PHÂN LẬP VI KHUẨN HÒA TAN KALI TRONG ĐẤT

Đề nghị sử dụng hai dòng vi khuẩn trên làm phân bón vi sinh góp phần hòa tan kali bị cố định trong đất cho cây trồng hấp thu.. Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học, người ta

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC

PGS.TS CAO NGỌC ĐIỆP QUANG THỊ CHI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP CÔNG NGHỆ SINH HỌC K31

MSSV: 3052809

Cần Thơ 6/2009

Tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp không chỉ với những cố gắng và nỗ lực của của riêng tôi, mà tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Khoa Khoa Học, Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu, nâng cao trình độ trong những năm qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn, Tiến sĩ Cao Ngọc Điệp

đã hướng dẫn, dìu dắt và cho tôi những lời khuyên quý báo trong suốt thời gian học cũng như khi tiến hành thí nghiệm và viết luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang, anh

Võ Văn Phước Quệ và các anh chị học viên cao học đang làm đề tài trong phòng Vi sinh vật đất thuộc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học về sự quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài Tôi xin được gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cố vấn học tập, quí thầy cô trong Khoa Khoa Học, quí thầy cô trong Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt bốn năm qua

Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học khóa 31 đã cùng tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Ba mẹ ơi, mặt dù ba mẹ không nói ra nhưng con vẫn biết ba mẹ đã phải khó khăn, vất vã thật nhiều để cho con được đến trường, được học tập như tất cả các bạn khác Để con có được như ngày hôm nay cũng là nhờ ba mẹ, ba mẹ ơi con cám ơn ba

mẹ thật nhiều

Mười sáu dòng vi khuẩn được phân lập từ đất vùng rễ cây một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ trên môi trường có bổ sung Kaolinite (có chứa kali không hòa tan) Các dòng vi khuẩn đều có khuẩn lạc dạng bìa nguyên, hình que, có khả năng chuyển động và hòa tan được kali khó tan trong Kaolinite Kết quả ghi nhận hai dòng vi khuẩn (1B, ĐL) có lượng kali hòa tan tốt nhất sau 6 ngày nuôi Dòng vi khuẩn ĐL (Đà Lạt- LĐ) có mật số log10(8,85)/lit, nồng độ kali hòa tan 38,53 mg/lit, dòng vi khuẩn 1B (Q.Bình Thủy- CT) đạt mật số log10(6,73)/lit, nồng độ kali hòa tan 23,05 mg/lit sau 6 ngày ủ trên máy lắc Đề nghị sử dụng hai dòng vi khuẩn trên làm phân bón vi sinh góp phần hòa tan kali bị cố định trong đất cho cây trồng hấp thu

Từ khóa: Vi khuẩn hòa tan kali, đất vùng rễ, phân vi sinh, Kaolinite, mật số vi khuẩn

