Phân Lập Vi Khuẩn Lactic Tham Gia Vào Quá Trình Chế Biến Mắm Cá Sặc Lên Men Chua Xương Mềm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - - VÕ THỊ BÍCH TRÂN MSSV: LT08207 PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN MẮM CÁ SẶC LÊN MEN CHUA XƯƠNG MỀM LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Cán hướng dẫn Ths LÊ MỸ HỒNG Cần Thơ, tháng 5/2010 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN -~0~ - Chân thành cảm ơn Lê Mỹ Hồng tận tình hướng dẫn em suốt thời gian thực luận văn tốt nghiệp Chân thành cảm ơn Thầy, Cô môn Công nghệ Thực phẩm- Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Trường Đại học Cần Thơ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập Cảm ơn Thầy, Cô, Anh, Chị phụ trách phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ Thực phẩm- Khoa Nông nghiệp Sinh học Ứng dụng Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện tốt cho em suốt trình làm luận văn Cảm ơn bạn lớp Công nghệ thực phẩm K34 Liên thông giúp đỡ, động viên suốt trình thực luận văn Thành thật cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2010 Sinh viên thực Võ Thị Bích Trân Bộ mơn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng i Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ TĨM LƯỢC Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống loại sản phẩm lên men phổ biến dân tộc giới Mắm sản phẩm lên men truyền thống lâu đời Từ lâu vấn đề an toàn thực phẩm ln đặt hàng đầu, mà vi sinh vật quan tâm nhiều Để biết rõ tồn phát triển vi sinh vật có lợi vi sinh vật tạp suốt trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm chủ động nguồn vi sinh vật có lợi sẵn có Từ đó, việc “Phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm” thực Trên sở mục tiêu nghiên cứu xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn Lactic phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến Kết thu qua trình nghiên cứu cho thấy tổng số vi khuẩn hiếu khí tổng số vi khuẩn Lactic biến đổi suốt trình chế biến sản phẩm Vi sinh vật phát triển theo chiều hướng có lợi sản phẩm cuối vi khuẩn Lactic có lợi tăng cao ổn định cịn vi khuẩn tạp giảm nhiều Có chủng vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến Chủng thứ có đặc điểm khuẩn lạc hình trịn, kích thước nhỏ li ti, bóng, màu trắng đục, lài đặc điểm tế bào hình que ngắn Chủng thứ hai có đặc điểm khuẩn lạc khác chủng thứ hình trịn, kích thước nhỏ, bóng, màu vàng kem, lồi đặc điểm tế bào hình que dài Hai chủng có đặc điểm hình dạng, kích thước vi khuẩn phù hợp với mô tả vi khuẩn Lactic; gram dương cho phản ứng âm tính với phép thử catalase phép thử oxidase Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM LƯỢC - ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH HÌNH - v DANH SÁCH BẢNG - vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU -1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU -2 2.1 Giới thiệu nguyên liệu cá sặc 2.1.1 Cá sặc bướm -2 2.1.2 Một số tính chất cá -3 2.2 Công nghệ chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm 2.2.1 Tổng quan kỹ thuật chế biến sản phẩm lên men 2.2.2 Một số điểm cần lưu ý chế biến sản phẩm lên men 2.2.3 Qui trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng 2.3 Sơ lược vi khuẩn lactic 2.3.1 Đặc điểm hình thái 2.3.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa -10 2.4 Phân lập vi sinh vật -11 2.4.1 Khái niệm 11 2.4.2 Nguyên tắc -11 2.4.