Phân tử protein cấu trúc độc tố α – Cbtx (PDB ID: 1YI5) được sử dụng đóng vai trò như một thụ thể (receptor), mỗi phân tử polypeptide đã được xây dựng cấu trúc thành công đóng vai trò như một cơ chất gắn (ligand) để tiến hành quá trình xây dựng cấu trúc phức hệ polypeptide – độc tố thần kinh α – Cbtx bằng chương trình Dock Protein (ZDock). Các thông số như “Receptor blocked residues”, “Ligand blocked residues”, “Receptor & Ligand binding residues” được lựa chọn trong “Filter
32
pose” để tăng cường khả năng sàng lọc. Thông số ZRANK được chọn là “True” để chương trình tự động xếp hạng các kiểu tương tác (các pose) trong tập hợp các kiểu tương tác tạo thành. Quá trình này được tiến hành tương tự đối với 05 mô hình cấu trúc chuỗi polypeptide đã được xây dựng thành công ở bước trên với phân tử độc tố 1YI5 để cho ra một tập hợp các kiểu tương tác cho từng trường hợp riêng rẽ.
Hình 9: Các pose trong kết quả mô phỏng phức hệ Model2_a7 – α – Cbtx Kết quả mô phỏng tương tác của Model2_a7 với độc tố α – Cbtx thu được 559 các kiểu tương tác khác nhau được phân chia vào các nhóm khác nhau (clusters). Mỗi kiểu tương tác đại diện cho một trường hợp liên kết giữa polypeptide và độc tố thần kinh α – Cbtx . Vị trí của các amino acid trong vùng gắn (binding site) được định nghĩa nhằm mục đích giới hạn các trường hợp liên kết. ZDOCK được lập trình để nhận dạng một cấu trúc là receptor – cấu trúc này sẽ được giữ cố định, một cấu trúc là ligand – cấu trúc này sẽ được xoay quanh receptor tại vị trí liên kết, đồng thời mức năng lượng của mỗi trạng thái của phức hệ được tính toán và lưu lại. Vì vậy thụ thể và chất gắn có thể liên kết với nhau ở rất nhiều vị trí khác nhau xung quanh vùng biding site và trong chương trình ZDock các trạng thái liên kết sẽ được sắp xếp theo thứ tự giảm dần của giá trị “ZDock score”, kiểu tương tác đầu tiên trong danh sách – trạng thái liên kết có “ZDock score” cao nhất là kiểu tương tác tối ưu nhất. Trên hình 9 là hình ảnh của pose 1 với “ZDock score” cao nhất là 33,55.
33
Hình 10: Pose 1 (Model2_a7) với ZDock Score cao nhất
Từ tập hợp số lượng lớn các kiểu tương tác được tạo thành, chúng tôi tiến hành chạy Process Pose (ZDock) nhằm tìm ra một tập hợp các kiểu tương tác có mức độ gắn tốt nhất cho phức hệ polypeptide và độc tố α – Cbtx. Các thông số được thiết lập cho quá trình này gồm có giá trị “RMSD cutoff”, “Ligand/receptor binding site residues” trong bảng thông số “Paramters”. Quá trình này cho phép thu được một tập hợp các kiểu tương tác thỏa mãn các điều kiện sàng lọc và loại bỏ các kiểu tương tác không đạt điều kiện. Điều này giúp chúng ta giảm bớt thời gian thao tác với các kiểu tương tác không đủ điều kiện và tập trung vào phân tích các kiểu tương tác thỏa mãn điều kiện nhằm tìm ra kiểu tương tác có mức độ gắn tối ưu nhất. Áp dụng thuật toán RDock [15] trong chương trình “Refine Docked Proteins (RDock)” các kiểu tương tác được lựa chọn sau khi chạy “Process Poses (ZDock)” được sử dụng làm dữ liệu nguồn để tiến hành sàng lọc lần hai nhằm tìm ra kiểu tương tác có mức độ gắn tối ưu nhất. RDock thực hiện hai giai đoạn chính để tối ưu hóa về năng lượng tĩnh điện và năng lượng đề solvat hóa. Trong suốt hai giai đoạn tối ưu hóa năng lượng RDock tận dụng được lợi thế của CHARMm để loại bỏ những xung đột và tối ưu các tương tác tĩnh điện và tương tác có cực. Chỉ số RDock được tổng hợp từ năng lượng đề solvat hóa và năng lượng tĩnh điện. Phức hệ có chỉ số Rock cao nhất là trạng thái gần với kiểu tương tác tự nhiên nhất trong các phức hệ thu được.
34
Hình 11: Pose 546 (Model2_a7) với Rdock score cao nhất.
Các trình tự còn lại được tiến hành tương tự Model2_a7 nhằm tìm ra kiểu tương tác tối ưu nhất cho các kiểu tương tác giữa các chuỗi polypeptide đã thiết kế với độc tố. Sau quá trình Refine Docked Proteins (RDock), tương ứng với mỗi phức hệ ta thu được một kiểu tương tác với chỉ số RDock lớn nhất. 5 kiểu tương tác thu được là pose 112, pose 546, pose 1, pose 81, pose 319 lần lượt tương ứng với các mô hình peptide đã thiết kế từ Model1_a7 đến Model5_a7. Các pose này được sử dụng để tiến hành mô phỏng động học phân tử bằng chương trình Standard Dynamic Cascade. Kết quả của quá trình mô phỏng động học phân tử được tập hợp và so sánh nhằm tìm ra phức hệ có mức năng lượng nhỏ nhất, tương ứng với phức hệ có cấu trúc ổn định nhất.
Bảng 3: Kết quả Standard Dynamics Cascade
Name Forcefield Initial Potential Energy (kcal/mol) Total Energy (kcal/mol) Potential Energy (kcal/mol) Kinetic Energy (kcal/mol)
Pose 112_Model1_a7 CHARMm -201.53991 1196.57336 335.92924 860.64412
Pose 546_Model2_a7 CHARMm -134.18491 1127.26047 282.25970 845.00076
Pose 1 _Model3_a7 CHARMm -188.11698 1193.63415 306.62756 887.00659
Pose 81 _Model4_a7 CHARMm -169.86669 1195.70098 351.95257 843.74841
Pose 319_Model5_a7 CHARMm -44.23239 1234.20487 344.44492 889.75995
Kết quả mô phỏng động học phân tử “Standard Dynamics Cascade” cho thấy, phức hệ model2_a7 gắn với độc tố α – Cbtx là phức hệ có mức năng lượng tổng số nhỏ
35
nhất. Do đó, chuỗi polypeptide model2_a7 được lựa chọn để biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Những kết quả này được tính toán hoàn toàn dựa trên các thuật toán và được thực hiện hoàn toàn trên phần mềm. Trong khi cho đến nay, chưa một công cụ tính toán nào có thể đảm nhận tốt hoàn toàn chức năng mô hình hóa protein cũng như docking. Ngay cả đối với những chương trình docking tốt nhất hiện nay như: eHiTs, Gold, Dock... tỷ lệ thành công mới chỉ đạt gần 60% [40]. Hơn nữa, các hàm tính điểm trong docking hiện nay mới chỉ đạt nhiều nhất hai trong ba chỉ tiêu đánh giá hàm tính điểm đó là: khả năng phân biệt các loại liên kết ở vị trí gắn, khả năng dự đoán ái lực liên kết của các phối tử và khả năng sàng lọc từ một cơ sở dữ liệu lớn (đưa ra các hit) [25]. Vì vậy, kết quả thu được trên đây cần được tiến hành các kiểm tra và đánh giá thực nghiệm.