Nghiên cứu thiết kế chuỗi polypeptide có khả năng ức chế độc tố thần kinh α - CBTX của nọc rắn hổ mang đất (naja kaouthia) bằng phần mềm discovery studi

Với 410 loài rắn độc trong tổng số 3000 loài rắn trên toàn thế giới, các nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các thành phần độc tố có trong nọc rắn đã giúp con người hiểu được cơ chế

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền Viện Công nghệ Sinh học – Viện KH&CN VN

-

Đinh Thị Lan

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CHUỖI POLYPEPTIDE CÓ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ ĐỘC TỐ THẦN KINH α – CBTX CỦA NỌC RẮN HỔ MANG

ĐẤT (NAJA KAOUTHIA) BẰNG PHẦN MỀM DISCOVERY STUDIO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Trương Nam Hải

Đề tài được thực hiện tại Phòng Kỹ thuật Di truyền Viện Công nghệ Sinh học – Viện KH&CN VN

Hà Nội 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tổng quan về độc tố nọc rắn 3

1.2 Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học 5

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

1.5 Phần mềm sử dụng trong mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc protein 10

1.6 Lựa chọn mục tiêu nghiên cứu 13

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.1 Vật liệu và trang thiết bị 16

2.2 Phương pháp 17

2.2.1.Chương trình mô phỏng cấu trúc polypeptide 17

2.2.2.Phương pháp mô hình hóa cấu trúc phức hệ polypeptide với α-Cbtx 19

2.2.3.Phương pháp mô phỏng động học phân tử 20

2.2.4.Nhân bản đoạn oligonucleotide bằng PCR 22

2.2.5 Phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp mang trình tự oligonucleotide 22

2.2.6.Phương pháp biểu hiện trong qui mô bình tam giác 23

2.2.7 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E coli 24

2.2.8 Phương pháp chuẩn bị mẫu cho tinh chế polypeptide tái tổ hợp 25

2.2.9 Phương pháp tinh chế polypeptide bằng HPLC 26

2.2.10 Phương pháp thử độc tính cấp của độc tố α – Cbtx và polypeptide 27

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Nghiên cứu thiết kế polypeptide ức chế nọc rắn bằng mô phỏng 29

3.1.1.Kết quả mô hình hóa cấu trúc polypeptide ức chế nọc rắn 29

3.1.2 Kết quả đánh giá chất lượng của mô hình cấu trúc chuỗi polypeptide 30

3.1.3 Kết quả tạo phức hệ chuỗi polypeptide với độc tố thần kinh α – Cbtx 31

3.2 Biểu hiện và tinh chế các đoạn polypeptide 35

3.2.1 Tổng hợp các đoạn oligonucleotide bằng PCR 35

3.2.2 Tách dòng các đoạn oligonucleotide trong vector pCR2.1 36

3.2.3.Thiết kế vector biểu hiện pET_peptide_model 36

3.2.4.Kết quả sàng lọc khuẩn lạc đủ điều kiện 37

3.2.5.Kết quả biểu hiện polypeptide tái tổ hợp 38

3.2.6.Kết quả kiểm tra tính tan của các polypeptide được biểu hiện 39

3.2.7.Kết quả tinh chế polypeptide tái tổ hợp trên cột phân tích 40

3.2.8.Kết quả tinh chế polypeptide tái tổ hợp trên cột bán điều chế 41

3.3 Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của các đoạn polypeptide tái tổ hợp 42

3.3.1.Kết quả thử độc cấp tính của α-cobratoxin và polypeptide 42

3.3.2 Tác dụng của peptide khi tiêm vào chuột đã bị tiêm nọc độc rắn 44

3.3.3.Tác động của hỗn dịch polypeptide và α-cobratoxin trên chuột 45

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1.KẾT LUẬN 47

4.2.KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Trình tự 5 chuỗi polypeptide được thiết kế 15

(Các amino acid màu đỏ là các amino acid được thay thế) 15

Bảng 2: So sánh mức năng lượng của các phức hệ từ chương trình “Standard Dynamics Cascade” 31

Bảng 3: Kết quả Standard Dynamics Cascade 34

Bảng 4 Độc tính cấp của α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm 43

Bảng 5 Độc tính cấp của peptide trên chuột thí nghiệm 44

Bảng 6: Tác động của peptide lên tỷ lệ chết của chuột đã bị tiêm nọc rắn 44

Bảng 7 Tác động của hỗn dịch peptide và α-cobratoxin trên chuột thí nghiệm 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Các kiểu cấu trúc của nAChR 6

Hình 2: Kênh dẫn truyền tín hiệu thần kinh qua synap 6

Hình 3: So sánh trình tự thụ thể nAChR của người và của gà 14

Hình 4: Hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, Japan 17

Hình 5: Giao diện phần mềm LC solution 26

Hình 6: Kết quả Alignment Structure Modeler của 4 cấu trúc khuôn 29

Hình 7: Cấu trúc peptide mô hình so sánh với các cấu trúc khuôn 30

Hình 8: So sánh giá trị DOPE giữa các mô hình cấu trúc peptide khác nhau 30

Hình 9: Các pose trong kết quả mô phỏng phức hệ Model2_a7 – α – Cbtx 32

Hình 10: Pose 1 (Model2_a7) với ZDock Score cao nhất 33

Hình 11: Pose 546 (Model2_a7) với Rdock score cao nhất 34

Hình 12: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% 35

Hình 13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt pCR_peptide_model bằng NcoI và XhoI 37

Hình 14: Các khuẩn lạc được sàng lọc trên môi trường đĩa thạch LBA 38

Hình 15: Điện di protein tái tổ hợp trên gel Tricine-SDS PAGE 16 % 38

Hình 16: Kiểm tra dạng biểu hiện của polypeptide tái tổ hợp 39

Hình 17: Sắc ký đồ qui trình tinh chế polypeptide trên HPLC 40

Hình 18: Sắc ký đồ tinh chế polypeptide bằng cột bán điều chế LC-18 41

Hình 19: Polypeptide được tinh chế bằng HPLC 42

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

CHARMm Chemistry at HARvard Molecular Mechanics

dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates

DOPE Discrete Optimized Protein Energy

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FPLC Flow Protein Liquid Chromatography

HPLC High Performance Liquid Chromatography

nAChR Nicotinic acetylcholine receptor

Taq DNA polymerase DNA Polymerase của Thermus aquaticus

MỞ ĐẦU

Đã từ lâu, các loài rắn độc luôn là chủ đề được nhiều nhà khoa học đặc biệt quan tâm và hình ảnh con rắn đã trở thành biểu tượng của ngành y dược học Với 410 loài rắn độc trong tổng số 3000 loài rắn trên toàn thế giới, các nghiên cứu về cấu trúc

và chức năng của các thành phần độc tố có trong nọc rắn đã giúp con người hiểu được cơ chế gây độc, đồng thời khai thác sử dụng các thành phần của nọc rắn theo chiều hướng tích cực Từ đó mà một loạt các sản phẩm có nguồn gốc từ nọc rắn đã ra đời mang lại các thành tựu to lớn trong các ngành công nghiệp dược và công nghiệp

mỹ phẩm Các hướng nghiên cứu về phát triển các sản phẩm thuốc và mỹ phẩm có nguồn gốc từ nọc rắn cũng được phát triển Một số loại thuốc ra đời và đã thể hiện được vai trò không thể thiếu trong các phác đồ điều trị như huyết thanh kháng nọc sử dụng điều trị bệnh nhân bị rắn độc cắn, các loại thuốc giảm đau, thuốc chống viêm trong thấp khớp, đau cơ hay đau dây thần kinh dưới dạng thuốc tiêm hay thuốc mỡ bôi ngoài da Ngoài ra, các thành phần độc tố có trong nọc rắn còn được sử dụng để bào chế một số loại thuốc có tác dụng điều trị bệnh cao huyết áp, các loại thuốc cầm máu, chống chảy máu nội tạng, khống chế sự phát triển của tế bào ung thư, làm chậm

sự di căn của các tế bào ung thư,

Theo các nghiên cứu của Koh và cộng sự năm 2006, thành phần của nọc rắn bao gồm rất nhiều loại protein, enzyme và một số các khoáng chất, trong đó nhiều thành phần đã được xác định Độc tố thần kinh của nọc rắn (-Neurotoxins) được biết đến như là các độc tố thần kinh (neurotoxin) sau synap Chúng là thành phần độc

nhất, chủ yếu được tìm thấy trong nọc rắn thuộc họ Elapidae and Hydrophiidae [48]