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật khiết 12 2.5 Các phép thử sinh hóa để nhận diện dịng vi khuẩn Lactic 14 2.5.1 Nhuộm gram -14 2.5.2 Phép thử oxidase 14 2.5.3 Phép thử catalase 15 2.6 Tiêu chuẩn để xác định vi khuẩn Lactic -15 2.7 Các kết nghiên cứu có liên quan -15 2.7.1 Các kết nghiên cứu nước -15 2.7.2 Các kết nghiên cứu nước 16 Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng iii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -17 3.1 Phương tiện nghiên cứu 17 3.1.1 Thời gian – Địa điểm 17 3.1.2 Nguyên liệu 17 3.1.3 Hóa chất 17 3.1.4 Dụng cụ, thiết bị -17 3.2 Phương pháp nghiên cứu 18 3.2.1 Phương pháp thí nhiệm -18 3.2.2 Phương pháp phân tích 18 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí tổng số vi khuẩn lactic cơng đoạn qui trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm -19 3.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn Lactic công đoạn ủ thời điểm 5, 10, 15, 20 ngày ủ -20 CHƯƠNG KẾT QUẢ THẢO LUẬN -21 4.1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn Lactic cơng đoạn qui trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm -21 4.2 Kết phân lập vi khuẩn Lactic diện trình lên men 23 4.2.1 Quan sát hình thái -23 4.2.2 Nhận diện dòng vi khuẩn Lactic 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 29 5.1 Kết luận -29 5.2 Đề nghị -29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng iv Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cá sặc Hình 2.2 Giống Streptococcus -7 Hình 2.3 Giống Leuconostoc Hình 2.4 Giống Lactobacillus -9 Hình 2.5 Giống Pediococcus Hình 2.6 Kỹ thuật hộp ria 13 Hình 2.7 Kỹ thuật hộp trải -13 Hình 4.8 Khuẩn lạc chưa rịng chủng thứ 24 Hình 4.9 Khuẩn lạc rịng chủng thứ 24 Hình 4.10 Khuẩn lạc chưa ròng chủng thứ hai 24 Hình 4.11 Khuẩn lạc ròng chủng thứ hai 24 Hình 4.12 Chủng thứ nhuộm gram (ngày ủ thứ 5) 27 Hình 4.13 Chủng thứ hai nhuộm gram (ngày ủ thứ 5) 27 Hình 4.14 Chủng thứ nhuộm gram (ngày ủ thứ 10) -27 Hình 4.15 Chủng thứ hai nhuộm gram (ngày ủ thứ 10) 27 Hình 4.16 Chủng thứ nhuộm gram (ngày ủ thứ 15) -27 Hình 4.17 Chủng thứ hait nhuộm gram (ngày ủ thứ 15) -27 Hình 4.18 Chủng thứ nhuộm gram ( ngày ủ thứ 20) -28 Hình 4.19 Chủng thứ hai nhuộm gram (ngày ủ thứ 20) 28 Hình 4.20 Phép thử catalase âm tính -28 Hình 4.21 Phép thử oxidase âm tính 28 Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng v Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thông - 2010 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Tổng số vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn Lactic diện công đoạn chế biến 21 Bảng 4.2: Hình dạng khuẩn lạc quan sát mắt thường 23 Bảng 4.3: Kích thước hình dạng tế bào vi khuẩn quan sát kình hiển vi quang học -25 Bảng 4.4: Kết nhuộm gram phép thử sinh hóa -26 Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng vi Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống loại sản phẩm lên men phổ biến dân tộc giới Do hệ dân tộc, có hiểu biết phát huy truyền thống sản phẩm không điều cần thiết mà cịn trách nhiệm việc gìn giữ phát huy truyền thống lâu đời quê hương, dân tộc Khơng nằm ngồi đặc điểm ấy, mắm sản phẩm lên men truyền thống lâu đời đặc trưng quốc gia nằm khu vực sơng Mekong Vì vậy, hầu hết người dân nơi xem sản phẩm hương vị quê hương, nên dù nơi đâu nhớ da diết mùi vị khơng thể thiếu diện bữa ăn gia đình Tuy nhiên, hầu hết sản phẩm mắm lên men từ cá sản phẩm lên men từ loại cá nhỏ cá sặc, cá trèn,…các loại mắm thường dùng chủ yếu để nấu lấy hương vị nấu lẩu, kho, chưng, dùng phổ biến để “ăn sống” (không qua nấu) thịt ít, xương nhiều cứng Hiện nay, “mắm chua cá sặc” (tên gọi dân gian) độc đáo, cịn nơi biết đến (chủ yếu phạm vi gia đình cịn giữ bí chế biến, chưa thấy xuất nhiều thị trường) “mắm chua cá sặc” sản phẩm cá giữ hình dạng nguyên vẹn xương mềm tạo cảm giác khơng có xương ăn; mùi vị thơm ngon khác lạ, hài hòa sản phẩm mắm thông thường khác, nên không cần phối chế lại trước ăn thích hợp dùng “ăn sống” Tuy nhiên, bí làm sản phẩm dần thất truyền mang tính chất bí truyền gia đình Đồng thời, nhiều yếu tố tác động lên sản phẩm chưa nghiên cứu xác định rõ ràng dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định Từ lâu vấn đề an tồn thực phẩm ln đặt hàng đầu, mà vi sinh vật ln