60 chuột BALB/c khoẻ mạnh, 8 đến 10 tuần tuổi nuôi tại khu nuôi động vật của Viện Công nghệ Sinh học, được chia làm 14 lô (6 chuột/lô), 5 lô thí nghiệm chuột nhắt trắng dòng BALB/c được tiêm α-cobratoxin ở các nồng độ 0.4 mg/kgP, 0.5 mg/kgP, 0.6 mg/kgP, 0.7 mg/kgP và 0.8 mg/kgP và 7 lô khác được tiêm polypeptide ở các liều 3, 6, 9, 12, 15, 20, 50 mg/kg thể trọng (kgP) vào bắp đùi một lần duy nhất. Sau khi tiêm các chất, chuột được nuôi dưỡng bình thường (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lô thí nghiệm và tính giá trị LD50 theo công thức sau (Abraham, 1978; Turner, 1965).
Trong đó: LD50: liều chết 50% động vật thí nghiệm
n: số động vật sử dụng trong từng lô thí nghiệm k: số lô động vật
mi: số động vật chết đếm theo từng lô trong 72 giờ d: khoảng cách giữa các mức liều
28 Xi: liều cao nhất
zi : hệ số phụ tính từ công thức zi = 2k-1-2i (i=1,2,3,...k-1) Sai số SE (Standard error) được tính theo công thức:
29
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thiết kế polypeptide ức chế nọc rắn bằng mô phỏng
3.1.1. Kết quả mô hình hóa cấu trúc polypeptide ức chế nọc rắn
Trình tự chuỗi polypeptide được chúng tôi lựa chọn gồm 30 amino acid được mã hóa trong tệp dữ liệu có tên modelX_a7.bsml (X = 1÷5). Mô hình được xây dựng trên cơ sở cấu trúc của các phân tử khuôn với PDB ID là: 1KC4, 1L4W, 2BG9, 2QC1 với trình tự tương đồng với trình tự peptide thiết kế từ 80% trở lên. Cấu trúc của các phân tử khuôn được tiến hành sắp chuỗi (alignment) trước khi được sử dụng làm khuôn cho chương trình “Build Homology Models”.
Hình 6: Kết quả Alignment Structure Modeler của 4 cấu trúc khuôn
Kết quả sắp chuỗi cho thấy, độ lệch chuẩn (RMSD) giữa các khung cacbon của các phân tử này đều nhỏ hơn 5 Aº, khoảng cách này phù hợp cho việc sử dụng đồng thời bốn phân tử này làm khuôn để mô hình hóa cấu trúc không gian của các chuỗi polypeptide. Kết quả “Build Homology Models” trên hình 7 cho thấy chuỗi polypeptide được mô hình hóa (màu vàng) có cấu trúc chồng khít (superimposition) với cấu trúc của phiến β của thụ thể α7. Như vậy cấu trúc của chuỗi polypeptide được tạo thành về cơ bản là tương tự như cấu trúc của thụ thể α7, đúng với tính toán lý thuyết ban đầu.
30
Hình 7: Cấu trúc peptide mô hình so sánh với các cấu trúc khuôn
3.1.2. Kết quả đánh giá chất lượng của mô hình cấu trúc chuỗi polypeptide
Kết quả thu được từ Build Homology Models được tiếp tục chạy Verify Protein (Modeler) để chọn ra một cấu trúc tốt nhất từ tập hợp các cấu trúc có chung trình tự đã thu được ở trên. Các sản phẩm này được đánh giá dựa trên hàng loạt các thông số về giá trị Verify, mức năng lượng tối thiểu, PDF, Total Energy, PDF Physical Energy, DOPE mà tại đó mô hình có giá trị PDF và DOPE nhỏ nhất sẽ là mô hình tối ưu nhất
.
