PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ -BÙI THẾ VINH PHÂN LẬP VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, KHỬ NITƠ, PHOTPHO VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC THẢI NHÀ MÁY SỮA CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 - 42 - 40 - 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Năm 2012 Công trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CAO NGỌC ĐIỆP PGS TS HÀ THANH TOÀN Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, ĐHCT 28 CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Bùi Thế Vinh, Phan Thanh Quốc, Cao Ngọc Điệp 2010 Phân lập nhận diện vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học chất thải sữa ứng dụng xử lý nước thải Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 805 – 809 Cao Ngọc Điệp, Khổng Thị Thu Vân, Bùi Thế Vinh 2010 Phân lập nhận diện vi khuẩn tích lũy poly-P nước rỉ rác Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3A), pp 915-922 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập, nhận diện vi khuẩn tích lũy polyphosphate từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất thải sữa ứng dụng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 18a, pp 185-193 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn Cao Ngọc Điệp 2011 Phân lập nhận diện vi khuẩn chuyển hóa nitơ từ chất thải trại nuôi bò sữa, chất thải sữa ứng dụng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 18a, pp 194-200 Bùi Thế Vinh, Hà Thanh Toàn, Cao Ngọc Điệp 2011 Biological treatment of dairy processing wastewater The second Conference on Food Science & Technology, Can Tho University, Viet Nam Đề tài cấp Trường Thời gian Ngày Kết thực nghiệm thu Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho ứng dụng xử lý nước thải nhà máy sữa 01/04/2010 – 31/12/2010 30/12/2010 Tốt Ngành sữa có vai trò quan trọng không kinh tế mà đời sống người dân liên quan trực tiếp đến sức khỏe trí tuệ hệ tương lai đất nước Theo Quyết định Thủ Tướng Chính Phủ số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 việc phê duyệt Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 đến năm 2015 đạt 700 sữa đến năm 2020 đạt 1.000 sữa; theo Quyết định Bộ Công Thương số 3399/QĐ-BCT ngày 28/06/2010 việc Phê duyệt Quy hoạch phát triển Ngành công nghiệp chế biến sữa Việt Nam đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2025 nước sản xuất sản lượng sữa (quy sữa tươi) 2,6 tỷ lít vào năm 2020 3,4 tỷ lít vào năm 2025 Ngành công nghiệp sữa phát triển có nhiều nhà máy sữa thành lập, sản xuất số lượng lớn sản phẩm để đáp ứng nhu cầu cho xã hội, đồng thời tạo lượng lớn chất thải nước thải Trong thành phần nước thải nhà máy sữa, thành phần chứa nitơ, photpho ý nhiều chúng ảnh hưởng đến trình phát triển tảo ao hồ Tảo ao hồ phát triển mức làm giảm chất lượng nước, ảnh hưởng đến đời sống động vật, thực vật nước Phương pháp thực tiễn hiệu để kiểm soát qúa trình phú dưỡng hóa tập trung kiểm soát hàm lượng nitơ photpho nước Do vậy, cần phải loại bỏ nitơ, photpho đến mức tối thiểu trước đưa môi trường Trong thực tế nay, người ta sử dụng phương pháp hóa lý sinh học để xử lý nước thải nhà máy sữa Tuy nhiên, sử dụng hóa chất có khả gây ung thư aluminum sunphat, polyacrylamid,…gây ô nhiễm thứ cấp áp dụng thực tế; chi phí thuốc thử cao trình loại bỏ COD hòa tan trình xử lý hóa lý nên trình xử lý sinh học thường ưu tiên 2 27 Chính lý trên, đề tài luận án: “Phân lập vi khuẩn kết tụ sinh với dòng LV1 có sục khí giờ/ngày, thời gian ngày Nước thải sau học, khử nitơ, photpho ứng dụng xử lý nước thải nhà máy sữa” thực nhằm tìm dòng vi khuẩn địa có ích tự xử lý đạt loại B (QCVN 24: 2009/BTNMT) quy mô khảo sát 80 lít/mẻ nhiên, đặc biệt vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn có khả chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho (tích lũy polyphotphat [poyP]) chất thải từ trại nuôi bò sữa, nhà máy sữa trạm thu mua sữa, để ứng dụng vào xử lý nước thải nhà máy sữa, góp phần giải vấn đề ô nhiễm môi trường nước thực cần thiết tình hình 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài thực nhằm mục đích tìm dòng vi khuẩn địa gồm vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, vi khuẩn chuyển hóa photpho hiệu từ chất thải lỏng rắn trại chăn nuôi bò sữa số tỉnh Đồng Sông Cửu Long, nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ trạm thu mua sữa thành phố Hồ Chí Minh để ứng dụng vào xử lý nước thải sữa quy mô phòng thí nghiệm, làm sở khoa học cho việc đề xuất quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân lập dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho từ chất thải lỏng rắn trại chăn nuôi bò sữa, trạm thu mua sữa bò tươi nhà máy sữa Kiểm tra khả tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho từ dòng vi khuẩn phân lập được, từ chọn số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, số dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ số dòng vi khuẩn chuyển hóa photpho Định danh dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho chọn phương pháp sinh học phân tử Đánh giá khả xử lý nước thải nhà máy sữa dòng vi khuẩn tổng hợp kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho 5.2 Đề nghị Tiếp tục thử nghiệm thể tích nước thải nhà máy sữa tổng hợp lớn 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 