 4R2 42.84 ± 12.43 21R2 0.65 ± 1.12 34.02 ± 22.1 5R1 31.11 ± 29.01 51.73 ± 12.79 21B2 61.04 ± 11.55 5B1 0 23R 0 7R2 35.08 ± 22.4 59.19 ± 3.96 23B1 34.67 ± 14.03 71.41 ± 10.03 7B2 55.09 ± 19.71 68.34 ± 7.82 23B2 22.12 ± 20.53 69.68 ± 13.01 8R2 25.22 ± 30.77 26R1 77.38 ± 6.63 78.17 ± 3.28 8B 0.17 ± 0.3 26R2 1.25 ± 2.17 10.36 ± 17.95 9B1 35.47 ± 5.67 32.82 ± 27.99 27R 0 10B2 59.28 ± 12.91 49.55 ± 33.48 27B2 2.48 ± 4.3 11B2 0 30R2 0 12R1 0.72 ± 1.25 30B1 41.33 ± 9.05 16B 46.36 ± 12.42 59.04 ± 8.95 Đồ án tốt nghiệp Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên L fermentum 30B2: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 18B2 28.41 ± 9.65 2R2 0 20R 0 4R2 0 21R2 54.06 ± 4.9 54.45 ± 6.49 5R1 0 21B2 63.15 ± 3.6 60.34 ± 4.17 5B1 0 23R 12.22 ± 5.51 7R2 0 23B1 61.48 ± 4.64 46.89 ± 7.19 7B2 10.71 ± 18.55 23B2 57.01 ± 1.02 40.08 ± 19.86 8R2 0 26R1 0 8B 0 26R2 0 9B1 0 27R 0 10B2 1.02 ± 1.77 27B2 0 11B2 0 30R2 0 12R1 0 30B1 0 16B 65.39 ± 9.31 Đồ án tốt nghiệp Kết khảo sát khả ức chế hình thành màng sinh học NBG lên Candida albicans: Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 Tỷ lệ 1:1 Tỷ lệ 1:2 1R2 0 18B2 0 2R2 0 20R 0 4R2 0 21R2 2.06 ± 1.9 51 ± 7.91 5R1 0 21B2 48.37 ± 4.34 5B1 0 23R 0 7R2 0 23B1 11.73 ± 10.41 7B2 0 23B2 1.4 ± 2.42 54.13 ± 3.89 8R2 35.39 ± 5.68 65.83 ± 9.28 26R1 0.61 ± 1.05 8B 25.82 ± 14.95 26R2 0 9B1 0 27R 0 10B2 54.75 ± 47.41 27B2 0 11B2 0 30R2 3.02 ± 5.23 12R1 0 30B1 0 16B 0 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Kết phân nhóm khả hình thành màng sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập Đồ án tốt nghiệp KẾT QUẢ KHÁNG MÀNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG ĐÁNG CHÚ Ý Chủng 16B kháng màng L fermentum 1B Chủng 26R1 kháng màng L fermentum 12R2 Chủng 21B2 kháng màng L fermentum 30B2 Chủng 8R2 kháng màng C albicans Đồ án tốt nghiệp CÁC ĐĨA THÍ NGHIỆM 96 SAU KHI NHUỘM MÀNG BẰNG CV (thí nghiệm kháng màng L fermentum 1B) (thí nghiệm kháng màng L fermentum 12R2) (thí nghiệm kháng màng L fermentum 30B2) Đồ án tốt nghiệp (thí nghiệm kháng màng C albicans) Thí nghiệm thử khả lên men nguồn carbohydrate chủng 1B, 12R2, 30B2 10 ... - Khảo sát mức độ sâu nhóm đối tượng - Phân lập vi khuẩn lactic khoang miệng - Khảo sát khả tạo màng sinh học vi khuẩn lactic miệng - Chọn chủng có khả tạo màng sinh học mạnh có khả tác nhân... đầu phân lập số vi khuẩn lactic khoang miệng có khả ức chế hình thành màng sinh học Lactobacillus spp có mảng bám miệng Tình hình nghiên cứu Nhiều năm qua, có nhiều nghiên cứu in vivo in vitro... tử) thử nghiệm sinh hóa (catalase) Khảo sát khả tạo màng sinh học chủng vi khuẩn lactic phương - pháp nuôi cấy đĩa 96 giếng, từ phân loại nhóm vi khuẩn lactic có khả tạo màng sinh học mạnh để chọn