Vector được chúng tôi sử dụng cho thí nghiệm này là vector pET22b(+) được cung cấp bởi hãng Novagen, USA. Vector này là một hệ vector biểu hiện với rất nhiều ưu điểm vượt trội như promoter mạnh T7, dấu chuẩn chọn lọc là gen kháng Ampicilline, có một vùng đa điểm cắt - MCS (Multi Clonning Site) với nhiều vị trí của các enzyme hạn chế, thuận lợi cho việc nối ghép gen. Đoạn gen ngoại lai được
23
chèn vào trong vùng trình tự của MCS phải phù hợp với khung đọc của ribosome tính từ điểm bắt đầu nằm trong trình tự của promoter T7. Kích thước của đoạn gen chèn vào nên nằm trong khoảng từ 100 bazơ nitơ đến khoảng 2000 bazơ nitơ để đảm bảo cho protein biểu hiện có kích thước không quá nhỏ cũng như không quá lớn.
Đoạn oligonucleotide sau khi được nhân lên bằng kỹ thuật PCR sẽ được tinh sạch bằng bộ kit của QiaGen nhằm loại bỏ các thành phần dư thừa của phản ứng. Sản phẩm PCR đã tinh sạch được nối với vector pCR2.1 sau đó được biến nạp bằng sốc nhiệt vào E.coli DH5α và sàng lọc khuẩn lạc bằng cơ chất X-gal để thu được các khuẩn lạc mang gen ngoại lai. Sau khi nuôi cấy, tiến hành thu plasmid pCR_peptide_model, plasmid này tiếp tục được cắt bằng hai enzym là XhoI và NcoI nhằm tạo trình tự so le ở 2 đầu 5’ và 3’ thuận lợi cho việc gắn đoạn trình tự này vào vector pET22b(+). Sản phẩm của phản ứng cắt (đoạn oligonucleotide có kích thước 0,1 kb) tiếp tục được thu lại bằng cột tinh sạch QiaGen để sử dụng cho phản ứng nối ghép với vector pET22b(+) với sự tham gia của enzyme T4-ligase. Sản phẩm của phản ứng nối ghép được biến nạp vào tế bào E. coli DH5α cho mục đích sàng lọc trên môi trường đĩa thạch chứa 1% NaCl, 1% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 1.6% Agar, 1mM X-gal, 0.1mg Amp.
Quy trình biến nạp pET22b(+) vào E. coli DH5α:
Lấy 50 µl tế bào khả biến trộn với 1 µl DNA, mix đều, giữ ở 200C trong đá. Sốc nhiệt 420C trong 90 giây.
Bổ sung 800 ml LB lỏng, lắc 370C trong 20 phút. Hút 50 µl trải trên đĩa LBA, nuôi 370C qua đêm.
Các khuẩn lạc trắng được lựa chọn để tách plasmid kiểm tra sự có mặt của gen ngoại lai đã được chèn vào. Vector tái tổ hợp pET_peptide_model tách từ E. coli DH5α được biến nạp vào E. Coli BL21, các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp được sàng lọc để tiếp tục biểu hiện trên qui mô bình tam giác.