Sau khi tiến hành nuôi cấy dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp trong môi trường LB ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm, tế bào thu được sẽ được xử lý để tách chiết thu plasmid pCR_peptide_model. Sau đó, plasmid này được cắt bằng hai enzym là XhoI và NcoI, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose,
theo dự tính sẽ xuất hiện hai đoạn băng là 0,1 kb và 3,9 kb. Với việc sử dụng hai enzym này thì trình tự của đoạn gen vẫn luôn đảm bảo đúng khung đọc mở, do đó mà không ảnh hưởng đến việc dịch mã tạo protein sau này.
Đoạn oligonucleotide có kích thước 0.1 kb giới hạn bởi NcoI và XhoI
được thu lại bằng cột tinh sạch QiaGen. Bằng việc xử lý đồng thời hai enzym hạn chế có trình tự cắt khác nhau và có khả năng tạo đầu dính, chúng tôi đã tạo ra được đoạn gen có hai đầu dính có trình tự không bổ sung, do vậy tránh được khả năng tự đóng vòng và đoạn gen sẽ được đưa vào xuôi chiều khung đọc mở.
37
Hình 13: Kết quả điện di kiểm tra
sản phẩm cắt pCR_peptide_model bằng NcoI và XhoI. Đường chạy 1, 2, 3, 5, 6: pCR_peptide_model.
Đường chạy 4: Thang DNA chuẩn 100 bp (fermentas).
Đoạn gen sau đó được đưa vào vector pET22b(+) đã được mở vòng bằng 2 enzyme hạn chế tương tự. Sản phẩm của phản ứng nối ghép được biến nạp vào tế bào
E. coli DH5α và được trải trên đĩa thạch có bổ sung Ampicilline phục vụ cho mục
đích sàng lọc. Các khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có bổ sung Ampicilline được lựa chọn và cấy chuyển vào môi trường LB lỏng để nuôi cấy qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 370C. Tế bào trong dịch nuôi cấy được thu lại và được sử dụng cho qui trình tách chiết thu plasmid tái tổ hợp phục vụ cho các bước kiểm tra. Plasmid tái tổ hợp có tên là pET_peptide_model được tách chiết và kiểm tra bằng kỹ thuật cắt bằng enzyme giới hạn (sử dụng cặp enzyme: NcoI và XhoI) và xác định trình tự (trên máy ABI PRISM 3100 của viện Công nghệ sinh học) nhằm khẳng định đoạn gen chèn vào là đoạn gen mong muốn. Các khuẩn lạc đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng cho bước biểu hiện để thu lượng polypeptide tái tổ hợp trong các thí nghiệm tiếp theo.