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 3

DANH SÁCH BẢNG 5

DANH SÁCH HÌNH 6

Chương 1: Giới thiệu 7

1 Đặt vấn đề 7

2 Mục tiêu đề tài 7

Chương 2: Lược khảo tài liệu 8

Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh 8

1 Giới thiệu chung về kali 9

2 Hàm lượng và các dạng kali trong đất 10

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định kali trong đất 10

4 Ảnh hưởng của kali đối với cây trồng 11

5 Điạ điểm thu mẫu Error! Bookmark not defined. 6 Vi khuẩn chuyển hóa kali 13

7 Các nghiên cứu về vi khuẩn hòa tan kali 14

Chương 3: Phương tiện – phương pháp 15

1 Địa điểm và thời gian: 15

a Địa điểm: 15

b Thời gian: 15

2 Vật liệu thí nghiệm: 15

3 Phương tiện: 15

a Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn 15

b Một số thiết bị dùng để nhận diện và trữ vi sinh vật 15

4 Hóa chất: 16

5 Phương pháp nghiên cứu: 16

a Môi trường phân lập có bổ sung Kao linite ( Lin Qi-mei et al., 2002): 16

b Chuẩn bị môi trường phân lập: 16

c Phân lập vi khuẩn: 17

6 Các chỉ tiêu phân tích: 18

a Đo kali hòa tan 18

b Đếm mật số vi khuẩn 19

Chương 4: Kết quả -thảo luận 21

1 Khả năng hòa tan kali của một số dòng vi khuẩn 23

2 Mật số vi khuẩn: 25

3 Sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và [K+] 27

Chương 5: Kết luận và đề nghị 30

1.Kết luận 30

2 Đề nghị 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 31

Phụ lục: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 33

1.Số liệu và kết quả đo nồng độ kali 33

2 Số liệu và kết quả đếm mật số 36

3 Sự tương quan giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali hòa tan 39

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh 8

Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc 21

Bảng 4.2: Hình dạng và sự chuyển động của tế bào vi khuẩn hòa tan kali 23

Bảng 4.3: Khả năng giải phóng K+ của các dòng vi khuẩn theo thời gian 24

Bảng 4.4: Log10 mật số vi khuẩn sau các ngày nuôi 26

Bảng 4.5: Mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali dòng vi khuẩn ĐL 28 Bảng 4.6: Mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và nồng độ kali dòng vi khuẩn1B 29

Bảng 1: Kết quả đo nồng độ kali sau thời gian nuôi 33

Bảng 2: Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 3 33

Bảng 3:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 6 34

Bảng 4:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 9 35

Bảng 5:Kết quả so sánh sự khác biệt của các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 12 35

Bảng 6: Kết quả phân tích sự khác biệt của một số dòng vi khuẩn 36

Bảng 7: Mật số trung bình của các dòng vi khuẩn 36

Bảng 8: Log10 của mật số vi khuẩn 37

Bảng 9: So sánh sự khác biệt về mật số một số dòng vi khuẩn 37

Bảng 10: Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số giữa các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 6 38

Bảng 11: Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số giữa các dòng vi khuẩn ở ngày thứ 12 39

Bảng 12: Sự tương quan giữa log10 mật số và nồng độ K 39

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 3.1: Mô tả phương pháp đếm mật số vi khuẩn 19

Hình 4.1& 4.2: các khuẩn lạc của vi khuẩn hòa tan kali trên môi trường Kaolinite 22Hình 4.3: Hàm lượng kali hòa tan của một số dòng vi khuẩn theo thời gian 25Hình 4.4: Sự tương quan giữa log10 mật số vi khuẩn và nồng độ K hòa tan 27

Chương 1: Giới thiệu

1 Đặt vấn đề

Bón phân là một trong những biện pháp kỹ thuật được thực hiện phổ biến, thường mang lại hiệu quả lớn trong sản xuất nông nghiệp Phân bón là nhân tố trực tiếp để tăng năng suất cây trồng và cải thiện chất lượng của lương thực, thực phẩm Ngoài ra, khi sử dụng phân bón hợp lý sẽ cải thiện độ phì nhiêu của đất và giúp cho cây trồng có sức chống chịu cao dưới tác dụng của sâu bệnh và tác động xấu của thời tiết Tuy nhiên, việc lạm dụng phân hóa học cũng gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng cây trồng, gây ô nhiễm đất, nước và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Do đó, các nhà nông nghiệp khuyến cáo nên sử dụng phân hữu cơ thay thế cho phân hóa học Nông dân từ rất lâu đã biết sử dụng phân xanh, phân chuồng để bón cho cây trồng, tuy nhiên tác dụng của các loại phân này thường chậm và không ổn định

Ngày nay với sự phát triển của Công nghệ sinh học, người ta đã nghiên cứu

và sản xuất được các loại phân vi sinh để thúc đẩy sự phát triển của cây trồng và không gây ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, các sản phẩm phân vi sinh trên thị trường còn rất ít so với phân hóa học, vì vậy nhu cầu sản xuất phân vi sinh là rất lớn Đã có nhiều nghiên cứu để sản xuất phân đạm vi sinh, phân lân vi sinh hoặc phân chứa hỗn hợp đạm và lân vi sinh, nhưng chưa có nghiên cứu về phân kali vi

sinh hòa tan kali cho nên đề tài “Phân lập vi khuẩn hòa tan kali trong đất” được

Chương 2: Lược khảo tài liệu

Phân vi sinh đang có nhiều điểm nổi bật hơn phân bón hóa học, ngoài việc nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, giảm chi phí sản xuất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững Sự khác nhau giữa phân vi sinh và phân hóa học được thể hiện qua Bảng 1.1