Hình 8: So sánh giá trị DOPE giữa các mô hình cấu trúc peptide khác nhau Tuy nhiên, kết quả của quá trình Verify Protein (Modeler) cũng cho thấy, hầu hết các chuỗi polypeptide đều không đạt giá trị “verify score” trong giới hạn cho phép. Điều này được lý giải là do các chuỗi polypeptide này đều quá ngắn (30 amino acid), do đó sự phân bố của các amino acid này không tuân theo qui luật thông thường, tạo nên các giá trị “verify score” thấp hơn so với giá trị kì vọng. Để khắc phục vấn đề này, chúng tôi tiến hành chạy “Standard Dynamics Cascade” nhằm tối
31
ưu hóa cấu trúc của các mô hình trước khi tiến hành tạo phức hệ với phân tử độc tố thần kinh α – Cbtx. Chương trình này sẽ trải qua hai giai đoạn tối ưu hóa mức năng lượng (Minimization), tiếp đến là quá trình làm nóng cấu trúc (Heating) và sau cùng là hoàn thiện tạo mô hình (Production). Chương trình này được thiết kế nhằm mục đích đưa hệ thống (chuỗi polypeptide) về trạng thái ổn định nhất, với mức năng lượng nhỏ nhất có thể trong mối tương quan về trình tự các amino acid trong điều kiện môi trường xác định. Kết quả chạy “Standard Dynamics Cascade” được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 2: So sánh mức năng lượng của các phức hệ từ chương trình “Standard Dynamics Cascade”
Name Forcefield Initial Potential Energy (kcal/mol) Total Energy (kcal/mol) Potential Energy (kcal/mol) Kinetic Energy (kcal/mol) Model1_a7 CHARMm -465.71701 -651.98169 -1126.94648 474.96479 Model2_a7 CHARMm 546.16588 -844.37176 -1332.90389 488.53213 Model3_a7 CHARMm 148.42006 -734.60244 -1178.96152 444.35908 Model4_a7 CHARMm 154.79542 -623.96386 -1081.35229 457.38843 Model5_a7 CHARMm 42.14103 -788.13033 -1248.47350 460.34317
Các số liệu trong bảng thông số trên cho thấy, Model2_a7 có mức năng lượng tổng số nhỏ nhất, nghĩa là Model2_a7 bền vững hơn các Model còn lại. Tuy vậy, chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá chất lượng của polypeptide đã được thiết kế là khả năng của nó cạnh tranh với α7 - nAChR để gắn với độc tố thần kinh α – Cbtx với mục đích bất hoạt α – Cbtx, nên bước tiếp theo trong quá trình thiết kế sẽ là mô phỏng tương tác giữa chuỗi polypeptide với độc tố thần kinh α – Cbtx.
3.1.3 Kết quả tạo phức hệ chuỗi polypeptide với độc tố thần kinh α – Cbtx
Phân tử protein cấu trúc độc tố α – Cbtx (PDB ID: 1YI5) được sử dụng đóng vai trò như một thụ thể (receptor), mỗi phân tử polypeptide đã được xây dựng cấu trúc thành công đóng vai trò như một cơ chất gắn (ligand) để tiến hành quá trình xây dựng cấu trúc phức hệ polypeptide – độc tố thần kinh α – Cbtx bằng chương trình Dock Protein (ZDock). Các thông số như “Receptor blocked residues”, “Ligand blocked residues”, “Receptor & Ligand binding residues” được lựa chọn trong “Filter
32
pose” để tăng cường khả năng sàng lọc. Thông số ZRANK được chọn là “True” để chương trình tự động xếp hạng các kiểu tương tác (các pose) trong tập hợp các kiểu tương tác tạo thành. Quá trình này được tiến hành tương tự đối với 05 mô hình cấu trúc chuỗi polypeptide đã được xây dựng thành công ở bước trên với phân tử độc tố 1YI5 để cho ra một tập hợp các kiểu tương tác cho từng trường hợp riêng rẽ.