19 mẫu chất thải lỏng rắn, phân lập tổng số 36 dòng vi khuẩn để tuyển chọn dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học tổng số 47 dòng vi khuẩn từ môi trường tối thiểu để tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ phopho Qua trình tuyển chọn, chọn hai dòng vi khuẩn (P11 P14) có khả tạo kết tụ sinh học với hiệu cao; hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (LV1 TR3) có khả oxy hóa ammonnium khử nitrat tốt nồng độ 700 mM; hai dòng vi khuẩn (LV1 LV8b) có khả tích lũy photpho Kết định danh 05 dòng vi khuẩn cho thấy: + dòng P14 dòng P11 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Enterobacter aerogenes dòng CTSP30 16S rDNA (EU855208.1) 99% + dòng vi khuẩn LV1 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Arthrobacter mysorens 16S rRNA dòng LMG 16219T (AJ639831.1), Arthrobacter mysorens dòng DSM 12798 16S rRNA (NR 025613.1) 99% + dòng TR3 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus dòng PVAS6 16S rRNA (GU130530.1), Acinetobacter calcoaceticus 16S rRNA, dòng MTCC:9488 (FM210755.1) 99% + dòng LV8b có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng NY-3 16S rRNA (EU918562.1), Bacillus megaterium dòng EI-6 16S rRNA (FJ613535.1) 99% Qua đánh giá khả tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho 05 dòng vi khuẩn qua tuyển chọn định danh nước thải nhà máy sữa, hai dòng vi khuẩn P11 LV1 chọn để xử lý nước thải nhà máy sữa nhân tạo Qui trình xử lý (bên dưới) gồm bước xử lý kết tụ sinh học nước thải với dòng P11, sau xử lý nitơ, photpho lại nước thải qua tuyển chọn định danh Từ đó, chọn loại vi khuẩn 01 dòng vi khuẩn có khả tạo kết tụ, chuyển hóa nitơ chuyển hóa photpho ưu việt Ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ vi khuẩn chuyển hóa photpho để xử lý nước thải nhà máy sữa quy mô phòng thí nghiệm 1.4 Những đóng góp luận án - Cung cấp thông tin số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho địa có khả kết tụ chất rắn lơ lửng, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho nước thải nhà máy sữa - Đã tuyển chọn 02 dòng vi khuẩn có khả kết tụ sinh học cao P11 P14 (Đồng hình với Enterobacter aerogenes dòng CTSP30); 03 dòng vi khuẩn có khả chuyển hóa nitơ, photpho LV1 (chuyển hóa nitơ photpho, đồng hình với Arthrobacter mysorens dòng LMG 16219T), TR3 (chuyển hóa nitơ, đồng hình với Acinetobacter calcoaceticus dòng PVAS6), LV8b (chuyển hóa photpho, đồng hình với Bacillus megaterium dòng NY-3) Trong đó, dòng P11 LV1 có khả kết hợp để xử lý nước thải nhà máy sữa - Xây dựng quy trình xử lý nước thải nhà máy sữa đường sinh học, có sử dụng kết hợp 01 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (để loại bỏ phần dưỡng chất nước thải công đoạn tiền xử lý thay cho hóa chất có khả gây ô nhiễm thứ cấp) với 01 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ photpho (xử lý hiếu khí lượng nitơ, photpho sót lại nước thải với thời gian sục khí giờ/ngày – thời gian sục khí ngắn so với quy trình xử lý áp dụng Việt Nam 18 20 giờ/ngày) 4 - Đóng góp tư liệu cho giảng dạy nghiên cứu vi sinh vật xử lý nước thải đường sinh học 25 sục khí giờ/ngày có tỷ lệ loại bỏ thành phần N_tổng số, N_NH4+, PO43- tăng, P_tổng số cao 1.5 Cấu trúc luận án Luận án gồm chương mở đầu, tổng quan tài liệu, phương tiện phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận đề nghị; công trình tác giả có nội dung liên quan đến luận án; danh mục tài liệu Trước xử lý tham khảo phần phụ chương Toàn nội dung luận án trình bày 101 trang, 19 hình, 39 bảng 95 tài liệu tham khảo Phần lớn (C) (B) (A) (D) Hình 4.2 Độ đục mẫu nước thải trước sau xử lý nội dung luận án công bố báo khoa học Hình (A) : Trước xử lý Hình (B): Sục khí giờ/ngày, xử lý ngày Hình (C): Sục khí giờ/ngày, xử lý ngày Hình (D): Sục khí giờ/ngày, xử lý ngày CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương trình bày kiến thức tảng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn khử nitơ, vi khuẩn khử photpho trình trình tạo kết tụ sinh học, khử nitơ, photpho nước thải Bên cạnh đó, điểm qua số công trình nghiên cứu Việt Nam giới ứng dụng số hệ thống thiết bị phản ứng sinh học xử lý nước thải nhà máy sữa Qua kết trên, chọn qui trình xử lý có sục khí giờ/ngày để thực xử lý nước thải với thể tích 80 lít Kết sau ngày xử lý (Bảng 4.4) cho thấy tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số, NH4+, PO43-, P_tổng số 79,67%; 55,82%; 58,13%; 76,00%; 83,07%; 82,55% Nước thải sau xử lý đạt loại B Bảng 4.4 Ảnh hưởng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn: 19 mẫu chất thải rắn lỏng (vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học – mẫu; vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho 13 mẫu chất thải) thu nhận từ trại chăn nuôi bò sữa tỉnh, thành Đồng Bằng Sông Cửu Long, trạm thu mua sữa bò tươi TP Hồ Chí Minh nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.21 Địa điểm thời gian nghiên cứu photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4+, PO4 3- P_tổng số nước thải nhà máy sữa tổng hợp [80 lít] sau ngày xử lý, thời gian sục khí giờ/ngày Thời gian (giờ/ngày) Trước xử lý sục khí Chỉ tiêu COD TSS N_tổng NH4+ PO43- P_tổng (mgO2/l) (mg/l) số (mg/l) (mg/l) (mg/l) số (mg/l) 6,82 482,00 36,72 43,49 25,00 13,47 Sau xử lý 98,00 16,23 18,21 6,00 2,28 1,19 