Bảng 1.1: Sự khác nhau giữa phân hóa học và phân vi sinh

Đây là các vi sinh vật sống Đây là các hợp chất vô cơ

Cung cấp chất hữu cơ từ từ và kéo dài Cung cấp chất dinh dưỡng hóa học

với khối lượng lớn cùng một lúc

Không gây ảnh hưởng xấu đến chất

lượng nông sản

Gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng nông sản

Đây là vi sinh vật sống nên thời gian

bảo quản không quá 3 tháng

Thời gian bảo quản lâu

Không được đón gói kín mà phải để

không khí lọt vào

Đóng gói kín

Bón nhiều phân vi sinh không gây ngộ

độc cho cây, đất được cải tạo tốt hơn

Bón nhiều phân hóa học cây bị ngộ độc và chết

Sau đạm và lân, thì kali cũng là một nguyên tố khoáng rất cần thiết đối với cây trồng Mặc dù hàm lượng kali trong đất tương đối cao, nhưng cây trồng không hấp thu được hết, vì có một lượng lớn kali nằm trong các khoáng sét cây trồng không hấp thu được Ngoài ra, có một vài nghiên cứu cho rằng không chỉ ở Việt Nam mà còn ở một số nước khác trên thế giới như: Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn

Độ, Ai Cập,…ít quan tâm đến hàm lượng kali có trong phân bón tạo ra hiện tượng

mất cân đối trong sự phát triển của cây trồng từ đó dẫn đến cây trồng giảm khả năng chống chịu sâu bệnh và thời tiết, năng suất giảm, chất lượng sản phẩm không đạt yêu cầu Do vậy, để khắc phục hiện tượng này thì trước tiên cần phải bổ sung

K+ cho cây trồng và giải pháp tốt nhất là sử dụng phân vi sinh có khả năng hòa tan kali trong các khoáng không tan

Nhiều giống vi sinh vật trong vùng rễ (rhizophere) có khả năng kích thích sự phát triển và tăng trưởng của cây trồng gọi là nhóm vi khuẩn vùng rễ (PGPR=

Plant Growth Promoting Rhizobacteria) (Kopper et al., 1989; Antoun et al., 1998)

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật, cải thiện sự tăng trưởng thực vật

và gia tăng năng suất với cơ chế gián tiếp (hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây hại) và cơ chế trực tiếp (cố định đạm, hòa tan lân, kali khó tan) (Brown, 1974; Kopper et al., 1986, 1989; Davision, 1988) Trong nhóm các vi sinh vật này có

một loài vi khuẩn gọi là vi khuẩn silicate, có thể giải phóng kali ra khỏi các

khoáng không tan, tan được trong nước và cung cấp cho cây trồng

1 Giới thiệu chung về kali

Kali là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng thứ ba đối với cây trồng Kali được hấp thu với số lượng lớn hơn các nguyên tố khoáng khác, ngoại trừ nitơ Kali có khả năng phân cực lớn và có bán kính thủy hóa thấp hơn so với Al3+, Ca2+, Na+,

Li+ do đó có khả năng được lôi kéo đến gần bề mặt khoáng sét cao hơn trong phản ứng trao đổi cation

Có thể biểu diễn hàm lượng kali có trong đất, cây trồng và phân bón dựa vào hàm lượng K2O hoặc kali Hàm lượng kali có trong các loại phân bón thường được biểu diễn bằng % K2O Theo hệ thống đo lường quốc tế thì hàm lượng kali trong đất, cây trồng và phân bón thường được tính toán dựa vào hàm lượng kali

Sự biến đổi giữa hai đơn vị này được tính như sau:

%K2O = %K  1.2 %K = K2O  0.83

2 Hàm lượng và các dạng kali trong đất

Không giống như lân, kali hiện diện với số lượng lớn trong hầu hết các loại đất Hàm lượng kali tổng số có trong đất biến động rất lớn từ 0,1% đến nhỏ hơn 4,29%, với khoảng biến động thông thường là từ 0,3 đến 2% (Mutscher, 1995), và hàm lượng kali trung bình là khoảng 1,7% (Reitemeier, 1951) Sự biến động hàm lượng kali tổng số trong đất là tùy thuộc vào thành phần các loại khoáng nguyên sinh và khoáng sét có trong đất