Hình 9: Các pose trong kết quả mô phỏng phức hệ Model2_a7 – α – Cbtx Kết quả mô phỏng tương tác của Model2_a7 với độc tố α – Cbtx thu được 559 các kiểu tương tác khác nhau được phân chia vào các nhóm khác nhau (clusters). Mỗi kiểu tương tác đại diện cho một trường hợp liên kết giữa polypeptide và độc tố thần kinh α – Cbtx . Vị trí của các amino acid trong vùng gắn (binding site) được định nghĩa nhằm mục đích giới hạn các trường hợp liên kết. ZDOCK được lập trình để nhận dạng một cấu trúc là receptor – cấu trúc này sẽ được giữ cố định, một cấu trúc là ligand – cấu trúc này sẽ được xoay quanh receptor tại vị trí liên kết, đồng thời mức năng lượng của mỗi trạng thái của phức hệ được tính toán và lưu lại. Vì vậy thụ thể và chất gắn có thể liên kết với nhau ở rất nhiều vị trí khác nhau xung quanh vùng biding site và trong chương trình ZDock các trạng thái liên kết sẽ được sắp xếp theo thứ tự giảm dần của giá trị “ZDock score”, kiểu tương tác đầu tiên trong danh sách – trạng thái liên kết có “ZDock score” cao nhất là kiểu tương tác tối ưu nhất. Trên hình 9 là hình ảnh của pose 1 với “ZDock score” cao nhất là 33,55.
33
Hình 10: Pose 1 (Model2_a7) với ZDock Score cao nhất
Từ tập hợp số lượng lớn các kiểu tương tác được tạo thành, chúng tôi tiến hành chạy Process Pose (ZDock) nhằm tìm ra một tập hợp các kiểu tương tác có mức độ gắn tốt nhất cho phức hệ polypeptide và độc tố α – Cbtx. Các thông số được thiết lập cho quá trình này gồm có giá trị “RMSD cutoff”, “Ligand/receptor binding site residues” trong bảng thông số “Paramters”. Quá trình này cho phép thu được một tập hợp các kiểu tương tác thỏa mãn các điều kiện sàng lọc và loại bỏ các kiểu tương tác không đạt điều kiện. Điều này giúp chúng ta giảm bớt thời gian thao tác với các kiểu tương tác không đủ điều kiện và tập trung vào phân tích các kiểu tương tác thỏa mãn điều kiện nhằm tìm ra kiểu tương tác có mức độ gắn tối ưu nhất. Áp dụng thuật toán RDock [15] trong chương trình “Refine Docked Proteins (RDock)” các kiểu tương tác được lựa chọn sau khi chạy “Process Poses (ZDock)” được sử dụng làm dữ liệu nguồn để tiến hành sàng lọc lần hai nhằm tìm ra kiểu tương tác có mức độ gắn tối ưu nhất. RDock thực hiện hai giai đoạn chính để tối ưu hóa về năng lượng tĩnh điện và năng lượng đề solvat hóa. Trong suốt hai giai đoạn tối ưu hóa năng lượng RDock tận dụng được lợi thế của CHARMm để loại bỏ những xung đột và tối ưu các tương tác tĩnh điện và tương tác có cực. Chỉ số RDock được tổng hợp từ năng lượng đề solvat hóa và năng lượng tĩnh điện. Phức hệ có chỉ số Rock cao nhất là trạng thái gần với kiểu tương tác tự nhiên nhất trong các phức hệ thu được. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
34
Hình 11: Pose 546 (Model2_a7) với Rdock score cao nhất.
Các trình tự còn lại được tiến hành tương tự Model2_a7 nhằm tìm ra kiểu tương tác tối ưu nhất cho các kiểu tương tác giữa các chuỗi polypeptide đã thiết kế với độc tố. Sau quá trình Refine Docked Proteins (RDock), tương ứng với mỗi phức hệ ta thu được một kiểu tương tác với chỉ số RDock lớn nhất. 5 kiểu tương tác thu được là pose 112, pose 546, pose 1, pose 81, pose 319 lần lượt tương ứng với các mô hình peptide đã thiết kế từ Model1_a7 đến Model5_a7. Các pose này được sử dụng để tiến hành mô phỏng động học phân tử bằng chương trình Standard Dynamic Cascade. Kết quả của quá trình mô phỏng động học phân tử được tập hợp và so sánh nhằm tìm ra phức hệ có mức năng lượng nhỏ nhất, tương ứng với phức hệ có cấu trúc ổn định nhất.