Chúng gây ra sự tê liệt thần kinh bằng cách gắn với các thụ thể nicotinic ở vùng sau synap của hệ thống thần kinh cơ

Ngoài các ứng dụng to lớn của nọc rắn trong việc nghiên cứu và phát triển các loại thuốc trong điều trị thì hàng năm có hàng ngàn ca nhiễm độc dẫn tới tử vong do

bị rắn độc cắn Theo số liệu thống kê của WHO năm 2009 ước tính trung bình mỗi năm có khoảng 2.500.000 ca bị rắn độc cắn dẫn đến 125.000 ca tử vong, trong đó chủ yếu là ở châu Á với 100.000 ca và châu Phi với 20.000 ca [17] Riêng ở Việt Nam, hàng năm có khoảng 30.000 ca bị rắn cắn trong đó có 22 % số ca là do rắn độc cắn Kháng huyết thanh kháng nọc rắn lần đầu tiên được tìm ra bởi Albert Calmette, một nhà khoa học Pháp khi đó đang làm việc tại viện Pasteur Sài Gòn vào năm 1894 (là

loại kháng nọc rắn Naja naja) Sau đó vài chục năm, việc điều trị bằng các huyết

thanh kháng nọc đã mang lại cơ hội sống sót cho hàng ngàn bệnh nhân Tuy nhiên,

việc sử dụng và bảo quản huyết thanh kháng nọc còn phức tạp, qui mô sản xuất còn nhỏ hẹp do các hạn chế về mặt công nghệ Đứng trước nhu cầu của thực tế cần phát triển một loại thuốc hiệu quả dựa trên nền công nghệ hiện đại chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thiết kế chuỗi polypeptide có khả năng ức chế độc tố

thần kinh α – Cbtx của nọc Rắn hổ mang đất (Naja kaouthia) bằng phần mềm Discovery Studio”, nhằm mục đích thiết kế một polypeptide có ái lực gắn cao nhất

với độc tố α – Cbtx Polypeptide này sau đó được nghiên cứu tách dòng và biểu hiện

dưới dạng tái tổ hợp trong tế bào E coli BL21 với hiệu suất cao Các polypeptide tái

tổ hợp được tinh chế bằng sắc ký lỏng HPLC để phục vụ cho mục đích nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính ức chế độc tố thần kinh α – Cbtx của độc tố nọc rắn

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về độc tố nọc rắn

Nọc rắn là một nguồn khá đa dạng của nhiều hợp chất với một phổ hoạt tính sinh học rộng Nhiều protein trong nọc rắn có hoạt tính enzyme của phospholipase A2, proteinase, nucleotidase,phosphodiesterase, và L-amino acid oxidase Cùng với hoạt tính xúc tác có thể tham gia vào hoạt động phân giải của tuyến nọc, các enzyme này cũng bao gồm một số tác dụng dược học đa dạng như là tác dụng thần kinh, nhiễm độc cơ, tổn thương cơ tim, tác dụng làm tan và chảy máu cũng như chống đông máu Một số protein và polypeptide trong các loại nọc rắn khác không biểu hiện hoạt tính enzyme và do vậy được mô tả như những protein không có hoạt tính enzyme Các protein này thường có kích thước 5 đến 10 kDa bao gồm các độc tố thần kinh, độc tố gây rối loạn tim, độc tố nhiễm độc cơ, các chất ức chế kênh ion và các protein chống đông máu Đến nay hơn 1000 protein trong nọc rắn không có hoạt tính enzyme đã được xác định và được phân loại thành các họ protein như là: các độc

tố dạng 3 thùy gồm độc tố thần kinh và độc tố rối loạn tim, các chất ức chế serine protease, các chất lectin, sarafatoxins, các yếu tố kích thích phát triển thần kinh, các atrialnatriuretic peptide, các peptide kích thích bradykinin, disintegrin và helveprins [29], [33]

Về phân loại, nọc rắn có thể được chia thành 2 loại: hemotoxic (tấn công mô

và mạch máu) và neurotoxic (tấn công hệ thống thần kinh) Nọc rắn thường không màu hoặc có màu vàng nhạt phụ thuộc vào lượng L-aminoacide oxidase (riboflavin)

có trong nọc Nọc rắn không ổn định ở nhiệt độ thường, do vậy để duy trì hoạt tính sinh học của nọc rắn thì cần thiết phải tiến hành đông khô Một đặc điểm đặc trưng là

có sự khác nhau về thành phần nọc giữa các loài khác nhau và ngay trong bản thân mỗi loài Sự khác nhau về thành phần nọc cũng được thể hiện giữa rắn con và rắn trưởng thành, giữa các vùng địa lý khác nhau Các protein nọc rắn, bất kể là có hay không có hoạt tính enzyme, thường tiến hóa theo hướng phá hủy chức năng của các

mô, cơ quan và hệ thống sinh lý học Do vậy khi nọc được đưa vào con mồi, nó gây

ra sự tấn công đồng thời trên nhiều mô khác nhau, dẫn đến nhiều cơ quan hoặc hệ thống bị tổn thương và thường dẫn đến cái chết [44]

Độc tố thần kinh của nọc rắn (α-neurotoxin) cũng được biết đến như là các độc

tố thần kinh (neurotoxin) sau synap Chúng là thành phần độc nhất, chủ yếu được tìm

thấy trong nọc rắn thuộc họ Elapidae và Hydrophiidae Chúng gây ra sự tê liệt thần

kinh bằng cách gắn với các thụ thể nicotinic ở vùng sau synap của hệ thống thần kinh

cơ Các độc tố thần kinh nọc rắn đã được nghiên cứu rộng rãi về khía cạnh mối quan

hệ giữa cấu trúc và chức năng cũng như tổ chức gen và biểu hiện dưới dạng tái tổ hợp [9] Các nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của các độc tố thần kinh nọc rắn trên phương diện nghiên cứu khoa học và ứng dụng trong Y-Dược

Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tích cực giải mã những bí mật ẩn chứa trong thành phần của các loài rắn độc Sự hiểu biết sâu hơn về thành phần nọc và cách thức tiết ra nọc qua hàng triệu năm tiến hóa hứa hẹn sẽ khám phá ra những loại kháng huyết thanh kháng nọc độc rắn tốt hơn trong tương lai đối với các nạn nhân bị rắn độc cắn Quan trọng hơn, các nhà khoa học sẽ khám phá ra nhiều loại thuốc mới từ nọc rắn để chữa trị các bệnh ung thư, tim mạch và hàng loạt các loại bệnh khác [30]

Độc tố alpha Cobratoxin (α – Cbtx) có nguồn gốc từ nọc rắn hổ mang đất N

kaouthia Độc tố này thuộc nhóm độc tố thần kinh nọc rắn chuỗi dài α-neurotoxin, có

khả năng gắn với ái lực cao với các tiểu đơn vị α của thụ thể nicotinic acetylcholine tại màng sau synap của khớp nối dây thần kinh – cơ và một số mô tích điện Độc tố

α – Cbtx được cấu tạo bởi 71 amino acid với 10 Cys tạo 5 liên kết disulfide, trong đó Cys26-Cys30 tham gia vào quá trình gắn với thụ thể alpha 7 nicotinic acetylcholine (α7nAChR)

