Phân Lập Vi Khuẩn Khử Đạm Từ Nước Thải Nhà Máy Sữa Và Các Trại Chăn Nuôi Bò Sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ ĐẠM TỪ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA VÀ CÁC TRẠI CHĂN NI BỊ SỮA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs.Ts CAO NGỌC ĐIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGÔ MỸ NGÂN MSSV:3064464 LỚP:CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) PGs.Ts Cao Ngọc Điệp Ngô Mỹ Ngân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: PGs.Ts Cao Ngọc Điệp tận tình hướng dẫn cho lời khuyên quý báu, bổ ích suốt thời gian thực đề tài Cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công nghệ sinh học khóa 32 ln quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập trường thời gian thực đề tài Quý Thầy, Cô giảng dạy chương trình đại học Cơng nghệ sinh học khóa 32, trường Đại học Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cần thiết suốt trình tơi theo học trường Anh Bùi Thế Vinh, nghiên cứu sinh Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành tốt luận văn Cán phịng thí nghiệm vi sinh vật Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến quan tâm giúp đỡ quý báu Sinh viên thực Ngơ Mỹ Ngân TĨM TẮT Ô nhiễm đạm vấn đề quan tâm xử lý môi trường Hàm lượng ammonia, nitrate nước thải cao ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ thủy sinh động, thực vật sức khỏe người Hiệu trình loại bỏ nitrogen vi khuẩn khử đạm chứng minh qua nhiều nghiên cứu ngồi nước Vì vậy, đề tài “ Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn ni bị sữa” thực Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn khử đạm phân lập từ mẫu chất thải lỏng rắn nhà máy sữa, trại chăn ni bị sữa số tỉnh Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) Khảo sát mơi trường tối thiểu có bổ sung NH4+, NO2-, NO3- với nồng độ từ 100-700mM, kết nhận 47 dịng vi khuẩn có khả oxy hóa ammonium khử nitrate Ở nồng độ 100mM, 47/47 dòng phát triển hai mơi trường bổ sung NH4+, NO3-, 11/47 dịng vi khuẩn phát triển môi trường bổ sung NO2- Ở nồng độ 700mM, có 5/47 dịng có khả oxy hóa ammonium 15/47 dịng có có khả khử nitrate Từ khóa: ammonium, chu trình nitơ, nitrite, nitrate, nước thải nhà máy sữa, vi khuẩn khử đạm i MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Chu trình nitơ 2.2 Vi khuẩn khử đạm 2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn khử đạm giới nước 2.3.1 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm giới 2.3.2 Những nghiên cứu vi khuẩn khử đạm nước Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Phương tiện nghiên cứu 11 3.1.2 Nguyên vật liệu 11 3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 11 3.1.3 Hóa chất 12 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 13 ii 3.2.2 Phương pháp phân lập 13 3.2.3 Khảo sát khả oxy hóa ammonium khử nitrite, nitirate 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Kết phân lập vi khuẩn từ chất thải trại chăn nuôi bò sữa tỉnh, thành ĐBSCL, trạm thu mua sữa TP.HCM mẫu nước thải từ nhà máy sữa Vinamilk 17 4.1.1 Kết phân lập dòng vi khuẩn 17 4.1.2 Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 18 4.1.3 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 20 4.2 Kết khảo sát khả oxy hóa ammonium, khử nitrite nitrate dòng vi khuẩn phân lập 24 