Bảng 3: Kết quả Standard Dynamics Cascade
Name Forcefield Initial Potential Energy (kcal/mol) Total Energy (kcal/mol) Potential Energy (kcal/mol) Kinetic Energy (kcal/mol)
Pose 112_Model1_a7 CHARMm -201.53991 1196.57336 335.92924 860.64412
Pose 546_Model2_a7 CHARMm -134.18491 1127.26047 282.25970 845.00076
Pose 1 _Model3_a7 CHARMm -188.11698 1193.63415 306.62756 887.00659
Pose 81 _Model4_a7 CHARMm -169.86669 1195.70098 351.95257 843.74841
Pose 319_Model5_a7 CHARMm -44.23239 1234.20487 344.44492 889.75995
Kết quả mô phỏng động học phân tử “Standard Dynamics Cascade” cho thấy, phức hệ model2_a7 gắn với độc tố α – Cbtx là phức hệ có mức năng lượng tổng số nhỏ
35
nhất. Do đó, chuỗi polypeptide model2_a7 được lựa chọn để biểu hiện và nghiên cứu hoạt tính sinh học trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Những kết quả này được tính toán hoàn toàn dựa trên các thuật toán và được thực hiện hoàn toàn trên phần mềm. Trong khi cho đến nay, chưa một công cụ tính toán nào có thể đảm nhận tốt hoàn toàn chức năng mô hình hóa protein cũng như docking. Ngay cả đối với những chương trình docking tốt nhất hiện nay như: eHiTs, Gold, Dock... tỷ lệ thành công mới chỉ đạt gần 60% [40]. Hơn nữa, các hàm tính điểm trong docking hiện nay mới chỉ đạt nhiều nhất hai trong ba chỉ tiêu đánh giá hàm tính điểm đó là: khả năng phân biệt các loại liên kết ở vị trí gắn, khả năng dự đoán ái lực liên kết của các phối tử và khả năng sàng lọc từ một cơ sở dữ liệu lớn (đưa ra các hit) [25]. Vì vậy, kết quả thu được trên đây cần được tiến hành các kiểm tra và đánh giá thực nghiệm.
3.2. Biểu hiện và tinh chế các đoạn polypeptide
3.2.1. Tổng hợp các đoạn oligonucleotide bằng PCR
Các phản ứng được bổ sung thành phần như đã mô tả trong phần phương pháp, sau đó sử dụng chương trình nhiệt trên máy MJ Research (USA) để tổng hợp các đoạn oligonucleotide mong muốn. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2 % với kết quả một băng có kích thước đúng với tính toán lý thuyết. Điều này khẳng định đoạn mồi được thiết kế là phù hợp và đặc hiệu cho ra một sản phẩm có nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo cho các thao tác chèn và nối ghép gen sau này. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR được thể hiện trong hình 13:
Hình 12: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%. Đường chạy 2-6: sản phẩm PCR các mẫu oligonucleotide. Đường chạy 1: Thang DNA chuẩn 100 bp (fermentas).
1 2 3 4 5 6 Oligonucleotide ~ 100 bp 1000 700 300 100 200 500 bp
36
3.2.2. Tách dòng các đoạn oligonucleotide trong vector pCR2.1
Sau khi đã thu được sản phẩm PCR có độ tinh sạch cao, chúng tôi đã kiểm tra nồng độ của sản phẩm để có thể đưa vào phản ứng nối ghép. Tỷ lệ 3 mol sản phẩm PCR được lai với 1 mol vector là tỷ lệ phù hợp nhất cho phản ứng nối ghép. Trên trình tự của vector pCR2.1 đã có sẵn một nucleotit T ở đầu 5’ tạo thành dạng đầu dính liên kết bổ sung với đầu A ở vị trí 3’ trên sản phẩm PCR. Do đó, với nồng độ thích hợp và điều kiện phản ứng hợp lý, sản phẩm PCR sẽ được nối ghép với vector pCR2.1 tạo vector tách dòng mang gen tái tổ hợp pCR_peptide_model.