Trình tự amino acid của độc tố α – Cbtx:

IRCFITPDIT SKDCPNGHVC YTKTWCDAFC SIRGKRVDLG CAATCPTVKT GVDIQCCSTD NCNPFPTRKRP (NCBI ID: P01391)

Trong độc tố α – Cbtx các amino acid Cys 3, 14, 20, 41, 45, 56; Gly17, 40; Pro46; Asn63; Tyr21 đóng vai trò quan trọng trong hình thành cấu trúc không gian; Trp25, Arg33, Gly34 đóng vai trò chức năng, Cys26-Cys30, Lys35, Ala43, Ser58 và Asp60 là những amino acid bảo thủ của nhóm độc tố nọc rắn chuỗi dài Những bằng chứng có giá trị liên quan đến ảnh hưởng của tính độc khi biến đổi hóa học đối với các nhóm bảo thủ cho thấy các amino acid Trp25, Asp27, Arg33, Gly34 và Lys49 đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của độc tố α – Cbtx đối với thụ thể acetylcholine [10] Có 6 amino acid đóng vai trò quan trọng trong liên kết với thụ thể

là Trp25, Asp27, Arg33, Arg36 và Phe65 Những aminoacid này thuộc vùng liên kết với thụ thể cơ (Torpedo AChR) và thụ thể thần kinh (α7AChR), trong đó, Arg 33 có

vị trí gần với Tyr187 và Pro193 của α7 AChR Ngoài ra, các amino acid Ala128,

Lys35, Cys26, Cys30 chỉ gắn chọn lọc với α7 AChR; Lys23 và Lys49 chỉ gắn với Torpedo AChR [36]

1.2 Thụ thể nicotinic acetylcholine và ứng dụng trong y học

Nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) là các thụ thể tác động theo kiểu choline, tạo thành những kênh gắn phối tử tại màng tế bào (không qua chất truyền tin thứ hai) Đây là loại thụ thể thuộc nhóm kênh ion đóng - mở phụ thuộc vào các phối

tử và kênh này được khởi động bằng việc gắn acetylcholine – một trong những chất dẫn truyền thần kinh nghiên cứu tốt nhất Khi được giải phóng ra khỏi màng trước synap, acetylcholine khuếch tán nhanh qua khe synap và kết hợp với cơ quan thụ cảm

ở màng của nơron thứ hai – còn gọi là màng sau synap Kết quả làm thay đổi tính thấm của màng làm ion Na+ đi vào sau synap, gây khử cực màng nơron và làm xuất hiện điện thế sau synap Điện thế này nhỏ hơn và kéo dài hơn so với xung thần kinh Điện thế sau synap không tuân theo quy luật “tất cả hay không có gì” mà độ lớn nhỏ của nó phụ thuộc vào số lượng chất dẫn truyền được giải phóng [6]

Dựa trên vị trí và đặc tính dược học, nAChR được chia thành 2 nhóm theo vị trí định vị là nhóm định vị ở tế bào cơ và nhóm định vị ở tế bào thần kinh trung ương [12] Thụ thể nACh là những protein lập thể nằm xuyên màng, kích thước xấp xỉ 290 kDa Cấu tạo chung gồm 5 tiểu đơn vị được sắp xếp tuần tự quanh một lõi ion trong một mặt phẳng trực giao với màng tế bào [10] Mỗi tiểu đơn vị được tạo thành bởi 4 chuỗi xuyên màng (MI, MII, MIII và MIV), ngoài ra còn có thêm vùng liên kết với phối tử phía đầu –NH2, một cấu trúc vòng lớn và dễ biến đổi nằm giữa MIII và MIV Chuỗi MII của cả 5 tiểu đơn vị đều tham gia tạo thành lõi dẫn truyền ion [38], [47] Ngoài cấu tạo đặc trưng của loại kênh ion phụ thuộc phối tử, mỗi nhóm thụ thể nAChR lại có những sự kết hợp khác nhau của các tiểu đơn vị để tạo ra những nét đặc trưng riêng Nhóm thụ thể nAChR cơ cấu tạo dạng 2α1, 1β, 1δ và 1γ Ngược lại, thụ thể nAChR thần kinh được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị α cùng loại (α7, α9 hoặc α10) [17] Sự kết hợp đa dạng của các tiểu đơn vị trong nhóm thụ thể nAChR tác động lên

hệ thần kinh chính là đặc tính hấp dẫn các nhà nghiên cứu về hoá sinh học và dược học Xác định được vai trò của mỗi loại tiểu đơn vị trong các mô tự nhiên sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hoạt động cũng như vai trò của thụ thể nAChR và điều này chỉ

có thể tiến hành khi chúng ta phát triển được những mẫu dò chọn lọc đối với từng loại tiểu đơn vị [19]

Hình 1: Các kiểu cấu trúc của nAChR (Tiffany J Davis and Christopher M de Fiebre, Ph.D.) Kênh thụ thể acetylcholin là kênh dẫn truyền các tín hiệu thần kinh qua synap được nghiên cứu sâu nhất và nhiều nhất vì chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền xung thần kinh Các xung thần kinh được truyền qua hầu hết các synap bởi các phân tử nhỏ có khả năng khuếch tán gọi là các chất truyền thần kinh (neurotransmitters) như acetylcholine Màng trước synap được tách ra từ màng sau khớp thần kinh bằng một khe hở khoảng 50 nm, được gọi là khe synap Điểm kết thúc của một sợi trục axon trước synap được lấp đầy bằng các bóng synap, mỗi bóng chứa khoảng 104 phân tử acetylcholine (Hình 2) Một xung thần kinh mới xuất hiện làm tiết ra acetylcholin từ đồng thời khoảng 300 bóng synap, làm tăng lượng acetylcholine ở khe synap từ 10 nM lên 500 μM trong thời gian nhỏ hơn 1 mili giây [50]

Hình 2: Kênh dẫn truyền tín hiệu thần kinh qua synap (www.wikipedia.org; www.mult-sclerosis.org)

Sự liên kết của acetylcholin với màng sau synap làm thay đổi tính thấm ion của nó một cách rõ rệt Phân tử actylcholine đã mở ra một kênh trao đổi ion, tạo ra tính thấm cân bằng của Na+ và K+ Độ dẫn của cả Na+ và K+ tăng trong vòng 0,1 mili giây, kéo theo một lượng lớn Na+ vào trong và một lượng nhỏ K+ ra ngoài Sự xâm nhập của Na+ vào trong gây ra sự khử cực màng sau synap và sinh ra một điện thế hoạt động Sự chảy vào của Na+ lớn hơn rất nhiều so với sự chảy ra của K+, do đó gradient điện thế qua màng là do Na+ sinh ra Sự thay đổi tính thấm là do thụ thể nicotinic acetylcholine điều khiển Khoảng thời gian để kênh mở ra dưới tác động của điều kiện sinh lý chỉ được đo bằng mili giây, vì acetylcholine trong khe synap nhanh chóng bị thủy phân thành acetate và choline do enzyme acetylcholinesterase Enzyme này móc mỏ neo vào sau synap bằng liên kết cộng hóa trị với nhóm glycolipid và có số quay vòng hoạt động rất nhanh (25.000 vòng/giây) Nếu nồng độ acetylcholin còn lại cao, kênh sẽ tự đóng lại trong thời gian khoảng 1 giây, quá trình này gọi là sự gây mê [6]

