2.2.7.1. Nguyên lý
Dưới tác dụng của các hóa chất NaOH, SDS thành tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, dau đó làm biến tính các phân tử protein. Khi thay đổi giá trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M), các phân tử protein biến tính sẽ kết tủa, kéo theo DNA genome kết tủa xuống đáy. Phần protein còn lại cùng các mảnh vỡ của tế bào sẽ được kết tủa bằng dung dịch Cloroform:Isoamylalcohol (24:1 v/v) và được tách ra khỏi phần dung dịch chứa DNA plasmid bằng cách ly tâm ở tốc độ cao. RNA có trong dung dịch được loại bỏ bằng cách bổ sung nước chứa RNase.
2.2.7.2. Quy trình
- Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy qua đêm ở trên vào eppendorf, ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút, thu tế bào.
- Hòa đều tế bào thu được trong 100 µl dung dịch I (50 mM glucose, 25 mM TrisHCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0) bằng máy Votex. Từ lúc này, các thao tác với mẫu được thực hiện ở nhiệt độ lạnh.
- Bổ sung 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N; SDS 1%), đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy AND hệ gen, đặt trên đá 5 phút.
- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, đảo đều nhanh bằng cách lắc nhẹ, tủa xuất hiện có màu trắng đục, sau đó đặt trong đá 10 phút.
- Thêm 450 µl chloroform: isoamylalcohol vào mẫu, lắc nhẹ để các protein nhỏ hòa tan, sau đó ly tâm ở 13.000 rpm trong 5 phút.
25
- Sau khi ly tâm mẫu phân thành ba pha: pha trên cùng chứa DNA của plasmid, RNA; pha giữa là protein không tan (kết tủa màu trắng), pha dưới là chloroforom : isoamylalcohol và protein tan. Dùng pipet loại nhỏ hút nhẹ nhàng pha trên cùng chuyển sang ống eppendorf loại 1,5 ml mới, sau đó tủa DNA plasmid bằng hai lần cồn tuyệt đối, ủ ở -200C trong 20 phút.
- Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút, thu tủa DNA.
- Thêm 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm trong 5 phút, thu tủa. - Ly tâm, hút nước.
- Speed vac 3 phút.
- Bổ sung 30 µl nước chứa RNase (10 mg/ml) cho mỗi ống.