Các polypeptide tái tổ hợp được tinh chế trên hệ thống sắc ký HPLC sử dụng hệ dung môi A: 0.1% TFA; dung môi B: 60% Acetonitrile trong 0.1% TFA phù hợp cho việc phân tách các thành phần trong hỗn hợp polypeptide cùng với các protein tan của vật chủ biểu hiện. Sự phân tách của các hợp chất khác nhau dựa trên độ phân cực và các thuộc tính lý hóa, vì vậy các protein tan của vật chủ và các polypeptide sẽ được phân tách và thôi ra ở các thời điểm khác nhau của quá trình chạy sắc ký. Sử dụng bước sóng 260 nm và 280 nm để theo dõi đường chạy của sắc ký đồ trên phần mềm LC solution. Các đỉnh được phân tách rõ ràng và xuất hiện ở các thời điểm khác nhau của quá trình chạy đại diện cho các hợp chất khác nhau được phân tách trên cột. Các đỉnh này được thu lại để điện đi kiểm tra trên gel Tricine-SDS-PAGE 16%. Kết quả được thể hiện trên hình sau:
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 min -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 mAU 0.0 25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 bar B.Conc.(Method) 254nm,4nm (1.00)
Hình 17: Sắc ký đồ qui trình tinh chế polypeptide trên HPLC
Kết quả chạy sắc ký tinh chế polypeptide thể hiện trên sắc ký đồ với sự xuất hiện của các đỉnh hấp thụ theo thời gian thực khác nhau. Tại thời điểm 12,5 phút, một đỉnh có chiều cao xấp xỉ 600 mAU xuất hiện ở thời điểm nồng độ trộn của đệm B là 100%. Điều này chứng tỏ có sự xuất hiện của một protein đã được thôi ra ở cột. Để kiểm tra, chúng tôi tiến hành chạy nhiều lần để thu được lượng vừa đủ để điện di kiểm tra trên gel Tricine SDS-PAGE 16%. Kết quả khẳng định chính là các polypeptide mong muốn đã được thôi ra từ cột ở nồng độ đệm B là 100 %. Chúng tôi tiếp tục xác định điều kiện tinh chế để chạy trên cột bán điều chế LC-18 của
41
Supelcosil (25 cm x 10 mm x 10 m) nhằm mục đích thu lượng lớn polypeptide tái tổ hợp tinh sạch.