Tỷ lệ giảm (%) 79,67 55,82 58,13 76,00 83,07 82,55 24 - Địa điểm thí nghiệm: phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật Sinh học Phân tử, Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ - Thời gian thực đề tài: 01/03/2009 đến 30/06/2011 Đối chứng 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ Đĩa petri, tủ cấy vi sinh vật, máy chạy PCR, Sau xử lý Hình 4.1 Hình ảnh nước thải sau xử lý ngày, sục khí giờ/ngày Khi kéo dài thời gian xử lý từ ngày lên ngày (so sánh kết Bảng 4.2 Bảng 4.3), tỷ lệ loại bỏ COD, TSS, N_tổng số P_tổng số tăng lên (COD từ 73,71% tăng lên 83,54%; TSS từ 52,19% tăng lên 90,16%; N_tổng số từ 42,51% tăng lên 51,57%; P_tổng số từ 31,91% tăng lên 82,40%) Nước thải đầu đạt loại B tất nghiệm thức có sục khí giờ/ngày, giờ/ngày giờ/ngày Sau tăng thời gian xử lý lên ngày, nước thải đầu (không màu) (Hình 4.1 Hình 4.2) Bảng 4.3 Ảnh hưởng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4 +, PO43- P_tổng số nước thải nhà máy sữa tổng hợp sau ngày xử lý, thời gian sục khí 2, 4, giờ/ngày Thời gian sục khí (giờ/ngày) Trước xử lý Sau xử lý Tỷ lệ giảm (%) Trước xử lý 3.2.4 Phân lập vi khuẩn Tiến hành phân lập dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein; phân lập dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho môi trường tối thiểu Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sau phân lập nuôi 50 ml môi trường lỏng (môi trường cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid hay protein ứng với dòng vi khuẩn) Vi khuẩn tạo chất kết tụ sinh học trữ lạnh sử dụng trực tiếp cho COD TSS N_tổng N_NH4+ PO43- P_tổng (mgO2 /l) (mg/l) số (mg/l) (mg/l) (mg/l) số (mg/l) thí nghiệm sau không qua trình ly tâm loại bỏ tế bào vi khuẩn 6,76 3.2.5 Tuyển chọn vi khuẩn 3.2.5.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học: Đánh giá khả kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin thông qua tỷ lệ kết tụ 480,00 79,00 a 36,56 4,50 43,40 c 21,02 a 22,01 11,23 4,96 a 8,34 a 1,19 a 83,54 90,16 51,57 77,46 25,73 82,40 480,00 36,56 43,40 22,01 11,23 6,76 Sau xử lý 70,00 a Tỷ lệ giảm (%) 85,42 81,81 51,57 81,24 480,00 Trước xử lý Chỉ tiêu 3.2.3 Hóa chất Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn, chạy PCR, 6,50 b 21,02 a 4,13 a 36,56 43,40 22,01 Sau xử lý 77,00 a 7,50 a 19,61 b 3,86 Tỷ lệ giảm (%) 83,96 79,49 54,82 82,46 6,82 b 39,27 11,23 b 6,31 43,81 Lấy 90 ml dung dich Kaolin (5 g/l, Kaolin có độ mịn tốt < µm), bổ sung 10 ml dung dịch 1% CaCl2 bình tam giác 250 ml, chỉnh pH 7,0; 1,21 a 81,10 6,76 c 0,84 b 87,57 sau thêm 0,1 ml (0,1%) dung dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, mẫu đối chứng thực tương tự không chủng vi khuẩn sản Và thời gian xử lý ngày, tăng số sục khí ngày xuất chất kết tụ sinh học Khuấy hỗn hợp 30 giây 60 vòng/ phút máy lắc Sau đó, để yên hỗn hợp phút, lấy phần cách mặt từ giờ/ngày lên giờ/ngày, giờ/ngày, tỷ lệ loại bỏ N_tổng số, N_NH4+, PO43- tăng, P_tổng số tăng với thời gian sục khí, nghiệm thức nước ÷ cm đo OD độ dài sóng 550 nm Xác định tỷ lệ kết tụ theo công thức: Tỷ lệ kết tụ (%) = ((OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng) x 100 Các trung bình cột có chữ theo sau khác biệt không ý nghĩa mức α = 0,01 6 Chọn dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao để thực thí nghiệm 3.2.5.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Đem dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường tối thiểu (trong ống trữ giống) cấy ria môi trường tối thiểu có bổ sung 23 xuống đáy) đem xử lý nitơ, photpho lại nước thải với dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ photpho (LV1) thời gian ngày, có sục khí giờ/ngày Kết (Bảng 4.2) cho thấy sau xử lý với dòng P11, hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, P_tổng số, N_NH4 +, PO43- phần phía ammonium (N_NH4 +), nitrit (N_NO2-) nitrat (N_NO3-) dạng hợp chất (NH4Cl, NaNO2, NaNO3) qua nồng độ tăng dần (100, 200, 300, 400, giảm phần so với ban đầu Lấy phần nước phía để xử lý tiếp tục với dòng LV1 ngày, hàm lượng COD, TSS, N_tổng 500, 600 700 mM) nhằm kiểm tra khả oxi hóa ammonium khử nitrat, khử nitrit dòng vi khuẩn Chọn dòng vi khuẩn có khả số, N_NH4 +, PO4 3-, P_tổng số nước thải 127 mg O2/l; 17,45 mg/l; 24,98 mg/l; 3,15 mg/l; 2,14 mg/l; 4,63 mg/l Nước thải sau xử oxi hóa N_NH4+ khử N_NO3 - cao để thực thí nghiệm lý có màu nâu đỏ nhạt (Hình 4.1), chứng tỏ sinh khối vi khuẩn lơ lửng nước thải sau xử lý Vì cần nghiên cứu biện pháp bổ sung để nước thải đầu đạt loại B theo mục tiêu đề 3.2.5.