Trong cơ thể, nAChR tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh từ

hệ thần kinh trung ương đến các cơ quan chức năng Do vậy, sự biến đổi của thụ thể nACh ở mức độ gen hay cấu trúc đều dẫn đến những bệnh liên quan đến chức năng thần kinh Các thí nghiệm đã cho thấy các thụ thể nicotinic acetylcholine làm trung gian cho một số chức năng của não bộ như nhận thức và trí nhớ cũng như trong quá trình diễn ra trạng thái bệnh lí của một số bệnh liên quan đến thần kinh như bệnh tâm thần phân liệt, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, hội chứng Tourette và một vài dạng động kinh [18], [49] Dựa vào những kết quả nghiên cứu mô hình cấu trúc của protein liên kết với acetylcholine (AChRP) cho thấy thụ thể nACh là những protein lập thể với sự chuyển đổi giữa một loạt các trạng thái cấu trúc (nghỉ - hoạt động – đóng) khi hoạt động Nếu các phối tử là những chất ức chế (antagonist) thì chúng sẽ gắn với thụ thể và chuyển thụ thể sang trạng thái nghỉ và làm dừng hoạt động Trong trường hợp các phối tử là chất kích thích (agonist) thì sau khi bám nó sẽ giữ thụ thể trong trạng thái mở và qua đó sự dẫn truyền các tín hiệu thần kinh diễn ra bình thường [21], [27] Một số động vật có nọc độc như rắn, bọ cạp, hay ốc sên thường tiêm hỗn hợp gồm các protein và peptide vào con mồi để làm tê liệt cơ và khiến chúng không có khả năng trốn thoát Với vị trí và vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu thần kinh, thụ thể nACh là đích tác động chủ yếu của các peptide độc tố Cho đến nay, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng độc tố thần kinh sau synap được phân lập từ

các loài rắn thuộc hai họ Elapidae và Hydrophiidae là những antagonist gắn với thụ

thể nACh với tính chọn lọc và ái lực cao Các độc tố như: α-bungarotoxin (α-Btx),

độc tố thần kinh chuỗi dài có trong nọc rắn cạp nong Bungarus multicinctus, và cobratoxin từ nọc của rắn hổ mang N naja siamensis (hay còn gọi là N kaouthia)

α-đều có khả năng bám vào thụ thể và làm cho thụ thể chuyển sang trạng thái nghỉ Sử dụng kỹ thuật NMR và xác định cấu trúc tinh thể đã cho thấy mô hình chung của 2 loại độc tố trên và của nhóm độc tố thần kinh nọc rắn nói chung có dạng 3 thùy, bao gồm các phiến β liên kết với nhau bởi các vòng nhỏ, được ổn định bởi các cầu disulfide Thêm vào đó, đỉnh của cấu trúc thùy thứ 2 tạo thành xoắn α nhỏ có chứa các amino acid quan trọng liên kết với nAChR [19], [43]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là một nước nhiệt đới thuộc khu vực Châu Á Thái Bình Dương có

90 phần trăm diện tích là rừng rậm và đất nông nghiệp, với bờ biển dài trên 3200 kilomet Những đặc điểm này thích hợp cho sự phát triển của các loài rắn Các kết

quả khảo sát đã cho thấy có hai họ rắn độc trú ngụ ở Việt Nam là rắn hổ (Elapidae)

và rắn lục (Viperidae) với 9 loài chính là: rắn hổ đất hay còn gọi là rắn hổ 1 mắt kính (N kaouthia), rắn hổ mèo hay rắn hổ 2 mắt kính (N sumantra), rắn hổ 2 gọng kính (N Atra), rắn hổ chúa (King Cobra - Ophiophagus Hannah), rắn cạp nong (Bungarus

Fasciatus), rắn cạp nia (Bungarus Candidus), rắn lục xanh (Green Pit Viper – Trimeresurus) gồm rắn lục tre môi trắng (Trimeresurus Albolabris) và rắn lục tre

xanh miền nam (Trimeresurus popeorum), và cuối cùng là rắn biển Mặc dù có một

nguồn tài nguyên các loại rắn độc tương đối phong phú nhưng những nghiên cứu sâu

về thành phần của nọc rắn vẫn còn hạn chế ở Việt Nam Từ năm 1990, Trịnh Xuân Kiếm cùng cộng sự đã sản xuất và thử nghiệm thành công kháng huyết thanh kháng

nọc của hai loại rắn độc phổ biến ở miền Nam là N kaouthia và Calloselasma

rhodostoma [4] Hoàng Ngọc Anh cùng cộng sự đã phân tách được từ nọc rắn N naja 4 phân đoạn chứa các peptide nhỏ có khả năng gây chết khi tiêm vào chuột thí

nghiệm [1] Gần đây, các nhà khoa học ở Viện vắc xin và chế phẩm sinh học Nha Trang cũng đã sản xuất và thử nghiệm thành công chế phẩm kháng huyết thanh kháng nọc rắn tre xanh môi trắng, một loại rắn cũng khá phổ biến ở miền Nam Việt Nam

Do các loài rắn trú ngụ ở các vùng sinh thái khác nhau thì sẽ có những đặc trưng khác nhau Vì vậy, sự hiểu biết kỹ lưỡng về các thành phần có hoạt tính sinh học có trong nọc rắn là rất quan trọng trong cả khía cạnh khoa học và thực tiễn Thêm vào đó, tính chọn lọc của các độc tố tự nhiên chính là chìa khóa cho các ứng dụng

khoa học Các nhà nghiên cứu có thể nhận được các loại thuốc thích hợp xuất phát từ những độc tố tự nhiên đó Hiện nay, các độc tố tự nhiên, đặc biệt là có nguồn gốc từ nọc rắn đang thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới về các khía cạnh như phân lập, tinh sạch và tìm hiểu cơ chế phân

tử của các độc tố Ngoài ra, do lượng độc tố thu được từ tự nhiên bao giờ cũng rất thấp nên với những kỹ thuật tiên tiến như tổng hợp protein trong các hệ biểu hiện

thích hợp (E coli hay nấm men Pichia pastoris), khối phổ và mô phỏng động học

phân tử, các độc tố tự nhiên được xem như một mô hình để từ đó tổng hợp nên các sản phẩm giống với chúng nhưng với số lượng nhiều hơn và được sử dụng làm thuốc chữa trị rắn cắn và điều trị các loại bệnh trong y học [2], [3], [5], [7]

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong nhiều năm gần đây, độc tố thần kinh từ nọc rắn (snake neurotoxins) đã thu hút sự chú ý của các nhà dược học và hóa sinh học trên thế giới Độc tố thần kinh rắn là các protein gây độc có trong nọc của các loại rắn như rắn hổ mang, rắn cạp nong, rắn hổ và rắn biển Chúng ngăn chặn sự dẫn truyền tín hiệu giữa các nơron thần kinh và gây ra cái chết cho con mồi do ngạt thở Những độc tố này được phân loại thành hai nhóm riêng biệt liên quan đến chức năng thần kinh đó là các độc tố trước synap và các độc tố sau synap Các độc tố trước synap (hay còn gọi là các -neurotoxin) ngăn chặn sự giải phóng acetylcholine từ tín hiệu thần kinh xuất phát phía trước synap Các độc tố sau synap (hay còn gọi là các -neurotoxin) gắn đặc hiệu với thụ thể nicotinic acetylcholine nằm phía cuối dây thần kinh vận động và tạo

ra sự cản trở không phân cực của sự truyền dẫn thần kinh cơ [8]

Các độc tố thần kinh sau synap tạo thành một nhóm lớn các protein tương đồng và chúng lại được phân chia tiếp thành 4 phân nhóm khác nhau là: (i) độc tố thần kinh chuỗi dài, (ii) độc tố thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin, (iii) -neurotoxins và (iv) các độc tố thần kinh không điển hình Mặc dù vậy, tất cả các độc

tố thần kinh sau synap đều có chung một kiểu cấu trúc gồm ba chuỗi beta chính nằm song song với nhau Do vậy, chúng cũng thuộc họ protein có tên gọi là “three-fingered”