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần hoá chất pha chế môi trường Minimal phân lập vi khuẩn 12 Bảng 3.2: Thành phần môi trường Minimal bổ sung Nitrate, Nitrite Ammonium 100mM 16 Bảng 4.1: Kết phân lập dòng vi khuẩn từ chất thải trại chăn ni bị sữa, trạm thu mua sữa nhà máy sữa Vinamilk 17 Bảng 4.2: Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 18 Bảng 4.3: Đặc điểm hình thái dịng vi khuẩn phân lập 20 Bảng 4.4: Tỷ lệ phần trăm hình dạng khả chuyển động 47 dòng vi khuẩn phân lập 23 Bảng 4.5: Tỷ lệ phần trăm đặc điểm khuẩn lạc 47 dòng vi khuẩn phân lập 24 Bảng 4.6: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO2-, NO3- 100mM 25 Bảng 4.7: Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- 200mM 27 Bảng 4.8: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- 300mM 29 Bảng 4.9: Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- 400mM, 500mM 600mM 31 Bảng 4.10: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- 700mM………………………………………………………… 35 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Chu trình nitơ Hình 3.1: Một số dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 12 Hình 3.2: Mẫu chất thải lỏng mẫu chất thải rắn 13 Hình 3.3: Mẫu trải phát triển mơi trường Minimal 14 Hình 3.4: Khuẩn lạc sau cấy chuyển 14 Hình 3.5: Khuẩn lạc rịng trữ mơi trường Minimal 15 Hình 4.1: Khuẩn lạc số dịng vi khuẩn phát triển môi trường Minimal 22 Hình 4.2a: Sự phát triển số dịng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung 500mM NH4+ 33 Hình 4.2b: Sự phát triển số dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung 500mM NO3- 34 Hình 4.3a: Sự phát triển số dịng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung 600mM NH4+ 34 Hình 4.3b: Sự phát triển số dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung 600mM NO3- 34 v Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Từ lâu, sữa thực phẩm thiết yếu hàng ngày người tiêu dùng nhiều nước giới Tại Việt Nam, năm gần điều kiện kinh tế phát triển, thu nhập người dân tăng lên nên nhu cầu tiêu dùng tăng theo, có nhu cầu tiêu dùng sữa Tuy nhiên, sản lượng sữa không đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng nước Vì vậy, ngành chăn ni bị sữa khuyến khích phát triển nhằm đáp ứng nhu cầu Theo số liệu thống kê Tổng cục Thống kê số lượng bò sữa sản lượng sữa năm 2008, tổng số đàn bò sữa Việt Nam lên đến 107.983 con, sản lượng sữa đạt 262.160 đáp ứng khoảng 25% nhu cầu sữa nước (http://www.dairyvietnam.org.vn/vi/statistics.php?mnu=4&tkid=1 5&dmtk=9) Đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL) vùng có truyền thống có điều kiện chăn ni bị lại chậm phát triển Từ năm 2000 tới nay, nhờ chương trình phát triển bò sữa quốc gia (theo định 167/QĐT.Tg Thủ tướng ngày 26/10/2001), tạo chuyển biến mạnh mẽ vị trí bị nói chung, bị sữa nói riêng sản xuất nơng nghiệp Một số tỉnh dẫn đầu đàn bò sữa ĐBSCL Long An, Tiền Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, có nhiều dự án khuyến khích phát triển đàn bị sữa nơng dân giúp họ làm giàu, cải thiện đời sống (http://www.cucchannuoi.gov.vn/Breeding.aspx?type=b&id=681) Song song với hiệu kinh tế mà dự án mang lại có vấn đề đáng quan tâm tình hình nhiễm mơi trường trại chăn ni bị sữa gây Những trại chăn ni bị quy mơ lớn hộ chăn ni gia đình ngày thải vào