quan tâm nhiều Để biết rõ tồn phát triển vi sinh vật có lợi vi sinh vật tạp suốt trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm chủ động nguồn vi sinh vật có lợi sẵn có Từ đó, việc “Phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm” thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Từ điều trình bày trên, mục tiêu nghiên cứu đề tài xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, tổng số vi khuẩn Lactic phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nguyên liệu cá sặc 2.1.1 Cá sặc bướm: Tên Việt Nam: cá sặc bướm Tên Latin: Trichogaster trichopterus (Pallas, 1770) Tên tiếng Anh: three-dot gourami (con mắt tính chấm) Họ: tai tượng Osphronemidae, phân họ Luciocephalinae (tên cũ Trichogastrinae) Bộ: Perciformes Lớp: cá vây tia Actinopterygii (ray-finned fishes) Hình 2.1 cá sặc Mơ tả: Kích thước tối đa 15 cm Gai vây lưng: - 8; tia vây lưng: - 10; gai vây hậu môn: – 12; tia vây hậu môn: 30 – 38 Màu xám, lưng có nhiều chấm sậm màu, nắp mang họng có màu vàng nhạt, phần vây ngực màu nâu, bụng hanh vàng Miệng nhỏ xéo, hàm thẳng đứng co dãn, hàm trề Vảy có kích thước vừa phải không Đường bên cong, không Đi góc cạnh phân thùy Có chấm đen thân gốc Thân có nhiều sọc xiên hẹp không Sinh học: sống miền nhiệt đới, môi trường nước ngọt, tầng giữa; độ pH: 6,0 – 8,0; độ cứng dH: 5-19; nhiệt độ: 22 – 28°C Thức ăn gồm sinh vật phù du, giáp xác ấu trùng côn trùng Nơi sống sinh thái: cư trú nơi vùng trũng, bụi cỏ, đầm lầy kênh đào, vùng nước cạn chảy chậm hay tĩnh nơi có thật nhiều thực vật thủy sinh Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Di chuyển theo mùa từ sông, hồ vào vùng ngập lũ trung hạ lưu sông Mekong rút nơi cư trú mùa khô đến Phân bố: Việt Nam: vùng đồng sông Cửu Long Thế giới: lưu vực sông Mekong gồm Thái Lan, Lào, Campuchia Miến Điện; Indonesia, Malaysia Trung Quốc Giá trị sử dụng: Ít quan trọng ngư nghiệp chăn nuôi Thường ướp muối phơi khơ để trữ làm thực phẩm Lồi cá phổ biến lãnh vực cá cảnh, dòng cá cảnh cá sặc cẩm thạch (marble gourami) hay cẩm thạch vàng (golden gourami) xuất phát từ lồi Tình trạng: khơng nằm danh sách loài cần phải bảo vệ Đề nghị biện pháp bảo vệ: Tài liệu dẫn: www.fishbase.org 2.1.2 Một số tính chất cá * Thành phần tính chất xương cá Muối vô xương cứng cá chủ yếu Ca3(PO4)2, ngồi cịn loại muối kép tồn dạng Ca3(PO4)2, CaX (X Fe, Cl, (OH)2, CO3,…) Ngoài phosphate calci cịn có cacbonate calci lượng hợp chất Mg So với xương động vật cạn xương cá có nhiều phosphate calci, có cacbonate calci Cịn xương động vật cạn ngược lại, xương cá nguồn phân bón tốt Độ cứng xương tỉ lệ thuận với lượng acid phosphoric calci phosphate calci Tỉ lệ nghịch với lượng nitơ, protid thô Tỉ lệ hàm lượng acid phosphoric với calci lồi cá khơng khác * Tính chất protease động vật thủy sản Nhóm enzyme có tác dụng thủy phân protid, chúng có nhiều động vật thủy sản bao gồm: pepsin, trypsin, chymotrypsin…các enzyme có tính chất đặc hiệu rộng rãi, chúng không thủy phân liên kết peptid mà thủy phân liên kết este, liên kết amid xúc tác chuyển vị cho acid amin Tuy vậy, enzyme khác số khả tính chất tác dụng protid Trước cho men phân giải protid mơi trường acid trypsin Nhưng thực tế chúng tác dụng phạm vi môi trường acid yếu đến base yếu Vì vậy, muốn xác định enzyme phải làm nhiều thí nghiệm để tìm phạm vi pH tối thích Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Hình 4.18 chủng thứ nhuộm gram ( ngày ủ thứ 20) Trường Đại học Cần Thơ Hình 4.19 chủng thứ hai nhuộm gram (ngày ủ thứ 20) Hình 4.20 phép thử catalase âm tính Hình 4.21 phép thử oxidase âm tính Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng 28 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tổng số vi khuẩn hiếu khí tổng số vi khuẩn Lactic biến đổi suốt trình chế biến sản phẩm Vi sinh vật phát triển theo chiều hướng có lợi sản phẩm