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho Đem dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường tối thiểu (trong ống trữ giống) cấy ria môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho có bổ sung 2% agar, chọn dòng có khả phát triển môi trường Để kiểm tra nhanh khả hình thành poly-P dòng vi khuẩn phát triển môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho, dòng vi khuẩn cấy môi trường lân khó tan với chất thị pH (Bromothymol blue 0,5%), quan sát đợt, đợt ngày, lặp lại lần (không phát triển phát triển không hòa tan lân (không tạo vòng halo) môi trường lân khó tan) Đồng thời, dòng vi khuẩn nuôi môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho (lỏng) 15 ngày máy lắc xoay vòng (150 vòng/phút) để kiểm tra hình thành poly-P dòng vi khuẩn Sau đó, đo hàm lượng poly-P dung dịch vi khuẩn phòng thí nghiệm Chuyên sâu, trường Đại học Cần Thơ Chọn 02 dòng vi khuẩn có khả tích lũy poly-P (01 dòng có poly-P cao 01 dòng có poly-P thấp nhất) để thực thí nghiệm Bảng 4.2 Ảnh hưởng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ photpho đến hàm lượng COD, TSS, N_tổng số, N_NH4+, PO4 3- P_tổng số nước thải nhà máy sữa tổng hợp sau ngày, sục khí giờ/ngày Chỉ tiêu Kết sau ngày xử lý COD TSS N_tổng số N_NH4+ PO43 (mgO2/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) P_tổng số (mg/l) Trước xử lý 483,00 36,50 43,45 22,72 11,89 Sau xử lý kết tụ (P11) 286,00 16,50 36,43 21,86 2,11 5,95 Tỷ lệ giảm (%) 40,80 54,79 16,16 3,80 82,25 12,50 Sau xử lý nitơ, photpho(LV1) 127,00 17,45 24,98 3,15 2,14 4,63 Tỷ lệ giảm chung (%) 73,71 52,19 42,51 86,14 82,00 31,91 6,80 Chính lý trên, tiến hành xử lý nước thải theo qui trình kéo dài thới gian xử lý công đoạn xử lý nitơ photpho từ ngày lên ngày tăng thời gian sục khí từ giờ/ngày lên giờ/ngày, giờ/ngày, sau đánh giá hiệu xử lý dòng vi 22 Qua kết thí nghiệm cho thấy khả xử lý PO43- (tích lũy poly-P) nước thải nhân tạo dòng vi khuẩn tốt điều kiện có sục khí giờ/ngày, đặc biệt dòng vi khuẩn LV1 thời gian xử lý ngày có khả loại bỏ photpho hòa tan nước thải 3.2.6 Định danh vi khuẩn phương pháp phân tích trình tự 16S rDNA Được thực qua giai đoạn gồm ly trích DNA vi khuẩn, thực ii Kết xử lý photpho dòng vi khuẩn nước thải nhà phản ứng PCR để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, điện di sản phẩm PCR agrose gel, nhận diện vi khuẩn phương pháp giải trình tự máy sữa tổng hợp Sử dụng hai dòng vi khuẩn LV1, LV8b để xử lý photpho nước thải đoạn DNA có sử dụng chương trình BLASTn để so sánh trình tự đoạn DNA dòng vi khuẩn với trình tự DNA loài vi khuẩn có ngân nhà máy sữa tổng hợp có bổ sung ÷ 11 mg/l điều kiện xử lý có sục khí giờ/ngày Đồng thời tiến hành bố trí nghiệm thức kết hợp hai dòng hàng liệu NCBI vi khuẩn LV1+LV8b, Đối chứng để xử lý photpho nước thải nhà máy sữa tổng hợp Sau ngày xử lý, hàm lượng PO4 3- nước thải giảm xuống so với ban đầu 11,96 mg/l tất nghiệm thức Trong đó, nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1 giảm xuống nhiều (3,96 mg/l), sau 3.2.7 Đánh giá khả tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, đến nghiệm thức bổ sung LV1+LV8 (4,02 mg/l), LV8b (4,11 mg/l) Trong nghiệm thức đối chứng mức cao (9,62 mg/l) Tỷ lệ loại bỏ photpho tổng số nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1, LV8b, LV1+LV8b 26,34%, 23,81%, 24,26%, nghiệm thức 3.2.7.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học i Khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên hiệu kết tụ * pH ban đầu môi trường: Nhằm xác định giá trị pH thích hợp để vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học chọn thí nghiệm trước cho đối chứng đạt 7,30% Dòng vi khuẩn LV1 chọn để xử lý nước thải điều kiện có sục hiệu kết tụ cao Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (pH với mức 4,0; 5,0; 6,0; khí giờ/ngày cho thí nghiệm 7,0; 8,0 9,0), bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : x = 18 4.5 Kết ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ chuyển hóa photpho qua tuyển chọn định danh nước thải nhà máy sữa Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu kết tụ sau: - Lấy bình tam giác 250 ml, cho vào bình gồm: 90 ml dung dịch sinh học, chuyển hóa nitơ, photpho vào xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp Ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (dòng P11) dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ photpho (dòng LV1) vào Kaolin (5 g/l) + 10 ml (1 g/l) dung dịch CaCl2 - Điều chỉnh pH bình giá trị pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 9,0 xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp Nước thải nhà máy sữa tổng hợp chỉnh pH 9,0; bổ sung dung dịch muối CaCl2 (1%) 0,1% dung dung dịch HCl hay NaOH - Cho vào bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học (P11), sau khuấy phút để yên 30 phút Lấy phần nước bên [3 lít] (bỏ phần lắng 109 CFU/ml) Mẫu đối chứng thực tương tự không chủng vi khuẩn 8 21 Trong điều kiện xử lý sục khí, hàm lượng PO4 3- nước - Lắc máy lắc 60 vòng/phút 30 giây - Để yên phút - Lấy phần cách mặt nước ÷ cm đem đo OD550nm thải giảm dần theo thời gian xử lý tất nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn So sánh trình xử lý điều kiện có sục khí sục - Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức mục 3.2.2.1 * Các muối kim loại (ion kim loại) bổ sung vào môi trường: Nhằm khí cho thấy hàm lượng PO43- giảm nhiều điều kiện xử lý có sục khí nghiệm thức bổ sung vi khuẩn xác định muối kim loại bổ sung vào môi trường để vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học chọn thí nghiệm trước cho hiệu cao Đo hàm lượng poly-P nước thải nhân tạo sau ngày xử lý, sục khí giờ/ngày, kết cho thấy hai dòng vi khuẩn LV1 LV8b có khả Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (Muối kim loại bổ sung gồm KCl, NaCl, CaCl2, MgSO4, MnSO4 , FeCl3), bố trí theo thể thức hoàn tích lũy lượng poly-P cao môi trường, nghiệm thức có chủng vi khuẩn vào nước thải có hàm lượng poly-P gần tương đương cao toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : x = 18 Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu kết tụ sau: - Lấy bình tam giác loại 250 ml, cho vào bình gồm: 90 ml Kaolin (5 g/l) + 10 ml dung dịch % loại muối nhiều so với nghiệm thức đối chứng (LV1 – 26,75 mg/l; LV8b – 26,31 mg/l; LV1 + LV8b – 25,56 mg/l; Đối chứng – 7,87 mg/l) - Điều chỉnh pH tối ưu theo kết - Cho vào bình 0,1 ml (0,1 %) dung dịch vi khuẩn (mật số lớn Bảng 4.1 Ảnh hưởng vi khuẩn sục khí đến hàm lượng PO43- (mg/l) nước thải nhân tạo theo thời gian Sục Khí - Lấy phần cách mặt nước ÷ cm đem đo OD550nm - Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức mục 3.2.2.1 Trung bình Vi khuẩn Ngày Ngày Ngày Ngày LV1 9,82 7,57 2,67 1,10 5,29 a LV8b 9,39 6,50 4,19 3,42 5,88 LV1+LV8b 9,49 5,60 3,58 2,37 5,26 a Đối chứng 11,90 11,14 11,58 10,66 11,32 10,15 7,70 5,51 4,39 LV1 10,76 7,91 5,28 4,88 7,21 LV8b 10,39 7,95 5,30 5,81 7,36 LV1+LV8b 10,19 7,56 5,04 5,41 7,05 Đối chứng 11,90 11,11 11,58 10,65 11,31 10,81 8,63 6,80 6,69 10,48 d 8,17 c 6,15 b 5,54 a Trung bình thời gian (có sục) b e Không * Tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sử dụng : Nhằm xác định tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học chọn thí nghiệm trước cho hiệu kết tụ cao Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (Tỷ lệ giống vi khuẩn Trung bình thời nồng độ 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 %), bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Tổng số nghiệm thức : x = 18 Trung bình chung Thời gian Thực hiện: Qui trình kiểm tra hiệu kết tụ sau: Thời gian Có 109 CFU/ml) Mẫu đối chứng thực tương tự không chủng vi khuẩn - Lắc máy lắc 60 vòng/phút 30 giây - Để yên phút Vi khuẩn gian (không sục) cd d c e Các trung bình hàng cột có chữ theo sau khác biệt không ý nghĩa mức α = 0,01 CV = 2,87%, LSD0.01 –Thời gian = 0,17; LSD0.01 –Vi khuẩn (có không sục khí) = 0,24 20 N_NH4+ ban đầu lên 30, 40 mg/l, tăng thời gian xử lý lên ngày hàm + lượng N_NH4 nước thải giảm xuống mức 10 mg/l - Lấy bình tam giác loại 250 ml, cho vào cốc gồm: 90 ml dung ii Kết xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp hai dòng vi dịch Kaolin (5 g/l) + 10 ml dung dịch % CaCl2 - Điều chỉnh pH muối kim loại tối ưu theo kết khuẩn LV1 TR3 Đánh giá khả xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp với nồng độ - Cho dung dịch vi khuẩn vào bình với tỷ lệ giống vi khuẩn khác nhau, tỉ lệ 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1% (mật số lớn N_NH4+ ban đầu 20 ÷ 25 mg/l hai dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ LV1 TR3 Kết cho thấy, nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn LV1, 109 CFU/ml) Mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn - Lắc 60 vòng/phút 30 giây TR3, LV1 + TR3 có khả làm giảm nồng độ N_NH4+ đáng kể Sau ngày xử lý, hàm lượng N_NH4+ nước thải nghiệm thức bổ sung - Để yên phút - Lấy phần cách mặt nước ÷ cm đem đo OD550nm vi khuẩn LV1, TR3, LV1+TR3 mg/l (loại A), riêng nghiệm thức đối chứng mức cao (16,9 mg/) Tỷ lệ loại bỏ COD hai dòng vi khuẩn LV1 TR3 27,63% cao kết hợp hai dòng vi khuẩn LV1+TR3 (11,80%) thấp mẫu đối chứng (34,21%) Trong - Tính tỷ lệ kết tụ theo công thức mục 3.2.2.1 * Nguồn cacbon, nitơ muối khoáng vô bổ sung vào dịch nuôi vi khuẩn: Nhằm chọn môi trường có bổ sung nguồn cacbon, nitơ muối khoáng vô dùng để nuôi vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học đó, tỷ lệ loại bỏ NO3- dòng vi khuẩn LV1, TR3 LV1+TR3 cao (>99%), đặc biệt dòng LV1 (không phát hiện), chứng tỏ hai dòng vi chọn thí nghiệm trước cho hiệu kết tụ cao Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (Các loại môi trường nuôi vi khuẩn có khả khử nitrat tốt Tỷ lệ loại bỏ N_tổng số nghiệm thức bổ sung vi khuẩn LV1 cao (42,03%) so với nghiệm thức khuẩn), bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại Tổng số 48 nghiệm thức: nghiệm thức cacbon x nghiệm thức nitơ x lại nghiệm thức muối khoáng vô = 48 Thực hiện: Qui trình nuôi vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Dòng vi khuẩn LV1 chọn để để thực thí nghiệm 4.4.3 Khả chuyển hóa photpho hai dòng vi khuẩn LV1 LV8b kiểm tra hiệu kết tụ sau: - Tiến hành pha môi trường với phối hợp ba nguồn cacbon, nitơ i Khả chuyển hóa photpho nước thải nhân tạo hai dòng vi khuẩn LV1 LV8b Kết (Bảng 4.1) cho thấy: Trong điều kiện xử lý có sục khí giờ/ngày, cần ngày xử lý, hàm lượng PO43- nước thải nghiệm muối khoáng vô 48 nghiệm thức khác - Nuôi vi khuẩn ống nghiệm loại 10 ml nhiệt độ phòng (270C), thức có bổ sung vi khuẩn LV1 giảm xuống 2,67 mg/l Và sau ngày xử lý, hàm lượng PO43- nước thải tất nghiệm thức có bổ sung vi kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin cách đo OD550nm, sau tính tỷ lệ kết tụ theo công thức mục 3.2.2.1 khuẩn giảm xuống nhiều so với nghiệm thức đối chứng (10, 65 mg/l) ii So sánh khả kết tụ dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học: Phối hợp điều kiện tìm thí nghiệm 3.2.5.1-i để tối lắc máy lắc 150 vòng/phút - Sau ngày (mật số lớn 109 tế bào/ml), kiểm tra hiệu 10 19 ưu khả tạo kết tụ dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 (9,05 log10CFU/ml), chứng tỏ dòng P14 có tốc độ tăng trưởng phát chọn, từ so sánh hiệu kết tụ dòng vi khuẩn Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm triển cao dòng P11 Tỷ lệ kết tụ hai dòng vi khuẩn P11 P14 95,62% 95,94% (tỷ lệ kết tụ dòng P14 cao dòng P11 nghiệm thức dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học chọn thí nghiệm trước, lần lặp lại không đáng kể) Như vậy, xét mật số vi khuẩn dòng P14 không cho hiệu kết tụ cao dòng P11 Qui trình thực hiện: Nuôi dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học chọn 100 ml môi trường lỏng có nguồn cacbon, nitơ iii Kết xử lý nước thải nhà máy sữa hai dòng vi khuẩn P11 P14 Mặc dù sử dụng thông số tối ưu hai dòng vi khuẩn P11 P14 để xử lý nước thải nhà máy sữa cho kết không tốt Qua kiểm khoáng vô chọn phần trên, lắc máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng (270C), nuôi ngày Xác định mật số vi khuẩn phương pháp đếm sống nhỏ giọt để so sánh mật số dòng vi khuẩn Sau kiểm tra khả kết tụ với dung dịch Kaolin điều kiện pH, liều lượng, ion kim loại bổ sung xác định thí nghiệm phần iii Đánh giá khả xử lý nước thải nhà máy sữa dòng vi tra cho thấy, pH nước thải yếu tố ảnh hưởng nhiều đến khả kết tụ vi khuẩn Tiến hành thí nghiệm có điều chỉnh lại giá trị pH ban đầu từ 5,0 đến 9,0 Kết cho thấy hai dòng vi khuẩn P11 P14 có hoạt tính kết tụ thấp pH = 7,0 (P11 - 20,75% P14 - 21,32%) cao khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm pH = 9,0 (P11 -56,79% P14 - 45,28%) Sử dụng thông số tối ưu cho dòng vi khuẩn P11 P14 vào nghiệm thức theo dòng vi khuẩn với lần lặp lại Qui trình thực : trình xử lý nước thải sữa Kết cho thấy dòng P11 làm giảm COD TSS 44,44% 58,98% Dòng P14 làm giảm COD TSS lần - Cho vào cốc loại lít: 475 ml nước thải nhà máy sữa 25 ml dung dịch muối kim loại (1%) từ kết thí nghiệm trước lượt 33,33% 28,07% Như vậy, dòng P11 cho hiệu cao dòng P14 mật số dòng vi khuẩn P11 thấp dòng P14 đến 3,9 lần - Điều chỉnh pH tối ưu, bổ sung dung dịch vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học theo kết thí nghiệm trước Dòng P11 chọn để thực thí nghiệm - Lắc 200 vòng/phút phút, lắc tiếp 60 vòng/phút phút Sau để yên 30 phút Lấy phần đo tiêu TSS (Tổng số chất rắn lơ i Kết xử lý N_NH4+ nước thải nhà máy sữa tổng hợp hai dòng vi khuẩn LV1 TR3 Nghiên cứu thực nhằm mục đích đánh giá khả xử lý N_NH4+ nước thải nhà máy sữa tổng hợp nồng độ ban đầu 20, lửng) COD (Nhu cầu oxi hóa học) 3.2.7.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Vì việc thu nhận nước thải nhà máy sữa để thí nghiệm (thực nhiều lần, số lượng lớn) gặp nhiều khó khăn (vì lý an ninh, trị, sản xuất kinh doanh, doanh nghiệp); trình nghiên cứu thành công khả xử lý nước thải nhà máy sữa dòng vi khuẩn chọn, 4.4.2 Khả chuyển hóa nitơ hai dòng vi khuẩn LV1 TR3 30 40 mg/l Kết cho thấy khả xử lý N_NH4+ nước thải nhà máy sữa tổng hợp nồng độ ban đầu 20 mg/l hai dòng vi khuẩn LV1 TR3 tốt, nồng độ N_NH4+ ban đầu 20 mg/l giảm xuống mg/l (đạt loại A, QCVN 24: 2009/TNMT) sau ngày Khi tăng nồng độ 18 11 Kết kiểm tra cho thấy dòng vi khuẩn P11có tỷ lệ kết tụ cao thật cần thiết có loại nước thải nhà máy sữa có tính pH 4,0 (95,61%), dòng vi khuẩn P14 cho tỷ lệ kết tụ cao pH 6,0 (95,63%) Như vậy, giá trị pH chọn 4,0 (P11) 6,0 (P14) chất ổn định Chính lý đó, loại nước thải nhà máy sữa tổng hợp (thành phần trình bày Bảng 3.1 – có thành phần gần giống với nước thải thật) • Ảnh hưởng muối kim loại bổ sung vào môi trường đến khả kết tụ Kết cho thấy bổ sung muối CaCl2 vào dung dịch, hai dòng vi khuẩn P11 P14 cho tỷ lệ kết tụ cao (P11 - 96,03% P14 - tạo dựa tài liệu Environment protection Authority State Government of Victoria (1997), Gutiérrez ctv (2005) đặc tính 95,27%) Như vậy, chọn muối CaCl2 làm chất bổ sung vào dung dịch để hỗ trợ trình kết tụ cho dòng vi khuẩn thí nghiệm trở sau Nhân nuôi dòng dòng vi khuẩn chọn thí nghiệm 3.2.2.2 • Ảnh hưởng tỷ lệ giống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học đến hiệu kết tụ sinh học Cả hai dòng vi khuẩn cho hiệu kết tụ cao tỷ lệ giống vi khuẩn 0,1% (P11- 95,70%; P14 – 95,12%) Vậy, chọn tỷ lệ giống vi môi trường BM/NO3- khử trùng bình tam giác 250 ml đặt máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) nhiệt độ phòng (25 ÷ 270C) Sau 24 ÷ 36 giờ, mật số vi khuẩn bình đạt lớn 109 tế bào/ml sử dụng cho thí nghiệm khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học sử dụng hai dòng vi khuẩn P11 P14 0,1% để thực thí nghiệm Bảng 3.1 Thành phần nước thải nhà máy sữa tổng hợp (tính cho lít nước thải) • Ảnh hưởng nguồn cacbon, nitơ khoáng vô lên phát triển vi khuẩn Khi nuôi hai dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 P11 môi trường có nguồn cacbon glucose; nguồn nitơ chất glutamat, yeast, ure nguồn khoáng vô K2HPO4 (0,5%) + KH2PO4 (0,2%) cho tỷ lệ kết tụ cao (P11 – 95,60%; P14 - 96,12%) Như vậy, nguồn cacbon, nitơ khoáng vô thích hợp để nuôi hai dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 P14 cho tỷ lệ kết tụ sinh học cao glucose, glutamate K2HPO4 + KH2PO4 ii Kết so sánh hiệu kết tụ sinh học dòng vi khuẩn P11 P14 Phối hợp điều kiện tối ưu cho kết tụ hai dòng vi khuẩn P11 P14 kiểm tra hiệu kết tụ với dung dịch Kaolin Kết cho thấy mật số vi khuẩn dòng P14 (9,58 log10CFU/ml) cao gấp 3,19 lần so với dòng nước thải nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ Sử dụng nước thải nhà máy sữa tổng hợp để thực loạt thí nghiệm từ nội dung nghiên cứu Hóa chất Số lượng Sữa tươi 100% vinamilk có đường 2,5 g/l NaNO3 0,11 g/l Nước cất 997,39 ml Ghi chú: Kết phân tích tiêu (chất rắn lơ lửng, COD, nitơ tổng số, photpho tổng số, NH4+, PO43-, NO3-, pH) nước thải tổng hợp thể phần Kết Thảo luận i Đánh giá khả xử lý N_NH4 + nước thải nhà máy sữa tổng hợp Mục đích: Khảo sát khả xử lý N_NH4+ nước thải nhà máy sữa tổng hợp với nồng độ ban đầu 20, 30 40 mg/l dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ chọn thí nghiệm 3.2.2.2 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (vi khuẩn, thời gian) bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lần lặp lại Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp đo nồng độ N_NH4 + nước thải, sau bổ sung NH4Cl để đạt nồng độ khoảng 20, 30, 40 mg/l Sau đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào chai PET [500 ml] với thể tích 400 ml/chai Chủng 5% dịch vi khuẩn vào 12 17 chai PET chứa nước thải, lắc để điều kiện tự nhiên Các dòng vi khuẩn phân lập tiếp tục cấy môi trường nuôi phòng thí nghiệm Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn Ghi nhận kết quả: nồng độ N_NH4+ nước thải xử lý ngày cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho kiểm tra hình thành poly-P, kết chọn hai dòng vi khuẩn LV8b (poly-P dung dịch cao [11,61 đạt tiêu chuẩn nước thải loại A (QCVN 24: 2009/BTNMT) mg/l]) LV1 (poly-P dung dịch thấp [- 5,98 mg/l]) để thực thí nghiệm sau ii Đánh giá khả xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp Mục đích: Nhằm xác định khả xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp với nồng độ N_NH4+ ban đầu 20 ÷ 25 mg/l dòng vi khuẩn 4.3 Định danh vi khuẩn Tiến hành nhận diện 05 dòng vi khuẩn (P11, P14, LV1, LV8b, TR3) chuyển hóa nitơ chọn thí nghiệm 3.2.2.2, từ chọn dòng vi khuẩn tốt để thực thí nghiệm chọn phương pháp 16S rDNA Kết cho thấy: Hai dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P14 P11 có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (vi khuẩn thời gian) bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lần lặp lại Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp đo nồng độ N_NH4 + nước thải, sau bổ sung NH4Cl để đạt nồng độ khoảng 20 ÷ 25 Enterobacter aerogenes dòng CTSP30 16S rDNA (EU855208.1) 99%; Dòng vi khuẩn LV1 (chuyển hóa nitơ, photpho) có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Arthrobacter mysorens 16S rRNA dòng LMG 16219T (AJ639831.1), Arthrobacter mysorens dòng DSM 12798 16S rRNA (NR mg/l Sau đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào keo nhựa [7 lít] với thể tích lít/keo Chủng 5% dịch vi khuẩn vào keo 025613.1) 99%; Dòng vi khuẩn TR3 (chuyển hóa nitơ) có tỷ lệ tương đồng với vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus dòng PVAS6 16S rRNA chứa nước thải, dùng đũa thủy tinh khuấy phút để điều kiện tự nhiên phòng thí nghiệm Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn Ghi nhận kết quả: nồng độ N_NH4 + khuẩn nước thải xử lý (GU130530.1), Acinetobacter calcoaceticus 16S rRNA, dòng MTCC:9488 (FM210755.1) 99%; Dòng vi khuẩn LV8b (chuyển hóa photpho) có tỷ lệ ngày xử lý COD, N_NO3-, N_tổng số nước thải trước sau xử lý 99% 3.2.7.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho Ở phần này, loạt thí nghiệm thực nhằm đánh giá khả 4.4 Kết kiểm tra khả tạo kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho dòng vi khuẩn tích lũy poly-P chọn thí nghiệm 3.2.2.3 nước thải nhân tạo (thành phần nước thải nhân tạo môi trường nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa photpho dạng lỏng) nước thải nhà máy sữa tổng hợp có bổ sung KH2PO4 để nồng độ PO43- đạt khoảng ÷ 11 mg/l, từ chọn dòng tốt để thực thí nghiệm Nhân nuôi mật số dòng vi khuẩn chọn thí nghiệm 3.2.2.3 - môi trường BM/NO3 khử trùng bình tam giác 250 ml đặt tương đồng với vi khuẩn Bacillus megaterium dòng NY-3 16S rRNA (EU918562.1), Bacillus megaterium dòng EI-6 16S rRNA (FJ613535.1) photpho dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho qua tuyển chọn định danh nước thải nhà máy sữa 4.4.1 Khả tạo kết tụ sinh học hai dòng vi khuẩn P11 P14 i Kết khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên hiệu kết tụ hai dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học P11 P14 • Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường đến khả kết tụ 16 13 4.1.2 Phân lập vi khuẩn từ môi trường tối thiểu để chọn lọc vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho Từ 13 mẫu chất thải rắn nước thải (11 mẫu nước, mẫu rắn) máy lắc (tốc độ 150 vòng/phút) nhiệt độ phòng (25 ÷ 270C) đến chuồng bò số tỉnh, thành phố Đồng Bằng Sông Cửu Long, nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ trạm thu mua sữa TP.HCM phân lập 24 sử dụng cho thí nghiệm 47 dòng vi khuẩn môi trường tối thiểu VC7b, VC8b, VC17a, VC17b, VC17c, VC18, VC19, VC21, VC22, VC33, VC36, PR1b, PR4, PR5, PR6, chuyển hóa photpho môi trường nước thải nhân tạo Mục đích: Nhằm đánh giá khả tích lũy poly-P dòng vi PR7a, PR7b, PR7c, PL1a, PL3a, PL6a, PL6b, LV1, LV2a1, LV2a2, LV3, LV4a, LV5, LV8b, OM4, OM5, OM6, OM10, OM12, OM13, BT1, BT2, khuẩn tích lũy poly-P chọn thí nghiệm 3.2.2.3 nước thải nhân tạo điều kiện xử lý có sục khí [2 giờ/ngày] sục khí BT3, BT5, BT12, SL3, SL5, SL8, 3b4b, 3b7b, TR2, TR3 Đa số khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập có dạng tròn, màu trắng đục, mô, bìa nguyên, kích thước 0,2 ÷ 2,0 mm bảo quản 0C thường phát triển đặc tính nhầy Hầu hết 47 dòng phát triển môi trường tối thiểu có hình Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (vi khuẩn, sục khí thời gian) bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lần lặp lại Thực hiện: Pha nước thải nhân tạo, sau bổ sung KH2PO4 để nồng độ PO43- đạt ÷ 11 mg/l Cho nước thải vào keo nhựa [5 lít], lít nước que ngắn, có khả chuyển động 4.2 Tuyển chọn vi khuẩn thải/keo Bổ sung vi khuẩn vào keo chứa nước thải với liều lượng 5% (kết hợp hai dòng vi khuẩn dòng chủng 2,5%), dùng đũa thủy 4.2.