mơi trường lượng lớn chất thải dạng rắn, lỏng khí khơng thân thiện với môi trường sống Quản lý chất thải không tốt ảnh hưởng trực tiếp đến khơng khí, nguồn nước lan truyền dịch bệnh cho người chăn ni người sống lân cận Đáng ý ô nhiễm nguồn nước ô nhiễm từ đất, khơng khí làm nhiễm nước Một báo cáo toàn cầu Tổ chức Y tế giới (WHO) công bố cho thấy, năm Việt Nam có 20.000 người tử vong điều kiện nước vệ sinh thấp kém.) Còn theo thống kê Bộ Y tế, 80% bệnh truyền nhiễm nước ta liên quan đến nguồn Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT nước Người dân nông thôn thành thị phải đối mặt với nguy mắc bệnh môi trường nước ngày nhiễm trầm trọng (http://un.org.vn/index.php ?option=com_content&view=section&layout=blog&id=9&Itemid=187&lang=vi&limitstart= 42) Vì vậy, việc xử lý chất thải góp phần giảm thiểu tác hại ô nhiễm nước mối quan tâm hàng đầu nhà nghiên cứu môi trường Nguyên tắc xử lý môi trường loại bỏ chất độc hại nguồn chất hữu có chất thải Tầm quan trọng việc loại bỏ vật chất hữu chất thải, đặc biệt nước thải, liên tục nhấn mạnh qua nhiều nghiên cứu điều luật môi trường Một hai tiêu nước thải quy định nitơ tổng số (Toet et al., 2005; Joeng et al., 2006; Zhang et al., 2008) Nitrate (NO3-) hòa tan dễ dàng nước Nước có nồng độ nitrate cao gây nên tượng phú dưỡng làm số loài tảo, rong rêu phát triển mức Các loài rong rêu chiếm lấy làm giảm oxy nước, phá hủy hệ thủy sinh động vật Hơn vào thể người nitrate biến đổi thành nitrit (NO2-), hợp chất gây ung thư Trong tự nhiên, trình khử đạm xem then chốt chu trình nitơ Quá trình ứng dụng xử lý nước thải xem cách loại trừ ammonium, nitrate hiệu nhờ vào hoạt động số dòng vi khuẩn khử đạm (denitrifying bacteria) Biện pháp xử lý vi sinh vật ý đặc biệt hiệu xử lý cao tốn chi phí Để xử lý triệt để cần phải có phối hợp hoạt động nối tiếp nhóm vi khuẩn nitrate hóa (oxy hóa ammonium thành nitrate) vi khuẩn khử nitrate (khử nitrate thành NO, NO2 N2) (Lee et al., 2002) Với mục tiêu tìm kiếm dịng vi khuẩn có khả khử đạm cao ứng dụng xử lý nước thải từ trại chăn nuôi bị sữa nhà máy sữa, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn ni bị sữa” 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số dòng vi khuẩn khử đạm từ nước thải trại chăn ni bị sữa nhà máy sữa Khảo sát khả oxy hóa ammonium, khử nitrite khử nitrate dòng vi khuẩn phân lập điều kiện phịng thí nghiệm Chun ngành Cơng nghệ sinh học Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 17 PR7b ++++ ++++ - ++++ ++++ 18 PR7c +++ ++++ - ++++ ++++ 19 PL1a ++ ++ - +++ ++++ 20 PL3a ++ ++ - +++ +++ 21 PL6a +++ ++++ + ++++ ++++ 22 PL6b +++ +++ - ++ +++ 23 LV1 ++++ ++++ + ++++ ++++ 24 LV2a1 ++++ ++++ - ++++ ++++ 25 LV2a2 ++ +++ - +++ ++++ 26 LV3 ++++ ++++ - ++++ ++++ 27 LV4a +++ ++++ + ++ +++ 28 LV5 ++++ ++++ - +++ ++++ 29 LV8b +++ +++ - +++ ++++ 30 OM4 +++ ++++ - +++ ++++ 31 OM5 ++++ ++++ + ++++ ++++ 32 OM6 +++ ++++ - +++ +++ 33 OM10 ++++ ++++ - ++++ ++++ 34 OM12 ++++ ++++ - +++ ++++ 35 OM13 +++ ++++ - +++ ++++ 36 BT1 +++ ++++ - ++++ ++++ 37 BT2 ++++ ++++ + ++++ ++++ 38 BT3 ++ +++ - +++ ++++ 39 BT5 +++ +++ - ++ +++ 40 BT12 ++ +++ - +++ +++ 41 SL3 ++++ ++++ - +++ +++ 42 SL5 ++++ ++++ - +++ ++++ 43 SL8 +++ +++ - +++ +++ 44 3b4b +++ ++++ - +++ ++++ 45 3b7b ++++ ++++ + ++++ ++++ 46 TR2 ++++ ++++ - +++ +++ 47 TR3 ++++ ++++ + +++ +++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học 26 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT (-): không phát triển; (+): phát triển yếu; (++): phát triển trung bình; (+++): phát triển khá; (++++): phát triển tốt Tiếp tục thử nghiệm 47 dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- với nồng độ 200mM Ở nồng độ 200mM, hầu hết dòng vi khuẩn lên tốt (Bảng 4.7) Bảng 4.7: Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO 3- 200mM Môi trường Số TT NH4+ Dòng vi khuẩn NO3- Ngày Ngày Ngày Ngày VC7b +++ +++ ++ ++ VC8b +++ +++ +++ +++ VC17a ++ +++ +++ +++ VC17b ++++ ++++ ++++ ++++ VC17c +++ +++ +++ +++ VC18 ++ +++ +++ +++ VC19 ++++ ++++ ++++ ++++ VC21 ++ ++ ++ ++ VC22 +++ +++ +++ +++ 10 VC33 ++ +++ +++ +++ 11 VC35 ++ +++ ++ ++ 12 PR1b +++ +++ +++ +++ 13 PR4 ++ ++ +++ ++++ 14 PR5 +++ ++++ ++++ ++++ 15 PR6 +++ +++ +++ ++++ 16 PR7a +++ ++++ +++ +++ 17 PR7b ++++ ++++ +++ +++ 18 PR7c +++ ++++ ++++ ++++ 19 PL1a ++ ++ +++ +++ 20 PL3a ++ ++ +++ +++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học 27 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 21 PL6a +++ ++++ ++++ ++++ 22 PL6b +++ +++ ++ +++ 23 LV1 ++++ ++++ ++++ ++++ 24 LV2a1 ++++ ++++ ++++ ++++ 25 LV2a2 ++ ++ ++ +++ 26 LV3 ++++ ++++ ++++ ++++ 27 LV4a +++ ++++ ++ ++ 28 LV5 ++++ ++++ +++ ++++ 29 LV8b +++ +++ +++ +++ 30 OM4 +++ ++++ +++ ++++ 31 OM5 ++++ ++++ ++++ ++++ 32 OM6 ++ +++ ++ +++ 33 OM10 ++++ ++++ ++++ ++++ 34 OM12 ++++ ++++ ++++ ++++ 35 OM13 +++ +++ +++ ++++ 36 BT1 +++ ++++ +++ ++++ 37 BT2 ++++ ++++ +++ ++++ 38 BT3 ++ +++ ++ +++ 39 BT5 +++ +++ ++ +++ 40 BT12 +++ ++++ +++ +++ 41 SL3 ++ +++ +++ +++ 42 SL5 ++++ ++++ +++ ++++ 43 SL8 +++ +++ +++ +++ 44 3b4b +++ ++++ +++ +++ 45 3b7b ++++ ++++ ++++ ++++ 46 TR2 ++++ ++++ +++ +++ 47 TR3 ++++ ++++ ++ +++ (-): không phát triển; (+): phát triển yếu; (++): phát triển trung bình; (+++): phát triển khá; (++++): phát triển tốt Khảo sát môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- với nồng độ 300mM, tất 47 dịng vi khuẩn có khả oxy hố ammonium khử nitrate Chun ngành Cơng nghệ sinh học 28 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Về khả oxy hố ammonium có 27/47 dịng lên tốt (chiếm 57,45%), 17/47 dịng lên trung bình (chiếm 36,17%) xuất dòng lên yếu 3/47 dòng (chiếm 6,38%) Về khả khử nitrate có 37/47 dịng lên tốt (chiếm 78,72%) 10/47 dịng lên trung bình (chiếm 21,28%) (Bảng 4.8) Bảng 4.8: Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO 3- 300mM Môi trường Số TT NH4+ Dòng vi khuẩn NO3- Ngày Ngày Ngày Ngày VC7b ++ ++ ++ ++ VC8b ++ ++ ++ ++ VC17a ++ +++ ++ +++ VC17b +++ +++ +++ +++ VC17c +++ +++ +++ +++ VC18 ++ ++ ++ +++ VC19 ++++ ++++ ++++ ++++ VC21 + + + ++ VC22 +++ +++ +++ +++ 10 VC33 ++ +++ +++ +++ 11 VC35 ++ ++ ++ ++ 12 PR1b ++ ++ ++ ++ 13 PR4 ++ ++ ++ ++ 14 PR5 +++ +++ ++ +++ 15 PR6 ++ ++ ++ +++ 16 PR7a +++ ++++ +++ +++ 17 PR7b +++ +++ +++ +++ 18 PR7c +++ +++ ++++ ++++ 19 PL1a + + ++ ++ 20 PL3a + + ++ ++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học 29 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 21 PL6a +++ ++++ +++ ++++ 22 PL6b ++ ++ +++ +++ 23 LV1 ++++ ++++ +++ ++++ 24 LV2a1 +++ +++ +++ ++++ 25 LV2a2 + ++ + ++ 26 LV3 ++++ ++++ +++ ++++ 27 LV4a ++ +++ ++ ++ 28 LV5 +++ +++ +++ ++++ 29 LV8b ++ ++ ++ +++ 30 OM4 ++ +++ +++ ++++ 31 OM5 +++ +++ +++ ++++ 32 OM6 ++ ++ ++ +++ 33 OM10 ++ +++ ++++ ++++ 34 OM12 ++ +++ ++ +++ 35 OM13 ++ ++ +++ +++ 36 BT1 ++ +++ +++ +++ 37 BT2 ++++ ++++ +++ ++++ 38 BT3 ++ ++ ++ +++ 39 BT5 ++ ++ ++ +++ 40 BT12 ++ ++ +++ +++ 41 SL3 ++ ++ +++ +++ 42 SL5 +++ ++++ +++ +++ 43 SL8 ++ ++ +++ +++ 44 3b4b +++ +++ +++ +++ 45 3b7b ++++ ++++ ++++ ++++ 46 TR2 +++ +++ +++ +++ 47 TR3 ++++ ++++ ++ +++ (-): không phát triển; (+): phát triển yếu; (++): phát triển trung bình; (+++): phát triển khá; (++++): phát triển tốt Ở nồng độ 400mM, có 46/47 dịng có khả oxy hóa ammonium Trong đó, 12/47 dịng lên (chiếm 25,53%), cịn lại 34/47 dịng lên trung bình yếu (chiếm Chun ngành Cơng nghệ sinh học 30 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 72,43%) Khả khử nitrate 47 dòng vi khuẩn mạnh Trong đó, 14/47 dịng lên tốt (chiếm 29,79%), 23/47 dịng lên trung bình (chiếm 48,94%) 10/47 dịng lên yếu (chiếm 21,28%) (Bảng 4.9) Bảng 4.9: Khả phát triển dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO 3- 400mM, 500mM 600mM 400mM Số TT 500mM 600mM Dòng vi khuẩn NH4+ NO3- NH4+ NO3- NH4+ NO3- VC7b ++ + + - - - VC8b + + - - - - VC17a ++ ++ + + + - VC17b ++ ++ + + + - VC17c ++ ++ + + + + VC18 ++ ++ ++ ++ + + VC19 +++ +++ ++ ++ + + VC21 + + - - - - VC22 +++ ++ ++ ++ ++ + 10 VC33 ++ ++ + + + + 11 VC35 + ++ + + + + 12 PR1b + + - - - - 13 PR4 + + - - - - 14 PR5 ++ ++ + + - - 15 PR6 + ++ + + - - 16 PR7a +++ ++ ++ ++ + ++ 17 PR7b ++ ++ + + + + 18 PR7c ++ +++ + ++ - - Chuyên ngành Công nghệ sinh học 31 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 19 PL1a + + + + - - 20 PL3a - + - - - - 21 PL6a ++ +++ + ++ - + 22 PL6b + + - - - - 23 LV1 +++ ++++ +++ +++ ++ ++ 24 LV2a1 +++ +++ ++ +++ - +++ 25 LV2a2 ++ + + - - - 26 LV3 +++ +++ ++ +++ + +++ 27 LV4a ++ + - - - - 28 LV5 ++ ++ + + - + 29 LV8b + ++ - - - - 30 OM4 ++ ++ + + - + 31 OM5 ++ ++ + + + + 32 OM6 + ++ + + - - 33 OM10 ++ +++ ++ ++ + + 34 OM12 ++ +++ + ++ - + 35 OM13 ++ ++ + ++ - + 36 BT1 ++ ++ ++ ++ + + 37 BT2 +++ +++ ++ ++ + + 38 BT3 + ++ + + - - 39 BT5 + ++ + + - - 40 BT12 + ++ + + + - 41 SL3 + ++ - - - - 42 SL5 +++ +++ ++ ++ ++ ++ 43 SL8 + +++ + ++ - + 44 3b4b +++ +++ ++ ++ ++ ++ Chuyên ngành Công nghệ sinh học 32 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 45 3b7b ++++ ++++ +++ ++++ ++ ++++ 46 TR2 +++ ++ ++ ++ + ++ 47 TR3 +++ +++ ++ +++ + ++ (-): không phát triển; (+): phát triển yếu; (++): phát triển trung bình; (+++): phát triển khá; (++++): phát triển tốt Qua khảo sát môi trường bổ sung nồng độ 500mM, mức độ phát triển dòng vi khuẩn lúc giảm hẳn Chỉ có 38/47 dịng vi khuẩn (chiếm 80,85%) vừa có khả oxy hóa ammonium vừa khử nitrate, có dịng lên tốt LV1, LV2a1, LV3, 3b7b, TR3 Có dịng cịn khả oxy hóa ammonium khơng cịn khả khử nitrate VC7b, LV2a2 (Bảng 4.9) PL6a VC19 OM5 TR3 3b7b BT2 BT1 VC35 SL5 3b4b LV4a Hình 4.2a: Sự phát triển số dịng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung 500mM NH4+ Chuyên ngành Công nghệ sinh học 33 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT VC19 3b7b BT1 OM12 LV1 OM5 3b4b SL5 Hình 4.2b: Sự phát triển số dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung 500mM NO3Khảo sát tiếp 38/47 dịng vi khuẩn nồng độ 600mM, có 29/38 dịng (chiếm 76,32%) có khả phát triển hai mơi trường Những dịng có khả oxy hóa ammonium mức trung bình LV1, SL5, 3b4b, 3b7b, dòng khử nitrate tốt LV2a1, LV3, 3b7b Một số dòng LV5, OM12, OM13, SL8 giữ khả khử nitrate khơng cịn khả oxy hóa ammonium; ngược lại dịng VC17a, VC17b oxy hóa ammonium không khử nitrate (Bảng 4.9) TR PR7a 3b7b VC19 BT2 SL5 OM5 Hình 4.3a: Sự phát triển số dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung 600mM NH4+ LV1 BT1 OM12 Hình 4.3b: Sự phát triển số dịng vi khuẩn mơi trường tối thiểu bổ sung 600mM NO Chuyên ngành Công nghệ sinh học 34 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Ở nồng độ 700mM, khả phát triển dòng vi khuẩn giảm rõ rệt Có 3/29 dịng (chiếm 10,34%) phát triển môi trường bổ sung NH4+, NO3-; 5/29 dịng có khả oxy hóa ammonium (chiếm 17,24%), 15/29 dịng có khả khử nitrate (chiếm 51,72%) (Bảng 4.10) Bảng 4.10: Khả phát triển dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu bổ sung NH4+, NO3- 700mM Mơi trường Số TT Dịng vi khuẩn NH4+ NO3- VC18 + - VC33 - + PR7b + + LV1 - ++ LV2a2 - ++ LV3 - ++ OM5 + + OM12 - + BT1 - + 10 BT2 - + 11 BT12 + - 12 SL3 + + 13 SL5 - + 14 SL8 - + 15 3b7b - ++ 16 TR2 - + 17 TR3 - + Chuyên ngành Công nghệ sinh học 35 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Từ 13 mẫu chất thải rắn nước thải (11 mẫu nước, mẫu rắn) chuồng bò số tỉnh ĐBSCL, trạm thu mua sữa nhà máy sữa Vinamilk, phân lập 47 dòng vi khuẩn mơi trường tối thiểu Trong dịng phân lập từ mẫu rắn, 39 dòng phân lập từ mẫu nước Đa số dịng vi khuẩn phân lập có đặc điểm sau: có hình que ngắn, có khả chuyển động, dạng trịn, màu trắng đục, mơ, bìa ngun, kích thước 0,2-2mm (sau 36 giờ) bảo quản 40C thường phát triển đặc tính nhầy - Hầu hết dịng vi khuẩn vừa có khả oxy hóa ammonium vừa khử nitrate nồng độ từ 100-400mM Có 11/47 dịng vi khuẩn phát triển mơi trường bổ sung NO2- nồng độ 100mM - Ở nồng độ 500mM, có 38/47 dịng vi khuẩn phát triển hai môi trường bổ sung NH4+, NO3- Nồng độ 600mM, có 29/38 dịng vi khuẩn phát triển hai mơi trường Một số có khả lên loại môi trường loại mơi trường nồng độ 700mM Một số dịng vi khuẩn vừa có khả oxy hóa ammonium vừa khử nitrate mạnh ổn định như: LV1, LV3, TR3, SL5, 3b7b 5.2 Đề nghị - Kết đề tài đạt sở cần thiết quan trọng cho nghiên cứu điều kiện phòng thí nghiệm bên ngồi - Khảo sát khả xử lý nước thải dòng vi khuẩn phân lập quy mơ phịng thí nghiệm, tuyển chọn dòng mạnh hướng tới ứng dụng để xử lý mơi trường bên ngồi - Nếu có điều kiện nên tiến hành giải trình tự để nhận diện chuyên biệt dòng vi khuẩn phân để nhận diện chúng, hình thành giản đồ phả hệ dịng địa từ lựa chọn, phối hợp dòng khử đạm tốt xử lý nước nhiễm ammonia, nitrate - Tiếp tục phân lập nhận diện dòng vi khuẩn khử đạm hiệu hơn, phát triển thành chế phẩm sinh học xử lý nước thải bị nhiễm ammonia, nitrate nhằm đạt kết tốt Chuyên ngành Công nghệ sinh học 36 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp 2002 Giáo trình vi sinh vật chuyên sâu, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Thị Thùy Dương 2003 Công nghệ sinh học môi trường: Xử lý chất thải hữu (tập 2), NXB Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh Nguyễn Thành Nhân 2008 Phân lập nhận diện số dòng vi khuẩn khử đạm từ chất thải trại chăn nuôi Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Trần Hải Bằng 2008 Nhận diện gen nosZ, cd1-nir vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Phan Trường Khanh 2007 Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đất đồng sông Cửu Long ứng dụng xử lý ammonia nước điều kiện phịng thí nghiệm Luận văn thạc sĩ khoa học môi trường, Trường Đại học Cần Thơ Tô Thị Lài 2008 Xử lý ammonia nước ao cá tra vi khuẩn Pseudomonas stutzeri qui mơ phịng thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Trần Linh Thước 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật NXB Giáo dục Chương IV V Tiếng Anh Baggi, G., P Barbieri, E Galli, and S Tollari 1987 “Isolation of a Psedomonas stutzeri strain that degrades o- xylene”, Appl Environ Microbiol., 53 (9), pp 2129-2132 Braker, G., Andreas Fesefeldt, and Karl-Paul Witzel 1998 “Development of PCR Primer Systems for amplification of nitrite reductase genes (nirK and nirS) to detect denitrifying bacteria in enviromental samples”, Appl Environ Microbiol., pp 37693775 Bennasar, A., C Guasp and J Lalucat 1998 “Molecular methods for the detection and identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples”, Microb Ecol., 35, pp 22-33 Bennasar, A., C Guasp, M Tesar, and J Lalucat 1998 “Genetic relationships among Pseudomonas stutzeri strains based on molecular typing methods”, App Microbiol., 85, pp 643- 656 Bitton, G 2005 “Wateswater Microbiology, 3rd Edition” John Wiley and Sons, Inc New Jersey, pp 75-89 Burri, R., and A Stutzer 1895 “Uber nitrat Zerstorende Bakterien and den durch dieselben bedingten stickstoflverlust”, Zentrbl., Bakteriol., Parasitenkd., II Abt., 1, pp 257-265, 350-364, 392-398, 422-432 Chuyên ngành Công nghệ sinh học 37 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Cheneby, D., Laurent Philipot, Alain Hartmann, Catherine Hénault, Jean-Claude Germon.2000 “16s rDNA analysics for characterization of denitrifying bacteria isolated from three agricultural soils”, FEMS.Microbiology Ecology., 34, pp 121-128 Curtis, A C and J L Ingraham 1983 “Comparison of denitrification by Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans”, Appl Environ Microbiol., 45 (4), pp 1247- 1253 Hallin, S., and P - E Lindgren 1999 “PCR detection of genes encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria”, Appl Environ Microbiol., 65 (4), pp 1652- 1657 Heylen K, Bram Vanprays, Lieven Wittebolle, Willy Verstraete, Nico Boon and Paul De Vos.2006 “Cultivation of denitrifying bacteria: Optimization of isolation conditions and diversity study”, Appl Environ Microbiol., 72 (4), pp 2637-2643 Henry, S., D.Bru, B.Stres, S Hallet, and L.Philipot 2006 “Quantitative detection of nosZ gene, encoding nitrous oxide reductase, and comparison of the abundances of 16s rRNA, narG, nirK, and nosZ genes in soils”, Appl Environ Microbiol., 72 (8), pp 5181-5189 Homles, B 1986 “Identification and distribution of Pseudomonas stutzeri in clinical material”, Appl Bacteriol., 60, pp 401-411 Jeong, J., Hidaka, T., Tsuno, H., Oda, T 2006 “Development of biological filter as tertiery treatment for efective nitrogen removal: Biological filter for tertiery treatmen”, Waster Res., 40 (6), 1127-1136 Lalucat, J., A Bennasar, R Bosch, E García- Valdés, and N J.Palleroni 2006 “Biology of Pseudomonas stutzeri”, Microbiology and Molecular Biology Review., 70 (2), pp 510547 Lee H W., S Y Lee, J W