cuối vi khuẩn Lactic có lợi tăng cao ổn định vi khuẩn tạp giảm nhiều Vậy sản phẩm mắm cá sặc lên men chua xương mềm tương đối an tồn mặt vi sinh sản phẩm, chủ yếu vi khuẩn Lactic mà vi khuẩn Lactic vi sinh vật có lợi Q trình phân lập vi khuẩn Lactic cơng đoạn ủ ngày ủ thứ 5, 10, 15 20 ngày phân lập chủng vi khuẩn Chủng thứ có đặc điểm khuẩn lạc hình trịn, kích thước nhỏ li ti, bóng, màu trắng đục, lài đặc điểm tế bào hình que ngắn Chủng thứ hai có đặc điểm khuẩn lạc khác chủng thứ hình trịn, kích thước nhỏ, bóng, màu vàng kem, lồi đặc điểm tế bào hình que dài Hai chủng có đặc điểm hình dạng, kích thước vi khuẩn phù hợp với mơ tả vi khuẩn Lactic; gram dương cho phản ứng âm tính với phép thử catalase phép thử oxidase phù hợp với tiêu chuẩn xác định vi khuẩn Lactic Bộ Y Tế Vậy sơ kết luận có chủng vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến 5.2 Đề nghị Từ kết thu nhận đề nghị nghiên cứu sau có điều kiện tiến hành kiểm tra kỹ thuật sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) để phân lập chủng vi khuẩn Lactic phân lập Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng 29 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Quyết định số 08/2006/QĐ-BYT Bộ Y Tế Thường quy kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn Lactic thực phẩm TCVN 5165- 90 Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Biền văn Minh Cách phân lập vi khuẩn dạy thực hành sinh học trường THPT Đỗ Thị Tuyết Nhung 2009 Đề cương nghiên cứu sinh Đại học Cần Thơ 5.Lê Văn Việt Mẫn Lại Mai Hương 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm NXB Giáo dục Lê Xuân Phương Thí nghiệm vi sinh vật học NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng Nhuộm Gram phương pháp Hucker cải tiến NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Bá Mão.1962 Ngư loại phân loại học NXB Nông Thôn Hà Nội Nguyễn Đức Lượng 2006 Thí nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 10 Tạp chí khoa học Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn Lactic phân lập địa bàn thành phố Hà Nội 11.Trần Thanh Thủy 1998 Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học NXB Giáo dục 12.http://www.fishbase.org Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng 30 Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC A Các phương pháp phân tích Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Sử dụng kỹ thuật đỗ đĩa, đếm khuẩn lạc mơi trường thạch sau ủ hiếu khí nhiệt độ 30 ± 10C thời gian từ 48 đến 72 Số lượng vi khuẩn 1g 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm tính từ số khuẩn lạc đếm từ đĩa nuôi cấy theo đậm độ pha lỗng 1.1 Hố chất Bảng1: Nước pha loãng Thành phần Lượng Pepton 1g NaCl 8,5g Nước 1000ml Đun sơi để hịa tan chất Để nguội đến 30 ± 50C Điều chỉnh pH dung dịch NaOH 0,1N cho sau tiệt trùng pH = 7,0 ± 0,2 Rót vào erlen 90ml, 9ml vào ống nghiệm Thanh trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 1210C/15 phút Môi trường không dùng ngay, cần bảo quản nơi khô ráo, bóng tối nhiệt độ từ 00C đến 50C không 30ngày Bảng 2: Môi trường thạch Thành phần Lượng Trypton 5g Cao men 2,5g Glucoza 1g Thạch 15-20g Nước cất 1000ml Đun nhỏ lửa, quấy để hịa tan chất đến sơi Để nguội mơi trường đến 55 ± 50C, điều chỉnh pH cho sau tiệt trùng pH = 7,0±0,2 Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng vii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Rót vào bình thuỷ tinh lượng mơi trường khơng q ½ dung tích bình Thanh trùng nồi hấp áp lực nhiệt độ 1210C/15 phút Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội đến 45 ± 10C Nếu chưa sử dụng cần bảo quản nơi khơ ráo, bóng tối nhiệt độ từ 00C đến 50C khơng 30ngày Trước nuôi cấy đun cho môi trường nóng chảy để nguội đến 45 ± 10C Ở ta thay môi trường Plate Count Agar (chi tiết kèm theo phụ lục 1) 1.2 Lấy mẫu chuẩn bị mẫu Lượng mẫu cân