Các độc tố thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin tạo bởi một chuỗi polypeptide dài 60-62 amino acid và được nối với nhau bởi 4 cầu disulfide ở các vị trí giữa C3-C24, C17-C45, C49-C60 và C61-C66 Quá trình tiết của những protein này được trợ giúp bởi trình tự tín hiệu tiết kị nước gồm 21 amino acid, sẽ bị loại bỏ trong quá trình

hoàn thiện Cho dù giống nhau về độ dài và trình tự chuỗi polypeptide nhưng độc tố thần kinh chuỗi ngắn và cardiotoxin có những tác dụng riêng biệt về mặt dược học Các độc tố thần kinh chuỗi ngắn ngăn chặn các thụ thể nicotinic acetylcholine trong khi cardiotoxin gây độc đối với tim Cả hai loại đều gây ra sự phân giải tế bào bằng cách phá vỡ cấu trúc màng của tất cả các loại tế bào hoạt động cũng như không hoạt động [39]

Các độc tố chuỗi dài được tạo bởi 70-74 amino acid với một cầu disulfide thứ năm giữa C30-C34 đặt ở đỉnh của vòng xoắn thứ 2, ngoài ra còn có các cầu disulfide giống với các độc tố chuỗi ngắn [20] Ngược lại với các độc tố chuỗi ngắn, độc tố chuỗi dài có một vài khác biệt ở trình tự cấu trúc bậc I đó là: mất một đoạn từ amino acid số 4 đến số 16; có thêm một số amino acid ở các vị trí 32, 34, 35 và 36; có sự thay thế Gly48 ở độc tố chuỗi ngắn bằng Thr48 ở chuỗi dài; sự có mặt của một đoạn trình tự đầu -COOH gồm 5 đến 9 amino acid

-Neurotoxins tạo thành một họ mới trong số các độc tố thần kinh có trong nọc rắn Cấu trúc của các -neurotoxin gần giống với các độc tố chuỗi dài, được tạo bởi 66 nhóm amino acid và 5 cầu disulfide [23] Chúng cũng bị mất một số amino acid từ vị trí 16 tới vị trí 20 và bổ sung thêm một số amino acid giữa vị trí 36 và 40 Tuy vậy, sự khác biệt ở -neurotoxin là có thêm một amino acid ở vị trí 62 [23] Còn lại các độc tố thần kinh không điển hình cũng được tạo bởi 65 hoặc 66 amino acid nhưng cầu disulfide thứ năm lại nằm ở vòng xoắn thứ nhất chứ không phải vòng xoắn thứ hai như đối với độc chuỗi dài và -neurotoxin

1.5 Phần mềm sử dụng trong mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc protein

Discovery Studio (DS), được phát triển bởi hãng Accelrys (Mỹ), là bộ phần mềm chuyên dùng cho mô hình hóa và mô phỏng cấu trúc của phân tử protein Chương trình gồm nhiều module cho các mục đích nghiên cứu cấu trúc protein khác nhau DS Modeller tiến hành so sánh trình tự amino acid và cấu trúc không gian của hai protein, phân tích thông tin về protein, mô hình hóa cấu trúc protein dựa trên cấu trúc của một hay một số protein tương đồng đã biết, cho phép đưa các đột biến vào cấu trúc phân tử protein DS Ligandfit dùng cho gắn phân tử cơ chất hoặc các phối tử vào vị trí gắn với thụ thể đích, DS Ligand Score tính toán tương tác giữa protein thụ thể với phối tử dựa trên nhiều thông số khác nhau DS CHARMm cho phép tính toán giá trị năng lượng, mức năng lượng nhỏ nhất và tiến hành mô phỏng động học cấu trúc phân tử Đặc biệt, trong phiên bản mới hiện nay có thêm module DS TOPKAT

có chức năng đánh giá định lượng mối quan hệ giữa cấu trúc liên quan đến chức năng

để xác định nhiều chỉ tiêu khác nhau liên quan đến độc tính (LD50, EC50, LC50, log P ) So với các phương pháp kiểm tra và sàng lọc truyền thống thường mất vài tuần cho đến vài tháng, công cụ này cho kết quả nhanh, chính xác, tiết kiệm được chi phí

và có thể tiến hành với nhiều mẫu cùng một lúc Bộ phần mềm Discovery Studio do được phát triển dựa trên phiên bản Insight II (được chạy trên hệ điều hành Linux, IRIS với hệ thống máy chủ và máy trạm chuyên dụng có cấu hình cao), được tích hợp thêm nhiều tính năng hơn và đặc biệt là có thể sử dụng cả trên nền tảng Windows (2000, XP) nên đã được rất nhiều công ty trong lĩnh vực dược phẩm, công nghệ sinh học, hóa dược cũng như các trường đại học trên thế giới sử dụng

Hai nguyên lý cơ bản mà phần mềm Discovery Studio sử dụng để làm việc một cách hiệu quả với các phức hệ protein là:

a, Nguyên lý chung của mô hình hóa cấu trúc phức hệ protein sử dụng trường lực

Trong các phương pháp trường lực, năng lượng điện tử với một cấu hình hạt nhân cho trước được tính bằng cách viết lại Ee dưới dạng một hàm tham số của các tọa độ hạt nhân Các tham số đưa vào hàm này được lấy phù hợp với thực nghiệm hay từ các phương pháp tính toán mức cao hơn Phân tử được mô hình như hệ các quả cầu và lò xo, gồm các nguyên tử được giữ với nhau bằng các liên kết Các

nguyên tử được xử lí như trong cơ học cổ điển theo định luật II Newton

Năng lượng trường lực được phân tách thành các số hạng mô tả năng lượng cần thiết

để làm biến dạng phân tử theo những kiểu riêng khác nhau

EFF = Estr + Ebend + Etors + Evdw + Eel + Ecross

Trong đó,

Estr : năng lượng cần để làm thay đổi độ dài liên kết giữa 2 nguyên tử

Ebend : năng lượng cần để làm thay đổi góc liên kết

Etors : năng lượng xoắn, cần để quay quanh một liên kết

Evdw , Eel : năng lượng tương tác nguyên tử-nguyên tử không liên kết

Ecross : mô tả ảnh hưởng qua lại giữa ba số hạng đầu tiên

EFF: Force Field Energy

Để tìm cấu hình bền của phân tử tương ứng với cực tiểu trên bề mặt thế năng,

ta tiến hành cực tiểu hóa EFF theo các tọa độ hạt nhân

Đối với các phương pháp trường lực, các phép tính đều được viết ở dạng cơ học cổ điển, do đó cho kết quả tính toán nhanh chóng, vấn đề cốt yếu của các phương

pháp này là xác định các tham số để đưa vào biểu thức tính Khi tính cho hệ các phân

tử lớn, không thể xác định tham số cho từng nguyên tử, từng liên kết cụ thể và cũng không thể xác định lại các tham số khi nghiên cứu các hệ phân tử khác nhau Vì vậy cần xây dựng bộ tham số có tính chất khái quát và rút gọn Trong mỗi bộ tham số được xây dựng, người ta xác định tham số cho các dạng nguyên tử theo số hiệu nguyên tử và tính chất liên kết mà nó tham gia Những bộ tham số này đều phải phù hợp tương đối với thực nghiệm hoặc các phương pháp tính toán lượng tử mức cao Không có bộ tham số nào tuyệt đối tốt hơn các bộ tham số khác và không thể đưa tham số từ trường lực này vào trường lực khác Một số trường lực phổ biến như UFF, Dreiding, Amber, CHARM

b, Kết hợp phương pháp cơ học lượng tử -cơ học phân tử trong mô phỏng động học phân tử