Lee, J B Park, E S Choi, and Y K Park 2002 “Molecular characterization of microbial community in nitrate-removing activated sludge”, FEMS Microb Ecol., 41, pp 85-94 Mulder A 1989 “Anoxic ammonia oxidation”, International application published under the patent cooperation treaty (PCT) PCT/NL89/00004 Purkhold U., Wagner M., Timmermann G., Pommerening-Roser A., Koops HP 2003 “16s rRNA and amoA- based phylogeny of 12 novel beta-proteobacterial ammonia-oxiziding isolates: extntion of the dataset and proposal of a new lineage within the nitrosomonads”, Int T Syst Evol Microbiol., 53, pp 1485-1494 Rosselló, R., E Garcia– Valdes, J Lalucat, and J Ursing 1991 “Genotypic and phenotypic diversity of Pseudomonas stutzeri”, Syst Appl Microbiol., 14, pp 150– 157 Sikorski, J., M Mõhle, and W Wackernagel 2002 “Identification of complex composition, strong strain diversity and direction selection in local Pseudomonas stutzeri populatión from marine sediment and soils”, Appl Environ Microbiol., 68 (2), pp 865-873 Su, J –J., B –Y Liu, and Y.- C Chang 2001 “Indentifying an interfering factor on chemical oxygen demand (COD) determination in piggery wastewater and eliminating the factor by an indigenous Pseudomonas stutzeri strain”, Appl Microbiol., 33, pp 440-444 Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học 38 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Van Niel, C B., M B Allen 1952 “A note on of Pseudomonas stutzeri”, Bacteriol., 64, pp 413- 422 Toet, S., Logtestijin, R V., Schreijer, M., Kampf, R., Verhoeven, J.T 2005 “The functioning of a wetland system used for polishing effluent from a sewage treatment plant”, Ecol Eng., 25 (1), 101-124 Zhang, T.C., Bishop, P.L 2008 “Evaluation of substate and pH effects in a nitrifying biofilm”, Water Environ Res., 68 (7), pp 1107-1115 Zumft, W.G 1997 “Cell biology and molecular basis of denitrification”, Microbiol Mol Biol Rev., 61 (4), pp 533-616 Trang web http://www.dairyvietnam.org.vn/vi/statistics.php?mnu=4&tkid=15&dmtk=9 http://www.cucchannuoi.gov.vn/Breeding.aspx?type=b&id=6813 http://un.org.vn/index.php?option=com_content&view=section&layout=blog&id=9&Ite mid=187&lang=vi&limitstart=42 http://tulieu.violet.vn/document/show/entry_id/122642/cm_id/800569 (Cập nhật ngày 20/4/2010) Chuyên ngành Công nghệ sinh học 39 Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần nước muối nhân tạo SW (sea water) Hóa chất Nồng độ (g/l) NaHCO3 0,11 MgSO4.7H2O 10,5 NaCl 24 Phụ lục 2: Thành phần dung dịch khống vi lượng Hóa chất Nồng độ (g/l) EDTA 2,5 FeSO4 MnSO4 1,5 CuSO4 0,1 Co(NO3)2 0,24 Na2B4O7 0,095 Na2MoO4 1,187 ... dịng vi khuẩn có khả khử đạm cao ứng dụng xử lý nước thải từ trại chăn ni bị sữa nhà máy sữa, tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn ni bị sữa? ??... nitrogen vi khuẩn khử đạm chứng minh qua nhiều nghiên cứu ngồi nước Vì vậy, đề tài “ Phân lập vi khuẩn khử đạm từ nước thải nhà máy sữa trại chăn ni bị sữa? ?? thực Bốn mươi bảy dòng vi khuẩn khử đạm phân. .. Thơ VC17b Nước Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ VC17c Nước Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ VC18 Nước Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ VC19 Nước Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ VC21 Nước Nhà máy sữa Vinamilk