tối thiểu để pha lỗng khơng 1ml sản phẩm lỏng 10 ± 0,1g sản phẩm khác 1.3 Các bước ni cấy 1.3.1 Pha lỗng mẫu Pha lỗng mẫu có đậm độ pha loãng cần thiết đủ đếm số khuẩn lạc đĩa theo dự tính 1.3.2 Đổ đĩa Đối với mẫu kiểm nghiệm phải ni cấy đậm độ, đậm độ dùng đĩa petri pipet vô khuẩn riêng (ở dùng pipet piston nên ta thay đầu tuýp riêng cho đậm độ) Lấy 1ml sản phẩm (lỏng) dung dịch pha loãng đậm độ khác cho vào đĩa petri Rót vào đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đảo dung dịch mẫu môi trường cách lắc sang phải sang trái chiều lần Để đĩa thạch đông tự nhiên mặt phẳng ngang Thời gian từ bắt đầu pha lỗng mẫu đến rót mơi trường khơng 30 phút Nếu dự đoán sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan mặt thạch sau mơi trường đơng đổ tiếp 4ml thạch màng lên mặt 1.3.3 Ủ ấm Khi thạch đông, lật sấp đĩa petri để vào tủ ấm nhiệt độ 30 ± 10C từ đến ngày Sau ngày tính kết sơ cách đếm khuẩn lạc mọc đĩa ni cấy, sau ngày tính kết thức Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng viii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 1.4 Tính kết Chọn tất đĩa có khơng q 300 khuẩn lạc để tính kết Sự phân bố khuẩn lạc đĩa ni cấy phải hợp lý: độ pha lỗng cao số khuẩn lạc Nếu kết không hợp lý, phải tiến hành lại bước ni cấy Tính kết sau: 1.4.1 Chọn dĩa có từ 15 đến 300 khuẩn lạc đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp Nếu chênh lệch giá trị đậm độ nhỏ lần Tính số (N) khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí cho 1g 1ml sản phẩm cách tính C N= (n1 + 0,1.n2) x d trung bình cộng tổng số khuẩn lạc đĩa theo công thức sau: C : Số khuẩn lạc đếm đĩa chọn n1, n2 : số đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp chọn thứ 1, thứ d : Hệ số pha loãng đậm độ pha loãng chọn thứ Làm trịn số kết có được, giữ lại số có nghĩa Biểu thị kết dạng thập phân 1,0 9,9 nhân với 10n (n số mũ thích hợp 10) Thí dụ: Ở đậm độ pha lỗng 10 -2 có 150 215 khuẩn lạc đậm độ pha loãng 10-3 có 16 25 khuẩn lạc 150 + 215 + 16 + 25 N= = 18480 (2 + 0,1.2).10-2 Kết quả: 1,8.104 vi khuẩn hiếu khí 1g 1ml sản phẩm Nếu chênh lệch giá trị đậm độ pha loãng lớn lần Lấy giá trị đậm độ pha lỗng thấp để tính kết Thí dụ: Ở đậm độ pha lỗng 10-2 có 180 250 khuẩn lạc; Ở đậm độ pha lỗng 10-3 có 60 75 khuẩn lạc Chọn đậm độ pha lỗng thấp (10-2) để tính kết Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng ix Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 180 + 250 N= = 21500 (2 + 0,1.2).10-2 Kết quả: 2,2.104 vi khuẩn hiếu khí 1g 1ml sản phẩm 1.4.2 Nếu đĩa sản phẩm lỏng nguyên chất đậm độ pha loãng ban đầu có 15 khuẩn lạc Tính kết theo trung bình cộng khuẩn lạc đếm đĩa tính cho 1g ml sản phẩm Thí dụ: Chỉ đậm độ pha lỗng 10-1 sản phẩm đặc có 12 khuẩn lạc 12 + N= = 100 -2 2.10 Kết quả: 1,0.102 vi khuẩn hiếu khí 1g sản phẩm 1.4.3 Nếu tất đĩa khơng có khuẩn lạc mọc Đánh giá kết sau: Ít vi khuẩn hiếu khí 1ml sản phẩm Ít 1.1/d vi khuẩn hiếu khí 1g sản phẩm d: Hệ số pha loãng đậm độ pha loãng ban đầu (10 -1) Phương pháp kiểm tra tổng số vi khuẩn lactic Sử dụng kỹ thuật cấy láng, đếm khuẩn lạc nghi ngờ môi trường thạch MRS sau ủ vi hiếu khí nhiệt độ 30 ± 1o C 48 2.1 Môi trường Nước pha loãng pepton Thạch MRS (de Man, Rogosa, Sharpe agar with Sorbic Acid) 2.2 Chuẩn bị môi trường mẫu thử 2.2.1 Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng thuốc thử pha chế theo công thức hấp tiệt trùng theo hướng dẫn cho loại môi trường Nước pepton 1% Pepton 1g NaCl 8,5g Nước cất 1000ml Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng x Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Cách pha chế: Đun sôi để hoà tan chất Để nguội đến 30  0C Điều chỉnh pH môi trường dung dich NaOH 0,1 M cho sau tiệt khuẩn pH = 7,0  0,2 Rót vào bình dung tích 250 ml bình 90ml vào ống nghiệm 18 ống ml môi trường Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 