Một trong những khó khăn chủ yếu của hóa học tính toán khi nghiên cứu các

hệ lớn là cân bằng giữa độ chính xác của kết quả và thời gian tính toán Các phương pháp tính toán lượng tử tuy cho kết quả chính xác nhưng lại không thích hợp với những hệ như vậy do khối lượng tính toán quá lớn và việc thực hiện tính lượng tử cho những hệ hàng nghìn nguyên tử là điều hoàn toàn không khả thi

Một trường hợp điển hình là phương pháp kết hợp lợi dụng đặc điểm trong hầu hết các phản ứng với xúc tác enzyme, quá trình phá vỡ và hình thành liên kết chỉ xảy ra trên tâm hoạt động có sự tham gia của một số ít các nguyên tử trong phân tử protein, ảnh hưởng của phần còn lại trên protein thường chỉ là về mặt không gian và tương tác tĩnh điện Trong phương pháp kết hợp, mỗi vùng được xử lý bằng một phương pháp tính khác nhau Phần hoạt động hóa học được xử lý bằng phương pháp tính toán lượng tử mô tả chính xác sự phá vỡ, hình thành liên kết hóa học, phần còn lại có thể được xử lí bằng các phương pháp đỡ tốn kém thời gian hơn Nhờ đó vừa

mô tả được quá trình hóa học vừa tiết kiệm thời gian

Trên thế giới cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu thành công sử dụng phần mềm Discovery Studio Phải kể đến đầu tiên là thành công trong nghiên cứu xây dựng cấu trúc protein caspase-5 (một họ protease cysteine có vai trò quan trọng trong tế bào chết theo chương trình, hoại tử và sưng viêm) bằng mô hình hóa tương đồng và tiến hành Docking với các chất ức chết capase-5 trên phần mềm DS 2.5 để tìm hiểu cơ chế tác động của chúng [24] Hay thiết kế thuốc cho điều trị cúm A H1N1 bằng phần mềm Discovery Studio 2.0 (Accelrys, San Diego, CA, USA) với trình tự mới của H1N1(2009) được download từ ngân hàng cơ sở dữ liệu trình tự

virus cúm NCBI Các khuôn H1N1 có được từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB) Những cấu trúc này đã được công bố năm 2004 và năm 2006 với PDB ID lần lượt là 1RD8 và 2HU0 Từ đó đã xây dựng thành công cấu trúc mới nhất của N1 với độ tin cậy cao bằng Verify Score plot và Ramachandran plot Hơn nữa, 365.602 hợp chất

từ ngân hàng cơ sở dữ liệu NCI đã được sàng lọc và lần lượt tiến hành docking với cấu trúc H1N1 thu được Qua đó đã chọn lựa được 9 hợp chất là NCI0624650, NCI0607158, NCI0605741, protoverine, NCI0605737, Kanamycin-C, NCI0608643, NCI0606258, và NCI060865 có hiệu lực được lựa chọn để tạo ra các loại thuốc chống H1N1 sử dụng thay thế cho các thuốc mà H1N1 đã trở nên kháng thuốc (cấu trúc mới nhất của H1N1 đã kháng oseltamivir - loại thuốc điều trị cúm rất hiệu quả trước đó) [25]

1.6 Lựa chọn mục tiêu nghiên cứu

Thụ thể nicotinic acetylcholine của người và một số động vật khác (nAChR) được xác định là các protein lập thể nằm xuyên màng, có kích thước xấp xỉ 290 kDa Trong cơ thể, nAChR tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh từ hệ thần kinh trung ương đến các cơ quan chức năng [10] Do một nguyên nhân nào đó mà thụ thể nAChR không có khả năng tiếp nhận acetylcholine sẽ gây nên hiện tượng co giật, mất tri giác hay bị tê liệt hệ thống thần kinh trung ương Điều này có thể dễ dàng nhận thấy ở các bệnh nhân bị rắn cắn, do độc tố nọc rắn xâm nhập vào cơ thể theo đường máu, chúng len lỏi tới các tế bào cơ hoặc tế bào thần kinh, chúng tương tác ái lực với các thụ thể cơ hoặc thụ thể thần kinh sau synap, từ đó làm cho các thụ thể này không còn khả năng nhận acetylcholine, dẫn đến hiện tượng ngưng trệ quá trình truyền dẫn tín hiệu thần kinh [6] Các thí nghiệm đã cho thấy các thụ thể nicotinic acetylcholine làm trung gian cho một số chức năng của não bộ như nhận thức và trí nhớ cũng như trong quá trình diễn ra trạng thái bệnh lý của một số bệnh liên quan đến thần kinh như bệnh tâm thần phân liệt, bệnh Alzheimer, bệnh Parkinson, hội chứng Tourette và một vài dạng động kinh [18], [49]

Cho đến nay, cấu trúc bậc 3 của tiểu phần α7 của thụ thể nAChR của người chưa được công bố, hầu hết các nghiên cứu đều tập trung nghiên cứu cấu trúc không gian của thụ thể nAChR của gà Hiện tại, các cấu trúc được tìm thấy trên ngân hàng

dữ liệu protein PDB chủ yếu là các chuỗi peptide được xây dựa trên trình tự lý thuyết của gà Hai phân tử cấu trúc 1kl8 và 1kc4 được xây dựng bởi phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và 4 phân tử cấu trúc gồm 1OL3, 1OL4, 1OL8, 1OL9 được xây dựng bằng phương pháp mô phỏng cấu trúc [12] Bằng các phép so sánh về

trình tự giữa tiểu phần α7 của người và của gà cho thấy độ tương đồng giữa hai đoạn trình tự là 91 % Một số điểm khác biệt giữa 2 trình tự được quan tâm nghiên cứu gồm: Ser-183, Arg-185, Val-197 ở người được thay thế bởi các amino acid tương ứng là Thr, Ser, Ile trên trình tự ở gà

Hình 3: So sánh trình tự thụ thể nAChR của người và của gà

Các nghiên cứu của các tác giả Moise, Harel và Bourne về cấu trúc của nAChR đã chỉ ra được vùng trình tự tham gia vào quá trình gắn phối tử với độc tố thần kinh α – Cbtx nằm trên tiểu đơn vị α7 [12], [37] Vị trí các amino acid tham gia vào quá trình gắn với độc tố được xác định gồm Cys192 và Cys193 là những vị trí gắn với chất chủ vận và chất đối kháng; Tyr 93, 152, 190, 197 có ái lực cao với chất chủ vận và chất đối kháng Các nghiên cứu đột biến điểm đối với các nhóm trên đã gây nên sự thay đổi về ái lực gắn từ 5 – 100 lần [12] Các amino acid tại các vị trí Trp-86, Tyr-93; Trp-150, Gly-153; Arg-186, Asp-199 đóng vai trò quyết định trong việc tham gia vào liên kết gắn với phối tử Một số các amino acid bảo thủ khác đóng vai trò quyết định cấu trúc của thụ thể nAChR như Tyr-188, Tyr-195 và Cys-192/193 [21], [36]

Dựa vào các nghiên cứu cấu trúc được công bố, cùng với kết quả so sánh sự khác biệt giữa trình tự nAChR của người và của gà, chúng tôi quyết định lựa chọn đoạn trình tự có chiều dài khoảng 30 amino acid bắt đầu từ Leu-176 đến Arg-205 trên trình tự của chuỗi nAChR của người cho mục đích mô phỏng tạo cấu trúc lý thuyết Trên đoạn trình tự này, các amino acid nằm ở vị trí Cys -192/193 cùng với các trình tự bảo thủ khác gồm Tyr-188, Tyr-195, Arg-186 và Asp-197 được giữ nguyên trong trình tự của chuỗi polypeptide tiềm năng Các vị trí khác được nghiên cứu và thay thế bởi một số amino acid phù hợp với mục tiêu tăng cường ái lực của

chuỗi polypeptide lên độc tố thần kinh α – Cbtx Trình tự các chuỗi polypeptide với

vị trí các amino acid thay thế được thể hiện màu đỏ như sau:

Bảng 1: Trình tự 5 chuỗi polypeptide được thiết kế (Các amino acid màu đỏ là các amino acid được thay thế)

1 Model1_a7 LVGIPGKRSE RFYECCKEPY PDVTFTVTMR

2 Model2_a7 LVGIVGKRSE RFDNCCKDEP HGDVTFTVTMR

3 Model3_a7 LVGIVGFRSH RFYECCKDEP HGDVTFTVTMR

4 Model4_a7 LVGIVGFRSH WVYECCKDEP HGDVTFTVTMR

5 Model5_a7 NKDIRGWRHH WVYTCCKDEP HGDVTFTVTMR

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu và trang thiết bị

- Ngân hàng dữ liệu protein www.rcsb.org

- Hệ thống máy tính Workstation tại Viện Công nghệ sinh học

- Phần mềm Discovery Studio 2.5 của hãng Accelrys (San Diego, CA, USA)

- Chủng E coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1  lac U169 (80 lacZM15)] được sử dụng làm thể nhận trong thí nghiệm biến

nạp, chọn dòng và nhân các plasmid

- Chủng vi khuẩn E coli BL21: [F-omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS

(Caml)] được sử dụng là vật chủ cho biểu hiện gen

- Plasmid pCR2.1 (hãng Invitrogen) được sử dụng để tách dòng và nhân dòng gen

- Plasmid pET22b(+) (hãng Novagen) được sử dụng làm vector biểu hiện

- Máy móc thiết bị cần thiết: các máy móc cần thiết trong sinh học phân tử

- Các hóa chất cần thiết trong sinh học phân tử được cung cấp bởi các hãng tin cậy trên thế giới

- Các dung dịch dùng trong điện di Tricine – SDS – PAGE

- Dung môi được sử dụng cho tinh chế bằng HPLC gồm có: đệm A (0.1 % TFA trong nước); đệm B (60 % Acetonitrile, 0.1 % TFA trong nước)

- Cột sử dụng cho mục đích tinh sạch bằng sắc ký HPLC là cột LC-18 của hãng Supelcosil

- Chuột BALB/c khỏe mạnh, từ 10-15 tuần tuổi

- Nọc rắn hổ mang Naja kaouthia (Tiền Giang, Việt Nam)

Hình 4: Hệ thống sắc ký HPLC của Shimadzu, Japan

2.2 Phương pháp

2.2.1 Chương trình mô phỏng cấu trúc polypeptide

2.2.1.1 Nguyên lý phương pháp

Homology Modeling là một trong những công cụ hữu hiệu để xây dựng một

mô hình cấu trúc dựa trên đặc điểm tương đồng với các cấu trúc đã có sẵn Công cụ này thường được dùng để dự đoán cấu trúc không gian của một phân tử protein, peptide bất kỳ với trình tự đã biết dựa trên cở sở về tỉ lệ tương đồng với các cấu trúc

đã biết Công cụ này được tích hợp trong phần mềm Discovery Studio 2.5, là sự kết hợp của một loạt các chương trình con như: DS Sequence Analysis, DS MODELER,

DS Protein Families, DS Validate Protein Structures Thuật toán như CHARMm được sử dụng như là một nền tảng cơ bản cho các tính toán trong nghiên cứu cấu trúc Các bước thường được tiến hành trong qui trình xây dựng mô hình cấu trúc phân tử gồm có:

 Nhận dạng các tệp dữ liệu cấu trúc được sử dụng làm khuôn cho quá trình

mô hình hóa dựa vào công cụ BLAST Homology Search

 So sánh cấu trúc của các tệp dữ liệu (dạng PDB) để tìm ra các vùng cấu trúc tương đồng và trùng lặp bằng công cụ “Structure Alignment Methods”

 So sánh trình tự của mô hình peptide cần thiết kế với tệp dữ liệu mang thông tin đã được so sánh của các cấu trúc khuôn bằng công cụ “Sequence Alignment Methods”

 Sử dụng công cụ MODELER để xây dựng mô hình hóa cấu trúc

Tùy thuộc vào độ tương đồng của đoạn trình tự cần thiết kế và đoạn trình tự khuôn, chúng ta có thể lựa chọn các công cụ tìm kiếm với các thông số thiết lập khác nhau để tìm ra cấu trúc khuôn chính xác nhất

Một số lưu ý khi tiến hành nhận dạng trình tự khuôn và so sánh trình tự mô hình với trình tự khuôn, phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn mà chúng ta sẽ sử dụng các phương pháp khác nhau để xác định:

- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn lớn hơn 60%, công cụ tìm kiếm BLAST có thể dễ dàng tìm kiếm và nhận dạng chính xác trình tự khuôn cần thiết cho quá trình mô hình hóa

- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn nằm trong khoảng từ 25-60%, công cụ BLAST vẫn có thể tìm kiếm và nhận dạng chính xác trình tự khuôn cần thiết Tuy nhiên, chúng ta phải thiết lập bổ sung một số thông số cần thiết cho quá trình tìm kiếm nhằm loại bỏ các kết quả sai trong quá trình tìm kiếm Một kỹ thuật được sử dụng để tối ưu hóa kết quả quá trình tìm kiếm trong trường hợp này là tạo một tệp dữ liệu tìm kiếm (sequence profiles) sử dụng nguồn dữ liệu đã được chọn lọc

- Khi tỉ lệ tương đồng giữa trình tự mô hình và trình tự khuôn thấp hơn 25%, nên sử dụng phương pháp tìm kiếm lặp lại (PSI-BLAST) để nhận dạng trình

tự khuôn và tạo một tệp dữ liệu tìm kiếm (sequence profiles)

2.2.1.2 Tiến hành chạy “Build Homology Models”

- Kích hoạt chương trình “Build Homology Models” trong thư mục “Protein Modeling” thuộc phần “Protocols Explorer”

- Trong phần nhập các thông số dữ liệu “Parameters Explorer”, kích chuột vào

“Input Sequence Alignment” và chọn peptide_model_profile_sequence

- Mở rộng khung nhập gữ liệu “Input Sequence Alignment”, kích chuột vào

“Input Model Sequence” và chọn peptide_model

- Kích chuột vào “Input Template Structures” và chọn tất cả 4 hoặc 5 cấu trúc được hiển thị

- Trong mục “Optimization Level” có thể chọn Low hoặc High, tùy thuộc yêu cầu

- Kích “Run” trên thanh công cụ “Protocols toolbar” để tiến hành chạy chương trình

2.2.2 Phương pháp mô hình hóa cấu trúc phức hệ polypeptide và α – Cbtx

2.2.2.1 Nguyên lý chương trình Dock Protein (ZDock)

Sử dụng chương trình Dock Protein (ZDock) nằm trong thư mục “Protein Modeling” của phần mềm Discovery Studio 2.5 để tiến hành xây dựng mô hình phức

hệ polypeptide ức chế nọc rắn và độc tố thần kinh α – Cbtx Chương trình này cung cấp các phương pháp để tiến hành gắn (docking) cấu trúc của 02 phân tử protein với nhau dựa trên thuật toán ZDOCK ZDOCK là một thuật toán được phát triển dựa trên nền tảng căn bản của một loạt các thuật toán như FTDock, DOT hay GRAMM [22], [32], [46], [14] ZDOCK là một chương trình docking đòi hỏi cung cấp một lượng thông tin tối thiểu về vị trí gắn đặc hiệu (binding site) của 02 phân tử thành phần Chương trình sử dụng các phân tử protein đơn lẻ với cấu trúc đã được nghiên cứu bằng các con đường thực nghiệm hoặc thông qua các kỹ thuật tính toán máy tính để

từ đó dự đoán cấu trúc tương tác giữa hai phân tử protein riêng rẽ ZDOCK sử dụng phương pháp dự đoán khuôn mẫu bổ sung được gọi là Pairwise Shape Complementary (PSC) Phương pháp này (PSC) được sử dụng tùy chọn cùng với các chỉ số năng lượng về mức độ desolvation (DE) và tĩnh điện (electrostatics) để phân loại và xếp hạng các trường hợp docking thành công [15]