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Qua trình kiểm tra khả kết tụ 36 dòng vi khuẩn tổng hợp tinh khuấy phút để điều kiện tự nhiên phòng thí nghiệm Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn Thời gian sục khí chất kết tụ sinh học với dung dịch Kaolin, chọn dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao P11 (tỷ lệ kết tụ 81,79%) P14 (tỷ lệ kết tụ 83,86%) giờ/ngày, lưu lượng khí bình khoảng 10 lít/phút Ghi nhận kết quả: nồng độ PO43- nước thải xử lý ngày để thực thí nghiệm xử lý, đo hàm lượng poly-P nước thải sau xử lý 4.2.2 Vi khuẩn chuyển hóa nitơ Kết kiểm tra cho thấy đa số dòng vi khuẩn khả phát triển phát triển yếu môi trường có bổ sung nitrit Ở nồng ii Đánh giá khả xử lý photpho nước thải nhà máy sữa tổng độ 700 mM (N_NH4+, N_NO3 -), có 04/47 dòng (PR7b, LV1, OM5, TR3) phát triển hai môi trường, dòng LV1 TR3 có khả máy sữa tổng hợp với nồng độ PO43- ban đầu ÷ 11 mg/l dòng vi khuẩn chọn thí nghiệm 3.2.2.3, từ chọn dòng vi khuẩn tốt khử nitrat mạnh Chọn dòng LV1 TR3 để thực thí nghiệm để thực thí nghiệm Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm nhân tố (vi khuẩn thời gian), lần 4.2.3 Vi khuẩn chuyển hóa photpho lặp lại đạt mật số lớn 109 tế bào/ml (khoảng 48 giờ), sau ly tâm lạnh lấy sinh khối chuyển sang môi trường tối thiểu nhân nuôi tiếp i Đánh giá khả chuyển hóa photpho dòng vi khuẩn hợp dòng vi khuẩn chuyển hóa photpho Mục đích: Nhằm đánh giá khả xử lý photpho nước thải nhà 14 15 Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp đo nồng độ PO433- (3 lít) để tiếp tục xử lý nitơ, photpho lại nước thải (phần nước thải, sau bổ sung thêm KH2PO4 để nồng độ PO4 đạt ÷ 11 mg/l Sau đo pH, lấy mẫu đếm mật số, tiến hành cho nước thải vào phía trên) Bổ sung vi khuẩn chuyển hóa nitơ, photpho để xử lý nitơ, photpho điều kiện xử lý tìm thí nghiệm trước Xác định keo nhựa tích lít với thể tích lít/keo Chủng 5% dịch vi khuẩn vào keo nhựa chứa nước thải, dùng đũa thủy tinh khuấy phút COD, TSS, N_ tổng số, P_tổng số nước thải trước sau xử lý Sau chọn 01 qui trình xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp, để điều kiện tự nhiên phòng thí nghiệm Tiến hành xử lý nước thải với điều kiện xử lý (có sục khí giờ/ngày sục khí) tiến hành bố trí thí nghiệm xử lý nước thải nhà máy sữa tổng hợp qui mô lớn chọn thí nghiệm 3.2.5.3-i Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn 3.3 Phân tích mẫu xử lý số liệu Mẫu đem xác định tiêu gồm COD, TSS, N_tổng số, P_tổng số, Ghi nhận kết quả: nồng độ PO43- nước thải xử lý ngày xử lý, đo hàm lượng photpho tổng số nước thải trước sau xử lý 3.2.8 Ứng dụng kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ, chuyển hóa photpho tốt để xử lý nước thải poly-P bảo quản lạnh, gởi kiểm mẫu phòng thí nghiệm Chuyên sâu – Trường Đại học Cần Thơ Trung tâm Kỹ Thuật Ứng Dụng Công Nghệ Đường 3/2 – Quận Ninh Kiều - Thành phố Cần Thơ Tất thí nghiệm thực với lần lặp lại, số liệu xử lý nhà máy sữa tổng hợp Mục đích: Nhằm tìm qui trình xử lý nước thải nhà máy sữa qui thống kê phần mềm Excel, phân tích phương sai (ANOVA) để tính khác biệt có nghĩa sử dụng LSD mức độ 1% (LSD0.01), vẽ đồ thị mô phòng thí nghiệm dựa kết hợp dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ vi khuẩn chuyển hóa CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN photpho chọn từ thí nghiệm trước Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, lần lặp Thực hiện: Pha nước thải nhà máy sữa tổng hợp, đo nồng độ N_NH4+, 4.1 Phân lập vi khuẩn 4.1.1 Vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học Từ 06 mẫu chất thải sữa từ trại bò sữa Đồng Sông Cửu Long, Nhà máy sữa Vinamilk Cần Thơ trạm thu mua sữa thành phố Hồ Chí PO43- nước thải sử dụng NH4Cl, KH2PO4 để điều chỉnh nồng độ N_NH4+ 20 ÷ 25 mg/l, nồng độ PO43- ÷ 11 mg/l Sau đo pH, Minh, phân lập 36 dòng vi khuẩn có khả tổng hợp chất kết tụ sinh học, 17 dòng vi khuẩn từ môi trường phân lập vi khuẩn tổng nồng độ N_NH4+, PO43-, tiến hành điều chỉnh pH nước thải theo thí nghiệm trước cho nước thải sữa vào keo nhựa (7 lít), keo nhựa chứa lít hợp chất kết tụ sinh học polysaccharid (T1, T2, T3, T5, T6, T12, T14, T15, T19, T7, T10, T11, T20, T21, T22, T23, T25) 19 dòng vi khuẩn từ môi nước nước thải Sau đó, bổ sung muối kim loại theo thí nghiệm trước vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, dùng đũa thủy tinh khuấy hỗn hợp trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein (P1, P2, P3, P4 P5, P6, P11, P14, P15, P18, P7, P8, P9, P10, P19, P20, P21, P22, P26) phút Để yên hỗn hợp 30 phút Lấy mẫu nước thải phần phía để xác định tiêu Loại bỏ phần cặn lắng lấy phần phía Đa số khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, bìa nguyên, bề mặt trơn, nhầy, ướt mô Có khác biệt độ nhầy khuẩn lạc