1210C/15 phút Nếu môi trường không dùng ngay, cần bảo quản tủ lạnh với nhiệt độ từ đến 5°C không 30 ngày Bảng 3: Thạch MRS Thành phần Tỉ lệ sử dụng Pepton 10,0g Cao thịt 8,0g Cao men 5,0g Glucose 20,0g Tween 80 1,0g K2HPO4 2,0g MgSO4 0,2g MnSO4 0,05g Ammoi citrat 2,0g Natri acetate 5,0g Thạch thường 15,0g Nước cất 1000 ml Pha chế: Đun nhỏ lửa, quấy đến sơi để hồ tan chất Rót vào bình cầu có dung tích 250 ml bình 200 ml môi trường Tiệt khuẩn nồi hấp nhiệt độ 110 oC /30 phút Để bình thạch nguội khoảng 50oC, cho vào ml dung dịch acid sorbic lắc Trong điều kiện vô trùng chỉnh pH thạch đến 5,7 dung dịch acid hydrocloric 10% Thạch để nguội đến 45oC, rót vào hộp lồng vơ trùng có đường kính 90mm, 110mm, hộp 15 - 18 ml thạch Để đĩa thạch đông tự nhiên, bảo quản tủ lạnh với nhiệt độ từ 0o đến 5oC không ngày 2.2.2 Chuẩn bị mẫu dung dịch mẫu thử Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng thể đồng Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1 Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xi Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thông - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Cân xác 10g thực phẩm chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 90ml nước pepton Lắc 2-3 phút, thu dung dịch mẫu thử 10-1 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2, 10 -3, 10-4 … Hút xác ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn ml nước pepton Lắc 2-3 phút, thu dung dịch 10-2 Tiếp tục làm tương tự vậy, ta thu dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10 -4 2.3 Tiến hành thí nghiệm Bước : Ni cấy mẫu Ghi ký hiệu mẫu nồng độ dung dịch mẫu thử lên đĩa thạch MRS Dùng pipet vơ trùng hút xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử đậm độ nhỏ lên bề mặt đĩa thạch MRS hong khô Dùng que láng vô trùng, láng cho dung dịch mẫu thử phân bố mặt thạch Mỗi mẫu thực phẩm phải nuôi cấy đậm độ Mỗi đậm độ pha lỗng phải ni cấy đĩa thạch MRS pipet vô trùng riêng Để đĩa thạch mặt phẳng ngang vòng 15 phút để dung dịch mẫu thấm hết vào bề mặt thạch Sau lật sấp đĩa để vào tủ ấm 3O ± o C điều kiện vi hiếu khí 48 Bước 2: Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic đậm độ Chọn đĩa có khơng q 150 khuẩn lạc đậm độ pha loãng liên tiếp để sơ đọc kết Đếm ghi lại số khuẩn lạc nghi ngờ vi khuẩn Lactic đậm độ: khuẩn lạc tròn nhỏ bóng, màu mơi trường, màu trắng đục màu vàng kem; khuẩn lạc có kích thước to tròn lồi trắng đục (dễ nhầm với khuẩn lạc nấm men); đặc biệt khuẩn lạc toả mùi chua acid Lưu ý: Nhìn chung khuẩn lạc vi khuẩn Lactic có kích thước nhỏ nên cần sử dụng máy đếm khuẩn lạc để xác định số khuẩn lạc vi khuẩn Lactic 2.4 Tính kết Để xác định tổng số vi khuẩn Lactic có 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn đĩa có khơng q 150 khuẩn lạc đậm độ pha loãng liên tiếp Sự phân bố khuẩn lạc phải hợp lý: Độ pha lỗng cao số khuẩn lạc Tổng số vi khuẩn Lactic có 1g 1ml mẫu thử (N) tính theo cơng thức sau: Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thông - 2010 Trường Đại học Cần Thơ ∑C N = -V( n1+ 0,1xn2 )d Trong đó: ∑ C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa chọn V: Thể tích cấy đĩa tính ml n1: Số đĩa đậm độ pha loãng thứ giữ lại n2: Số đĩa đậm độ pha loãng thứ hai giữ lại d: Hệ số pha loãng đậm độ pha lỗng thứ Làm trịn kết thu đến hai chữ số có nghĩa (nếu số cần làm trịn nhỏ số đứng trước khơng thay đổi Nếu số cần làm tròn lớn số đứng trước tăng lên đơn vị, tiếp tục làm tròn cịn hai chữ số có nghĩa) Số vi khuẩn Lactic có 1g 1ml thực phẩm biểu thị số thập phân từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10n (trong n luỹ thừa tương ứng 10) Ví dụ: mẫu thực phẩm kiểm tra cho kết quả: Đậm độ pha loãng 10 -1: 145 khuẩn lạc (đĩa1), 128 khuẩn lạc (đĩa2) Đậm độ pha loãng 10 -2: 65 khuẩn lạc (đĩa1), 78 khuẩn lạc (đĩa2) Đậm