2.2.2.2 Tiến hành chạy Dock Protein (ZDock)

Để tiến hành chạy qúa trình gắn polypeptide và độc tố thần kinh α – Cbtx bằng chương trình Dock Proteins (ZDock), chúng ta phải thực hiện các bước sau:

 Nhập cấu trúc phân tử protein cần docking, phân tử protein này được coi như là “receptor”

 Nhập cấu trúc phân tử protein cần gắn vào receptor ở trên, phân tử protein này được xem như là “ligand”

 Kích hoạt chương trình Dock Proteins (ZDock) trong thư mục “Protein Modeling”

 Nhập các thông số cần thiết trong bảng “Parameter Explorer”

 Chọn tên protein cấu trúc được xem là “receptor” trong phần “Input

Receptor Structure”

 Chọn tên protein cấu trúc được xem là “ligand” trong phần “Input

Ligand Structure”

 Điều chỉnh các thông số cần thiết như : Filter Poses, ZRank, Clustering,…

 Kích chuột vào biểu tượng “Run” để tiến hành chạy chương trình

2.2.3 Phương pháp mô phỏng động học phân tử

2.2.3.1 Chương trình mô phỏng cấu trúc polypeptide

Quá trình mô phỏng động học cấu trúc một phân tử được tiến hành nhờ vào thuật toán CHARMm cùng với các chương trình con được tích hợp trong module Simulation của Accelrys Chương trình này áp dụng thuật toán CHARMm cùng với các trường lực (Forcefield) cụ thể của chương trình gồm có: CHARMm, CHARMm polar H, charmm19, charmm22, charmm27, cff, … để tạo nên mô hình chuyển động của một cấu trúc với độ chính xác và tin cậy cao nhằm tìm ra các cấu trúc không gian khác nhau của cùng một phân tử Từ đó xây dựng cơ sở dữ liệu về một loạt các phân tích về cấu trúc và các đặc tính liên quan đến năng lượng của hệ thống hoặc nghiên cứu ảnh hưởng của các dung môi khác nhau lên cấu trúc của phức hệ protein

“Standard Dynamics Cascade” là một chương trình con nằm trong gói chương trình “Simulation” Chương trình này tiến hành một loạt các bước tính toán và tối ưu cấu trúc nguồn nhằm tìm ra cấu trúc tối ưu nhất Các thông số được thiết lập theo chế

độ mặc định, đồng thời có thể thay đổi tùy theo yêu cầu của công việc Chương trình

“Standard Dynamics Cascade” được tiến hành bao gồm các chương trình con như sau:

 Minimization: là bước đầu tiên của quá trình nghiên cứu mô phỏng động học phân tử, đồng thời cũng là quá trình tối ưu hóa mức năng lượng lần thứ nhất Quá trình này sử dụng thuật toán ban đầu là Steepest Descent (SD) để xử lý các liên kết trong toàn bộ hệ thống mà không làm thay đổi nhiều cấu trúc

 Minimization2: Đây là bước tối ưu hóa mức năng lượng lần thứ 2, sử dụng phương pháp Adopted Basis Newton-Raphson (ABNR) Quá trình này được sử dụng để đảm bảo mức năng lượng nhỏ nhất sẽ được áp dụng cho giai đoạn nghiên cứu động học tiếp theo của qui trình

 Heating: Giai đoạn tiếp theo của quá trình nghiên cứu động học là xử lý

hệ thống cấu trúc với một nhiệt độ xác định

 Dynamis (Equilibration): Đây là qui trình chuẩn đầu tiên của quá trình

mô phỏng động học phân tử để cân bằng toàn bộ hệ thống ở nhiệt độ yêu cầu Quá trình này sẽ tiến hành phân bố năng lượng được cung cấp cho mọi phân tử trong hệ thống, đảm bảo hệ thống tồn tại ở trạng thái cân bằng động ở nhiệt độ xác định

 Production: Là giai đoạn xử lý các số liệu thống kê bằng thuật toán frog Verlet Kết quả của quá trình này là tạo nên các tệp dữ liệu mang thông tin cấu trúc và toạ độ không gian của các cấu hình không gian khác nhau

Leap-2.2.3.2 Các bước chuẩn bị cho qui trình mô phỏng động học

Qui trình mô phỏng động học phân tử protein được tiến hành qua các bước như chuẩn bị tệp cấu trúc mang thông tin cấu trúc của phân tử cần tính toán Xử lý tệp cấu trúc với trường năng lượng phù hợp, truy xuất vào chương trình Standard Dynamics Cascade trong module Simulation, nhập các thông số dữ liệu của chương trình:

 Khởi động phần mềm Discovery Studio

 Từ thanh Menu chọn Window  chọn Close all  chọn No nếu được hỏi có lưu các thay đổi hay không

 Từ File Explorer chọn đường dẫn để mở file dữ liệu có tên: Pose 1.dsv

 Loại bỏ các cấu hình thay thế bằng cách truy xuất vào Preferences  chọn Protein Utilities  chọn Clean Protein and check Alternate Conformations để đảm bảo chỉ giữ lại một cấu trúc duy nhất trong Molecular Window Chọn OK để đóng cửa sổ Preferences Sau đó trong khung của công cụ Protein Reports and Utilities tools kích chuột vào Clean

 Trước khi tiến hành, phân tử protein cần phải được xử lý với trường lực (forcefield typing) trong Simulate Structure panel Trong phần Tools explorer, kích chuột để mở Simulate Structure panel Trong phần Forcefield chọn CHARMm  chọn Apply Forcefield

 Truy nhập chương trình Standard Dynamics Cascade bằng cách kích chuột vào “Simulations” trong Protocols Explorer

 Bảng thiết lập thông số “Parameter Explorer” với các thông số về tệp cấu trúc đầu vào, thông số cho quá trình “Minimization 1 và 2”, quá cân bằng động (equilibration) và quá trình hoàn thiện cấu trúc, hằng số áp suất của hệ thống, các thông số về hệ dung môi ảo (Implicite solvent model)

Quy trình mô phỏng chuỗi polypeptide đạt được là do nỗ lực tìm hiểu chức năng của từng Module trong phần mềm cùng với việc thử nghiệm trên nhiều mô hình khác nhau nhằm tìm ra một quy trình tối ưu nhất

2.2.4 Nhân bản đoạn oligonucleotide bằng PCR

Hai mồi được tổng hợp bởi công ty GenScript (Mỹ), trong đó mồi xuôi bao gồm cả trình tự của oligonucleotide mã hóa cho polypeptide đã thiết kế

Primer model 3_F for E coli:

GCGCCCATGG(NcoI)ATGTGGGCATTGTTGGTTTTCGTA

GCCATCGCTTCTATGAATGCTGTAAAGATGAACCGCACG

GCGACGTCACCTTTACGGTTACCATGCT

Primer model 3_R for E coli:

CTTCTCGAG (XhoI) CATGGTAACCGTAAAGGTGAC

Bước 7: 40C – 3 giờ Bước 8: Kết thúc

2.2.5 Phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp mang trình tự oligonucleotide

Vector được chúng tôi sử dụng cho thí nghiệm này là vector pET22b(+) được cung cấp bởi hãng Novagen, USA Vector này là một hệ vector biểu hiện với rất nhiều ưu điểm vượt trội như promoter mạnh T7, dấu chuẩn chọn lọc là gen kháng Ampicilline, có một vùng đa điểm cắt - MCS (Multi Clonning Site) với nhiều vị trí của các enzyme hạn chế, thuận lợi cho việc nối ghép gen Đoạn gen ngoại lai được