Kali trong đất tồn tại ở bốn dạng thường được quan tâm đến là: Kali của khoáng vật, kali không trao đổi, kali trao đổi và kali hòa tan Kali của khoáng vật chứa 90-98% kali trong một số khoáng như fenspat và mica (James, 1998), kali không trao đổi thường có khoảng 1-10% và liên kết với cấu trúc khoáng sét, kali trao đổi có từ 1-2% trong vị trí các cation trao đổi hoặc trong dung dịch đất Trong

4 dạng kali chỉ có kali ở dạng trao đổi cây trồng có thể sử dụng được Hầu hết các loại đất đỏ vàng, vàng đỏ phát triển trên đá bazan gọi chung là đất ferrasols đều có lượng kali tổng số nghèo, trừ đất ferrasols phát triển trên đá vôi (K2O = 1,75%)

Hàm lượng kali dễ tiêu trong đất ferrasols (bao gồm trao đổi và hòa tan trong nước) cũng đều thấp (2,07 – 5,76 mg/100g đất) và đất ferrasols phát triển trên đá vôi (14,56 mg/100 g đất) Đất xám miền Đông Nam bộ có tỷ lệ sét thấp chỉ 14 – 15%, khoáng chủ yếu là Kaolinite nên kali tổng số nghèo (0,03 – 0,09%) kali trao đổi cũng thấp 0,04 ldl/100g đất Đất phèn chủ yếu khoáng illit và Kaolinite nên có kali trao đổi thấp; khả năng cố định kali cao Điều đó có thể do sự phong hóa khoáng sét trong điều kiện pH thấp đã làm tăng cường sự phóng thích kali để trở thành dạng hòa tan sau đó bị rửa trôi Đối với đất phèn đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), theo Kyuma (1976) thì khoáng sét chủ yếu là Kaolinite, illit, chỉ có rất

ít montmorilonit nên kali trong đất cũng nghèo

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định kali trong đất

Theo Goulding (1987), các yếu tố ảnh hưởng đến sự phóng thích và cố định kali trong đất bao gồm: Thành phần và kích cở cấu tử khoáng sét; nhiệt độ và lượng mưa; sự khô và ẩm của đất, và hiện tượng đóng băng và tan băng; việc bón

chất hữu cơ; rễ cây trồng

Thành phần và kích cở cấu tử khoáng sét: Theo Rich (1972), các khoáng sét

như mica, tràng khoáng giàu kali, illite có khả năng phóng thích kali cao Illite và vermiculite đồng thời cũng có khả năng cố định kali cao, còn các khoáng sét như

montmorrillonite, kaolinite có khả năng cố định kali thấp (Shaviv et al., 1985)

Cơ chế của sự cố định kali có thể thay đổi từ dạng khoáng sét này đến loại khoáng sét khác Trong trường hợp illite, và vermiculite, K+ có thể lọt vào lưới tinh thể và bị mắc kẹt ở đây, khi các lớp này co lại trong giai đoạn khô Các khoáng sét tích điện âm cao gây ra do Al3+ thay thế cho Si4+ sẽ liên kết mạnh với

K+ và ngăn cản nó trao đổi Các loại khoáng sét khác nhau có khả năng cố định kali khác nhau Ví dụ khoáng sét loại 2:1 như Kaolinite, và các loại đất chứa khoáng sét này cố định ít kali Các loại khoáng sét 2:1 như vermiculite, illite dễ cố định kali với số lượng lớn Sét vermiculite có khả năng cố định kali lớn hơn khoáng sét montmorillonite

Sự khô và ẩm của đất, và hiện tượng đóng băng và tan băng: Đất ướt và

khô, đóng băng và tan băng luân phiên, ảnh hưởng đến cả 2 tiến trình phóng thích

và cố định kali trong đất Beckett et al.(1985) đã liệt kê rất nhiều tài liệu đồng quan điểm với ý kiến trên Theo Goulding (1985) hiện tượng mất nước có thể gia tăng sự cố định kali là do các lá sét co lại làm cho K+bị giữ chặt, đồng thời sự đóng băng có thể làm gia tăng khoảng trống giữa các lá sét do đó làm cho sự di chuyển của K+ và các ion khác gia tăng làm dễ dàng cho sự phóng thích kali, sự tan băng không làm cho lá sét co lại nên ít có khả năng làm tăng sự cố định kali