độ pha loãng 10 -3: 15 khuẩn lạc (đĩa1), 25 khuẩn lạc (đĩa2) 145 + 128 + 65 + 78 N = = 32.545 0,1( 2+ 0,1x )10-1 Làm tròn kết hướng dẫn thu 33.000 3,3 x 104 vi khuẩn Lactic /g (ml) thực phẩm Lưu ý: Nếu đĩa đậm độ pha lỗng ban đầu có 15 khuẩn lạc tính kết theo trung bình cộng Nếu đĩa đậm độ pha lỗng ban đầu khơng có khuẩn lạc nào, kết sau: Đối với sản phẩm lỏng nhỏ vi khuẩn Lactic/ ml Đối với sản phẩm khác nhỏ 10 vi khuẩn Lactic/g Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xiii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến) 3.1 Vật liệu, hoá chất 3.1.1 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet) 2g tím kết tinh hồ tan 20 ml etanol 95% 0,8 g ammon oxalat hoà tan 80 ml nước cất Trộn hai dịch nói lại với nhau, giữ 48 lọc Bảo quản lọ tối, sử dụng vài tháng 3.1.2 Dung dịch Iod Hoà tan 1g Iod (Iodine) 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản lọ tối 3.1.3 Dung dịch tẩy màu Etanol 95% trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton 3.1.4 Dung dịch nhuộm bổ sung Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5% 3.2 Các bước tiến hành Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ thạch (sau cấy 24 giờ) hồ vào giọt nước cất phiến kính, làm khơ khơng khí Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi lửa đèn cồn 2-3 lần Nhuộm dung dịch Tím kết tinh phút, rửa nước, thấm khô Nhuộm lại dung dịch Iod phút, rửa nước, thấm khô Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến vừa thấy màu), rửa nước, thấm khô Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin 2-3 phút, rửa nước, để khô khơng khí Quan sát kính hiển vi Kết quả: Vi khuẩn Gram (+): màu tím Vi khuẩn Gram (-): màu hồng Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xiv Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Hình 1.1.Các bước tiến hành nhuộm Gram ví dụ minh hoạ kết Phương pháp phân lập vi khuẩn Lactic: Huyền phù mẫu cấy lên đĩa có mơi trường Ủ 30 0C từ 1- ngày đến xuất khuẩn lạc Sau lần cấy chuyền, chọn khuẩn lạc rời, tròn phải nằm đường cấy quan sát kính hiển vi thấy vi khuẩn rịng (đồng hình dạng kích thước tiến hành quan sát hình dạng vi khuẩn Lactic) Quan sát hình dạng khuẩn lạc ni cấy mơi trường MRS Agar Sau phân lập tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng khuẩn lạc ni cấy môi trường MRS Agar mắt thường tiêu chí: hình dạng, độ bóng, máu sắc, độ Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn Lactic Sau phân lập tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn phương pháp giọt ép kính hiển vi quang học độ phóng đại X100 lần Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn sau: Nhỏ giọt nước cất vơ trùng lên kính mang vật Khử trùng kim cấy lửa đèn cồn để nguội Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc trải lên giọt nước kính mang vật Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xv Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thơng - 2010 Trường Đại học Cần Thơ Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước cách để cạnh kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật góc 450 hạ kính đậy vật xuống từ từ nhẹ nhàng cho mẫu vật bọt khí Quan sát mẫu vật kính hiển vi quang học độ phóng đại X100 lần để thấy hình dạng vi khuẩn Quan sát đo kích thước tế bào vi khuẩn Lactic Sau quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn, tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn kính hiển vi quang học độ phóng đại X100 lần Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn sau Nhỏ giọt nước cất vơ trùng lên kính mang vật Khử trùng kim cấy lửa đèn cồn để nguội Dùng kim cấy lấy khuẩn lạc trải lên giọt nước kính mang vật Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước cách để cạnh kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật góc 450 hạ kính đậy vật xuống từ từ nhẹ nhàng cho mẫu vật khơng