Sau khi nối ghép tạo plasmid hoàn chỉnh mang gen tái tổ hợp, các plasmid này do đã đóng vòng nên có xác suất biến nạp vào tế bào cao hơn. Tuy nhiên, sau 3 giờ tiến hành phản ứng nối ghép, sản phẩm của phản ứng có thể bao gồm các dạng sợi mạch thẳng của DNA vector chưa đóng vòng, các đoạn DNA không gắn được vào vector, dạng vòng của plasmid tái tổ hợp… và vẫn có những trường hợp các đoạn DNA mạch thẳng có thể được đưa vào với tần số không cao. Do vậy, cần có những phương pháp sàng lọc thể biến nạp một cách hiệu quả. Chúng tôi sử dụng phương pháp biến nạp sốc nhiệt và sàng lọc khuẩn lạc bằng cơ chất X-gal để thu được các khuẩn lạc mang gen ngoại lai.
3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET_peptide_model
Sau khi tiến hành nuôi cấy dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp trong môi trường LB ở điều kiện nhiệt độ 370C, lắc 200 vòng/phút qua đêm, tế bào thu được sẽ được xử lý để tách chiết thu plasmid pCR_peptide_model. Sau đó, plasmid này được cắt bằng hai enzym là XhoI và NcoI, sản phẩm cắt được kiểm tra trên gel agarose,
theo dự tính sẽ xuất hiện hai đoạn băng là 0,1 kb và 3,9 kb. Với việc sử dụng hai enzym này thì trình tự của đoạn gen vẫn luôn đảm bảo đúng khung đọc mở, do đó mà không ảnh hưởng đến việc dịch mã tạo protein sau này.
Đoạn oligonucleotide có kích thước 0.1 kb giới hạn bởi NcoI và XhoI
được thu lại bằng cột tinh sạch QiaGen. Bằng việc xử lý đồng thời hai enzym hạn chế có trình tự cắt khác nhau và có khả năng tạo đầu dính, chúng tôi đã tạo ra được đoạn gen có hai đầu dính có trình tự không bổ sung, do vậy tránh được khả năng tự đóng vòng và đoạn gen sẽ được đưa vào xuôi chiều khung đọc mở.
37
Hình 13: Kết quả điện di kiểm tra (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sản phẩm cắt pCR_peptide_model bằng NcoI và XhoI. Đường chạy 1, 2, 3, 5, 6: pCR_peptide_model.
Đường chạy 4: Thang DNA chuẩn 100 bp (fermentas).
Đoạn gen sau đó được đưa vào vector pET22b(+) đã được mở vòng bằng 2 enzyme hạn chế tương tự. Sản phẩm của phản ứng nối ghép được biến nạp vào tế bào
E. coli DH5α và được trải trên đĩa thạch có bổ sung Ampicilline phục vụ cho mục
đích sàng lọc. Các khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch có bổ sung Ampicilline được lựa chọn và cấy chuyển vào môi trường LB lỏng để nuôi cấy qua đêm ở điều kiện nhiệt độ 370C. Tế bào trong dịch nuôi cấy được thu lại và được sử dụng cho qui trình tách chiết thu plasmid tái tổ hợp phục vụ cho các bước kiểm tra. Plasmid tái tổ hợp có tên là pET_peptide_model được tách chiết và kiểm tra bằng kỹ thuật cắt bằng enzyme giới hạn (sử dụng cặp enzyme: NcoI và XhoI) và xác định trình tự (trên máy ABI PRISM 3100 của viện Công nghệ sinh học) nhằm khẳng định đoạn gen chèn vào là đoạn gen mong muốn. Các khuẩn lạc đạt tiêu chuẩn sẽ được sử dụng cho bước