Ảnh hưởng của rễ cây trồng: Rễ cây trồng tiết ra H+ và nhiều loại acid hữu

cơ khác trong đất do đó làm tăng khả năng phóng thích kali Ngoài ra, khả năng thu hút kali còn tùy thuộc vào tính chất của rễ cây trồng và sự phân bố của rễ Barber (1985) báo cáo rằng rễ cây trồng thu hút kali chỉ từ 14% của thể tích đất

4 Ảnh hưởng của kali đối với cây trồng

Kali có vai trò rất quan trọng đối với lúa, một loại lương thực chủ yếu ở Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới Hàm lượng K2O tổng số chiếm cao nhất trong ba loại dưỡng chất chính đối với sự phát triển của cây lương thực này

Mặc dù không trực tiếp tham gia vào cấu trúc vật chất cấu tạo nên tế bào nhưng kali lại có vai trò quan trọng trong việc ổn định các cấu trúc này và hỗ trợ cho việc hình thành các cấu trúc giàu năng lượng như ATP trong quá trình quang hợp và phosphoril hóa Kali ảnh hưởng trước tiên đến việc tăng cường hydrat hóa các cấu trúc keo của huyết tương, nâng cao khả năng phân tán của chúng nhờ đó giúp cây giữ nước tốt, tăng khả năng chống hạn, tăng cường tính chống rét và khả năng kháng các bệnh do nấm và vi khuẩn Ngoài ra, kali giúp cây tăng cường khả năng tổng hợp các hợp chất cao phân tử như cellulose, hemicellulose, các hợp chất peptid v.v nhờ đó giúp cho các cây họ hòa thảo cứng cáp, chống đổ ngã tốt Kali giúp cho cây tăng cường tổng hợp và tích lũy hàng loạt các vitamin, có vai trò quan trọng trong đời sống thực vật

Trong mối quan hệ đất - phân bón, kali đóng một vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của cây Thiếu kali sẽ gây ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất trong cây, làm suy yếu hoạt động của hàng loạt các men, giảm quá trình trao đổi các hợp chất carbon và protein, đồng thời tăng chi phí đường cho quá trình hô hấp, gây lép hạt, làm giảm tỷ lệ nảy mầm và sức sống hạt giống.Về hình thái, các lá trưởng thành sẽ vàng sớm bắt đầu từ bìa lá, sau đó bìa lá khô, đầu lá có đốm vàng hoặc bạc, có triệu chứng rách bìa lá dẫn đến giảm hiệu suất quang hợp Đây là những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến năng suất và chất lượng nông sản bị sụt giảm

Nghiên cứu về vai trò của kali đối với cây trồng thể hiện rất khác nhau tùy theo từng loại đất Hiệu lực cao nhất thường thấy trên đất xám bạc màu và trên đất cát biển Đối với một số loại cây lấy hạt như ngô hiệu lực của kali khá cao, năng suất tăng từ 23 - 36% và hiệu lực của kali trung bình đạt từ 15 - 20 kg K2O Đối với lúa vùng ĐBSCL hiệu lực của kali trung bình đạt 4,6 - 5,5 kg thóc/kg kali Đối với cây công nghiệp ngắn ngày, kết quả khảo nghiệm của Tô Văn Thống (1994) với cây đậu tương trên đất bạc màu cho thấy khi bón đơn thuần kali đã làm tăng năng suất khoảng 45% so với không bón, hiệu suất kali đạt từ 5,8 - 15 kg đậu/kg

K2O Với cây lạc (đặc biệt là trên chân đất bạc màu, đất cát biển) hiệu suất sử dụng kali từ 2,3 đến 8,2 kg lạc vỏ khô/kg K2O bón vào

Như vậy đối với cây trồng, kali đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành năng suất và chất lượng sản phẩm Nhưng hiện nay, phần lớn kali chỉ được

sử dụng ở các tỉnh đồng bằng và các vùng thâm canh cao

5 Địa điểm thu mẫu

Thứ nhất khi thu mẫu đất mang về thí nghiệm, nên chọn những nơi đất xám bạc màu, ở vùng đất đỏ bazan hay những vùng đất phèn mặn Bởi vì, ở những nơi này thường hàm lượng kali cố định trong đất cao

Thứ hai là chọn đất xung quanh rễ cây ở những vùng đất trên Để sống được thì cây cần phải hấp thu kali, nhưng hầu như lượng kali trong các loại đất này đều

là kali cố định nên cây không hấp thu được do đó khi cây sống được thì trong đất nơi đó có khả năng có sự tồn tại các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan kali bị cố định

6 Vi khuẩn chuyển hóa kali

Do có rất ít nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng chuyển hóa kali từ dạng khó

tan sang dạng dễ tan, nên chỉ có dòng vi khuẩn được quan tâm: Bacillus

mucilaginosus

Vi khuẩn Bacillus mucilaginosus là vi khuẩn có hình que, nhày (Avakyan et al., 1986), được tìm ra dựa trên những phân tích genotyp và kiểu hình Bacillus mucilaginosus là vi khuẩn Gram âm, có kích thước lớn, có hình que dài và dày Bào tử tương đối lớn, hình elip, bề mặt dày có màu đỏ hơi tối bên trong có màu đỏ nhẹ Khi quan sát bằng mắt, Bacillus mucilaginosus có những đặc tính sau: Xuất

hiện khắp trên bề mặt môi trường nuôi cấy, có khuẩn lạc hình tròn Khuẩn lạc ban

đầu không màu, nhưng sau 5-6 ngày phía trong có màu hơi đục ngoài rìa trong suốt Các loại vi khuẩn Bacillus mucilaginosus khác nhau có khả năng chuyển hóa khác nhau trên cùng điều kiện môi trường Bacillus mucilaginosus sau khi vào môi trường có khoáng chứa kali, chúng sẽ xuyên thủng, hòa tan các lá sét bao quanh phóng thích các K+ giúp cho cây trồng hấp thu dễ dàng Chúng cải thiện nhanh chóng hàm lượng kali trong đất, hàm lượng kali được chuyển hóa tăng lên 33-34% Hiện nay, phân bón vi sinh chứa kali được áp dụng trên hơn 30 loại cây

trồng (cà chua, thuốc lá, dưa chuột, hồ tiêu, lúa mì,…) tại hơn 20 tỉnh và các huyện ở Trung Quốc

7 Các nghiên cứu về vi khuẩn hòa tan kali

Badr et al., (2006) đã nghiên cứu về sự hòa tan kali và phospho bởi vi khuẩn

silicate và ứng dụng lên sự tăng trưởng của cây lúa miến Sau đó, Badr đã nhận

thấy hiệu quả của sự kết hợp vi khuẩn silicate và hợp chất hữu cơ hòa tan kali

trong khoáng tràng thạch (fenspat) lên sự phát triển cây cà chua

Han và Lee (2006) đã nghiên cứu hiệu quả kết hợp giữa vi khuẩn hòa tan kali và vi khuẩn phospho lên sự hấp thu và tăng trưởng của cây hồ tiêu và cây dưa chuột

Sugumaran và Janarthanam (2007) đã nghiên cứu khả năng hòa tan các khoáng chứa kali bằng vi khuẩn và ứng dụng lên cây trồng

Chương 3: Phương tiện – phương pháp

1 Địa điểm và thời gian:

a Thiết bị, dụng cụ phân lập vi khuẩn

 Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)

 Cân điện tử Sartorius (Đức)

 Đĩa petri; ống nghiệm; bình tam giác 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml, 2000ml

 Kính lúp, que cấy, lam, la men, que thuỷ tinh, cốc đựng dung dịch, chai

lọ thuỷ tinh

b Một số thiết bị dùng để nhận diện và trữ vi sinh vật

0

5 Phương pháp nghiên cứu:

a Môi trường phân lập có bổ sung Kao linite ( Lin Qi-mei et al., 2002):

b Chuẩn bị môi trường phân lập:

Cho 10g glucose, 1g ammonium sulphate, 0,2g magneium sulphate, 0,1g dinatrium phosphate, 1000ml H2O vào cốc thủy tinh khuấy tan, sau đó đo pH, và điều chỉnh cho pH = 7 bằng dung dịch NaOH (nếu pH của dung dịch môi trường nhỏ hơn 7), và dung dịch CH3COOH (khi pH dung dịch môi trường lớn hơn 7) Môi trường phân lập sau khi điều chỉnh pH xong cho vào bình tam giác có dung tích 2000ml, tiếp theo cho thêm 20g agar và đậy lại bằng nút gòn sau đó đem khử trùng trong nồi khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong 20 phút Môi trường nuôi cấy sau khi khử trùng xong được bổ sung thêm 0,2g Kaolinite và phân phối đều vào

các đĩa Petri đã được khử trùng bên trong tủ cấy vô trùng (khoảng 20ml môi trường cho mỗi đĩa), để yên cho môi trường đặc lại

c Phân lập vi khuẩn:

 Thu mẫu:

Dùng dao xén lấy vùng đất xung quanh rễ cây ở những nơi đất xám bạc màu, đất cát, đất đỏ bazan (chú ý khi lấy đất phải loại bỏ lớp đất bề mặt vì lớp đất này rất dễ bi nhiễm nấm), cho vào bao nylon mang về phòng thí nghiệm để khô ở nhiệt độ phòng Nếu chưa có điều kiện phân lập thì trữ mẫu ở những nơi thoáng mát, nhưng phải tiến hành phân lập trong vòng thời gian 1 tuần sau khi thu mẫu

 Phân lập:

Cân 1g mẫu đất cho vào bình tam giác với 99ml nước cất đã được khử trùng, lắc trên máy lắc 2 giờ với vận tốc 200 rpm Dùng micropipet hút 0,1ml dung dịch mẫu trải điều trên đĩa Petri có môi trường đã được chuẩn bị sẳn Phơi khô dưới ngọn lửa đèn cồn, sau đó mang đĩa Petri ủ trong tủ ủ ở 300C Sau 24-48 giờ kiểm tra thấy khuẩn lạc mọc trên bề mặt môi trường, tiếp tục cấy chuyền sang môi trường mới cho đến khi các khuẩn lạc xuất hiện trên đường cấy rời nhau Sau

đó, kiểm tra độ ròng bằng cách:

Quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt ép ở vật kính X40 (độ phóng đại 400 lần) thực hiện như sau:

Nhỏ 1 giọt nước cất (khoảng 20 l) đã được khử trùng lên kính mang vật

Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nóng đỏ và để nguội

Dùng đầu kim cấy lấy một ít mẫu đã được cấy trử trong ống nghiệm chấm vào giọt nước cất trên kính mang vật (trong điều kiện vô trùng)

Lấy kính đậy vật đậy lên giọt nước cất bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 450 hạ kính đậy vật xuống từ từ sao cho không có bọt khí trong mẫu vật

Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi

 Nuôi vi sinh vật tạo giống cấp 1:

Sau khi kiểm tra độ ròng của từng dòng vi sinh vật, tiến hành nuôi giống cấp 1: hơ lửa kim cấy cho đến khi nóng đỏ, chấm lên bề mặt môi trường agar cho nguội, rồi chấm lên khuẩn lạc chứa trong đĩa petri hoặc trong ống nghiệm, chuyển kim cấy sang bình tam giác nhỏ có chứa 100ml môi trường lỏng (các bước pha môi trường lỏng giống như cách pha môi trường đặc nhưng chỉ khác là không cho thêm agar vào), nghiêng lắc nhẹ cho vi sinh vật từ kim cấy rớt ra và hòa lẫn vào môi trường (tiến hành trong điều kiện vô trùng) thu được giống cấp 1 và để lên máy lắc

Các thí nghiệm tiến hành như sau:

Hút 1,8ml mẫu vào tuyp 2ml (mỗi dòng vi khuẩn hút 7 tuyp), đem 6 tuyp đem ly tâm sau đó đem đi phân tích Tuyp còn lại không ly tâm mà tiến hành pha loãng nhỏ giọt đếm sống mật số vi khuẩn

Đồng thời chuẩn bị mẫu đối chứng, là mẫu chỉ có môi trường không chủng