có bọt khí Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính Thước trắc vi thị kính miếng kính trịn chia thành 100 vạch, đặt hai thấu kính thị kính Phương pháp đo kích thước vi khuẩn sau: Đặt thước trắc vi vật kính vào bán kính, điều chỉnh cho thấy rõ hình ảnh thước Xê dịch thước trắc vi vật kính xoay thước trắc vi thị kính Trị số khoảng thước trắc vi thị kính 1.71µm Điều chỉnh cho thấy rõ ảnh tế bào vi khuẩn mẫu Di chuyển mẫu cho đầu tế bào vi khuẩn mẫu đo trùng với vạch thước trắc vi thị kính, từ tìm vạch thứ hai trùng với đầu tế bào vi khuẩn mẫu đo Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm hai vạch Tính kích thước tế bào vi khuẩn mẫu cách lấy số khoảng trùng với thước trắc vi thị kính nhân với trị số khoảng thước trắc vi thị kính Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xvi Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thông - 2010 Trường Đại học Cần Thơ 5.Thử nghiệm oxydase Chuẩn bị thuốc thử Tetramethyl - p - phenylenediamin dihydrochlorid 1% Tetramethyl - p - phelylenediamin dihydrochlorid 0,5g Nước cất vô trùng 50 ml Pha chế: Lắc để hoà tan Rồi chứa đựng lọ thuỷ tinh tối màu có nút chặt, bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4oC tuần Tiến hành phép thử: Đặt miếng giấy lọc vô trùng vào đĩa petri vơ trùng, lên lam kính vơ trùng Nhỏ vài giọt thuốc thử Tetramethyl - p - phenylendiamin dihydrochlorid 1% lên miếng giấy lọc Dùng que cấy Platin que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc phân lập rịng (tốt khuẩn lạc khơng q 48 giờ), mài kỹ lên phần giấy lọc nhỏ thuốc thử Đọc kết quả: Nếu xuất màu tím sẫm sau 10 giây oxidase (+) 6.Thử nghiệm catalase Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc phân lập ròng (tốt khuẩn lạc khơng q 24 giờ) đặt lên lam kính vô trùng Nhỏ giọt dung dịch oxy già (H2O2) 3% phủ lên khuẩn lạc Đọc kết quả: Nếu thấy xuất bọt khí catalase (+) Bộ mơn Cơng nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xvii Luận văn tốt nghiệp khóa 34 Liên thông - 2010 Trường Đại học Cần Thơ B Kết phân tích thống kê Bảng 4: Kết thống kê ảnh hưởng công đoạn xử lý tới tổng số vi khuẩn hiếu khí Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.35394E19 1.93421E18 309411.15 0.0000 Within groups 5.001E13 6.25125E12 Total (Corr.) 1.35395E19 15 Bảng 5: Kiểm định LSD ảnh hưởng công đoạn xử lý tới mật số vi sinh vật -Method: 95.0 percent LSD Cong doan Count Mean Homogeneous Groups -20 u 2000.0 X 15 u 8600.0 X 10 u 1.85E6 XX u 2.3E6 XX Phoi tron 6.55E6 X Nguyen lieu 1.9E7 X Lam sach, rua 1.15E8 X Ngâm (20h) 2.8E9 X Bảng 6: Kết thống kê ảnh hưởng công đoạn xử lý đến tổng số vi khuẩn Lactic Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.96606E16 2.80866E15 2950.56 0.0000 Within groups 7.61525E12 9.51906E11 Total (Corr.) 1.96682E16 15 Bảng 7: Kiểm định LSD ảnh hưởng công đoạn xử lý đến tổng số vi khuẩn Lactic -Method: 95.0 percent LSD Cong doan Count Mean Homogeneous Groups -Phoi tron 95000.0 X u 550000.0 X Nguyen lieu 2.1E7 X Lam sach, rua 2.3E7 X 20 u 2.7E7 X 15 u 8.15E7 X 10 u 8.45E7 X Ngâm (20h) 8.65E7 X Bộ môn Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp Sinh học ứng dụng xviii ... biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm? ?? thực Trên sở mục tiêu nghiên cứu xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn Lactic phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế biến Kết thu qua trình. .. triển vi sinh vật có lợi vi sinh vật tạp suốt trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm chủ động nguồn vi sinh vật có lợi sẵn có Từ đó, vi? ??c ? ?Phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế. .. triển vi sinh vật có lợi vi sinh vật tạp suốt trình chế biến mắm cá sặc lên men chua xương mềm chủ động nguồn vi sinh vật có lợi sẵn có Từ đó, vi? ??c ? ?Phân lập vi khuẩn Lactic tham gia vào trình chế