Áp dụng các điều kiện tinh chế được tiến hành ở qui mô phân tích, chúng tôi tính toán các thông số như tốc độ dòng, độ trộn, thời gian chạy sắc ký để áp dụng cho qui mô tinh chế dạng bán điều chế ở cột LC-18 của Supelcosil (25 cm x 10 mm x 10 m). Với qui mô này chúng tôi có thể đẩy lượng mẫu đưa lên cột từ 200 l (qui mô phân tích) lên 500 l hoặc 1000 l tùy thuộc vào độ cô đặc của protein ban đầu. Với chương trình và thời gian tương tự như trong qui mô phân tích, tuy nhiên tốc độ dòng được sử dụng là 5 ml/phút. Trong qui mô thí nghiệm này, chúng tôi đưa 1000 l mẫu lên cột bán điều chế để tinh chế lượng lớn với mục đích thu lại các đỉnh hấp thụ nhằm kiểm tra sự xuất hiện của polypeptide trong sắc đồ.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min -50 -25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 bar B.Conc.(Method) 280nm,4nm (1.00)
Hình 18: Sắc ký đồ tinh chế polypeptide bằng cột bán điều chế LC-18
Đỉnh hấp thụ tại thời điểm từ phút thứ 9 – phút thứ 10 được chúng tôi thu lại và điện di kiểm tra trên gel Tricine SDS-PAGE 16% để kiểm tra sự có mặt của polypeptide trong dịch tinh chế. Kết quả được thể hiện trên Hình 20.
Kết quả cho thấy, ở phân đoạn 2 là phân đoạn chứa đỉnh của polypeptide tinh chế được thôi ra ở phút thứ 9, do vậy có nồng độ protein là cao nhất. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bạc trên gel Tricine SDS-PAGE 16 % để kiểm tra sự xuất hiện của polypeptide trong các phân đoạn của đỉnh tinh chế, đồng thời kiểm tra độ sạch của các phân đoạn thu được. Trong sắc ký đồ chúng ta có thể nhìn thấy ngoài sự xuất hiện của đỉnh polypeptide tái tổ hợp còn có 2 đỉnh hấp thụ khác ở phút thứ 3.5 và 5.5 với độ hấp thụ tương đối cao. Chúng tôi đã tiến hành thu các đỉnh này và điện di kiểm tra, kết quả cho thấy đây chính là các thành phần
42
Hình 19: Polypeptide được tinh chế bằng HPLC. Đường chạy 1-5: polypeptide tinh chế bằng HPLC.
Đường chạy 6: thang protein chuẩn
muối như Guanidine và một số tạp chất khác đã được phân tách và loại bỏ trên cột. Kết quả này tương đối phù hợp với các tính toán lý thuyết về độ phân cực của các thành phần trong mẫu được đưa lên cột. Với polypeptide tái tổ hợp do có chứa nhiều (40%) các amino acid có tính không phân cực, vì vậy sẽ được giữ lại lâu hơn trên cột, các thành phần khác như muối, đệm, các protein khác có tính phân cực cao hơn sẽ bị đẩy ra ở phía trước, tạo điều kiện để phân tách triệt để các thành phần trong mẫu, nhằm thu được các phân đoạn chứa peptide với độ sạch tương đối cao, đạt điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo.