khảo sát lý hóa tính và mật số vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân trong đất xám trồng bắp ở miền đông nam bộ

i TÓM LƯỢC Khảo sát một số lý hóa tính đất bao gồm các chỉ tiêu pH, hàm lượng chất hữu cơ, lân hữu dụng, đạm tổng số nhằm hiểu thêm về thổ nhưỡng về vùng đất ở Đông Nam Bộ.. Kiểm tra mậ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV: 3102864

Cần Thơ, Tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

-  - Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ - những người đã có công sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con đến ngày hôm nay

Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cùng tất cả quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu, trao dồi kiến thức trong 4 năm qua

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn – GS Ts Cao Ngọc Điệp đã dìu dắt, tận tâm chỉ dẫn trong suốt thời gian học tâp cũng như trong quá trình thực hiện thí nghiệm và viết luận văn

Cám ơn chị Trần Thị Giang – cán bộ phòng thí nghiệm và các anh, chị, em trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học cùng tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc thực hiện luận văn

Cuối lời, xin kính chúc Cha Mẹ, quý Thầy Cô và các anh chị dồi dào sức khoẻ, thành công và hạnh phúc, chúc tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đều hoàn thành luận văn xuất sắc

i

TÓM LƯỢC

Khảo sát một số lý hóa tính đất bao gồm các chỉ tiêu pH, hàm lượng chất hữu

cơ, lân hữu dụng, đạm tổng số nhằm hiểu thêm về thổ nhưỡng về vùng đất ở Đông Nam Bộ Kiểm tra mật số 2 loài vi khuẩn có ích là vi khuẩn hòa tan lân và vi khuẩn cố định đạm có trong đất xám trồng bắp tại các tỉnh: Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu, Bình Phước Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đếm mật số vi khuẩn trong 24 mẫu đất được lặp lại 3 lần bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt Sau kết quả khảo sát thấy 2 loài vi khuẩn có ích hiện diện trong đất trồng bắp ở Đông Nam

Bộ với mật số cao, có tiềm năng khai thác loài vi khuẩn bản địa làm phân sinh học là rất lớn.Kiểm tra sự tương quan giữa mật số 2 loài vi khuẩn với các chỉ tiêu hóa lý của đất, cho thấy một số chỉ tiêu đất có tương quan với mật số 2 loài vi khuẩn trên Mật số

vi khuẩn cố định đạm và pH (r =0,724*), chất hữu cơ trong đất (r =0,651*), đạm tổng

số (r =0,491*) Vi khuẩn hòa tan lân với pH (r =0,692*) và chất hữu cơ (r =0,412*) Ngoài ra sự tương quan của các chỉ tiêu khác như lân hữu dụng, đạm tổng số với mật

số vi khuẩn không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%

Từ khóa: đạm tổng số, đếm sống nhỏ giọt, hệ số tương quan, lân hữu dụng, vi khuẩn

cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân

PHẦN KÍ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC .… ii

DANH SÁCH BẢNG V DANH SÁCH HÌNH VI TỪ VIẾT TẮT………… ……… ………VII CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 1

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về cây Bắp 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái 2

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp 2

2.1.3 Tình hình trồng bắp ở nước ta 3

2.2 Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ 3

2.3 Quá trình cố định đạm sinh học 4

2.3.1 Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử) 4

2.3.2 Các loài vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm 5

2.4 Quá trình chuyển hóa lân trong đất 8

2.4.1 Đối với lân hữu cơ 8

2.4.2 Đối với lân vô cơ 9

2.4.2.1 Sự chuyển hóa lân ở đất chua 9

2.4.2.2 Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm 10

2.4.3 Các vi sinh vật chuyển hóa lân 10

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

iii

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 12

3.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 12

3.3 Phương tiện nghiên cứu 12

3.3.1 Thiết bị 12

3.3.2 Dụng cụ thí nghiệm 12

3.3.3 Hóa chất 13

3.4 Phương pháp nghiên cứu 14

3.4.1 Thí nghiệm đo đạt một số chỉ tiêu chất lượng đất 14

3.4.2 Khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân 14

3.4.3 Xác định mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate count) (Hoben và Somasegaran, 1982) 15

3.4.3 Xác định độ ẩm 16

3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Các chỉ tiêu hóa lý của các mẫu đất xám trồng bắp ở Đông Nam Bộ 18

4.1.1 Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH trong các mẫu đất 18

4.1.2 Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số 19

4.2 Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân trong đất xám ở Đông Nam Bộ 20

4.2.1 Mật số vi khuẩn cố định đạm 20

4.2.2 Mật số vi khuẩn hòa tan lân 21

4.3 Kiểm tra sự tương quan giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân với một số chỉ tiêu hóa lý của đất 22

4.3.1 Tương quan giữa mật số vi khuẩn cố định đạm với các chỉ tiêu hóa lý của đất 22

4.3.1.1 Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và pH 22

4.3.1.2 Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và đạm tổng số 24

4.3.1.4 Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và lân hữu dụng 27

4.3.2 Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với các chỉ tiêu hóa lý của đất 28

4.3.2.1 Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH 28

4.3.2.2 Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với đạm tổng số 29

4.3.2.3 Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ 30

4.3.2.4 Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với lân hữu dụng 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC

v Bảng 1: Các loại đất chính ở vùng Đông Nam Bộ 4 Bảng 2: Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH………19

Hình 1: Cây bắp 2

Hình 2: Vi khuẩn Sinorhizobium meliloti 6

Hình 3: Vi khuẩn Rhizobium và nốt sần rễ .6

Hình 4: Vi khuẩn Azotobacter sp 8

Hình 5: Vi khuẩn Clostridium sp 8

Hình 6: Vi khuẩn Bacillus megaterium 11

Hình 7: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 11

Hình 8: Pha loãng và nhỏ giọt trong phương pháp đếm sống nhỏ giọt 16

Hình 9: Hàm lượng đạm tổng trong các mẫu đất khảo sát……… 20

Hình 10: Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các mẫu đất khảo sát……… 21

Hình 11: Mật số vi khuẩn hòa tan lân trong các mẫu đất khảo sát……… 22

Hình 12: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với pH……… 23

Hình 13: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng đạm tổng số ….24 Hình 14: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng chất hữu cơ ….25 Hình 15: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng lân hữu dụng …26 Hình 16: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH……… 27

Hình 17: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ………28

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Đạm và lân là 2 nguyên tố đa lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Tuy nhiên, 2 nguyên tố này hiện diện trong đất với hàm lượng thấp, đặc biệt đối với lân tồn tại ở dạng khó tan, trong đá hay trầm tích (Goldstein, 1994) cây không sử dụng được

Ở Việt Nam hiện nay phân bón được sử dụng chủ yếu trong nông nghiệp là phân hóa học, việc lạm dụng nhiều phân bón hóa học đã gây ra những vấn đề về ô nhiễm môi trường, làm đất bị hoang hóa, mất cân bằng dinh dưỡng, mất khả năng canh tác, làm chết vi sinh vật có ích

Vì vậy, để cùng phát triển nông nghiệp bền vững đồng thời bảo vệ môi trường, việc sử dụng phân vi sinh có các vi khuẩn có lợi như vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân, đang là 1 trong những lựa chọn nhằm cải tạo đất nông nghiệp Tuy nhiên việc sử dụng phân sinh học là sử dụng những vi sinh vật sống nên cũng có những điều cần quan tâm để hiệu quả cải tạo cao như: hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chỉ số pH, đạm tổng số,…

Đất vùng Đông Nam Bộ do tập quán canh tác cũng như những điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng càng làm nhanh quá trình bạc màu của đất Vì vậy, để tìm hiểu rõ hơn vùng đất Đông Nam Bộ về tiềm năng vi sinh vật có ích bản địa nên đề tài được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp của các tỉnh Đông Nam Bộ

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về cây Bắp

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây bắp (Zea mays L.) thuộc họ Hòa Thảo, là loại cây hằng niên, thân bắp

thẳng, có nhiều lóng, thường cao 2–3m, lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100cm và rộng 5–10cm, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn

Hình 1: Cây bắp

(*nguồn: www.agrilong.com, ngày 22/11/2013)

Các bắp là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một số lớp lá Râu bắp là các núm nhụy thuôn dài ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu hung đỏ hay hung vàng.Trên đỉnh là cụm hoa hình chùy chứa các hoa đực. Hạt bắp với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thường ở họ Hòa thảo

2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp

Thời gian sinh trưởng tính từ lúc này mầm đến khi thu hoạch khoảng 70 đến

100 ngày tùy giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ

Sự phát triển có thể chia làm 2 giai đoạn: sinh trưởng dinh dưỡng tính từ lúc nảy mầm, sinh trưởng sinh sản từ lúc xuất hiện hoa cái đến thu hoạch Nắm được qui luật sinh trưởng và phát triển của cây bắp có thể chủ động áp dụng các biện pháp kĩ thuật theo hướng có lợi nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển để tạo được năng suất cao

2.1.3 Tình hình trồng bắp ở nước ta

Bắp là cây lương thực đứng thứ 2 sau lúa gạo nhưng vẫn chưa được chú trọng nhiều do truyền thống canh tác lúa nước (Ngô Hữu Tình, 2009) Sản lượng bắp ngày càng tăng, năm 2012 đạt 4,81 triệu tấn, tăng nhẹ so với năm 2011 (4,65 triệu tấn) Diện tích trồng bắp năm 2012 đạt 1,12 triệu ha, cao hơn so với năm 2011 (1,08 triệu ha) (nguồn: www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/ /Baocao, ngày 23/7/2013)

Tuy nhiên sản lượng trên vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước để sản xuất thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và 1 phần sản xuất bia

2.2 Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ

Vùng Đông Nam Bộ gồm các tỉnh, thành phố: Tây Ninh, Bình Dương, Bình Phước, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh và Bà Rịa- Vũng Tàu, diện tích tự nhiên khoảng 2,34 triệu ha

Trong phạm vi của vùng, hai nhóm đất có diện tích lớn nhất là đất xám chiếm

44 % tổng quỹ đất của vùng, nhóm đất đỏ vàng chiếm 32 % trong đó đất đỏ bazan chiếm 215 nghìn ha (chiếm 29 %, của nhóm đất đỏ vàng) Các nhóm đất khác như đất cát, đất mặn, đất phèn… chiếm 14 %

 Nhóm đất xám có tổng diện tích 1.038 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở các

tỉnh, thành: TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Tây Ninh và Bình Phước Đất xám có các loại: Xám bạc màu trên phù sa cổ, xám bạc màu glây trên phù sa cổ và xám bạc màu phát triển trên sản phẩm phong hóa của đá macma axit và đá cát

 Đất đen nhiệt đới có diện tích là 49 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở tỉnh

Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu Đất có chất lượng khá tốt, thích hợp cho những loại cây: bắp, đậu đỗ, mía và các loại cây ăn quả, bao gồm các loại đất: Đất nâu tím trên đá macma bazơ và trung tính, đất nâu đỏ trên đá macma bazơ và trung tính, đất nâu vàng trên đá macma bazơ và trung tính, đất đỏ vàng trên đá sét và biến chất, đất vàng đỏ trên đá macma axit, đất vàng nhạt trên đá cát và đất nâu vàng trên phù sa cổ

Bảng 1: Các loại đất chính ở vùng Đông Nam Bộ

Nhóm đất

Diện tích (ha)

2.3.1 Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử)

Quá trình cố định nitơ phân tử (N) là quá trình đồng hóa nitơ của không khí thành đạm amon dưới tác dụng của một số vi sinh vật có enzyme nitrogenase Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn khí nitơ tự do (N2) trong khí quyển Chúng chiếm tỉ lệ rất cao trong không khí (78%) (Dobereiner, 1987) Tổng số nitơ trong cả khí quyển tới 41,015 tấn Trong khí nitơ, hai nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng 3 liên kết rất bền vững Năng lượng của 3 liên kết này cao tới 225kcal/M Chính vì vậy mà N2 rất khó kết hợp với nguyên tố khác Muốn phá vỡ 3 liên kết này, người ta cần phải sử dụng những năng lượng rất lớn Chẳng hạn ở nhà máy phân đạm hóa học, muốn làm cho nitơ liên kết được với hidro để tạo thành NH3 người ta phải dùng một nhiệt độ là 500oC và một áp suất cao tới 350atm (Nguyễn Lân Dũng et al., 2008)

Trong khi đó vi sinh vật dưới sự trợ giúp của enzyme nitrogenase có thể phá vỡ

3 liên kết của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất Có thể nói quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành

NH3 được xúc tác bởi enzyme nitrogenase và sự hiện diện của ATP

2.3.2 Các loài vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm

 Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh

Các vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh được gọi chung là Rhizobium chúng thuộc

bộ Rhizobiales, bao gồm 12 chi và 57 loài Có 5 chi quan trọng trong nông nghiệp nhờ đặc tính cộng sinh trên cây (Phạm Văn Kim, 2000):

­ Rhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm R arachis (cộng sinh trên đậu phộng), R etli (cộng sinh trên các loại đậu), R gallicum (cộng sinh trên các loại đậu), R hainanense (cộng sinh trên các loài đậu nhiệt đới), R huautlense (cộng sinh trên điền thanh), R indigoferae (cộng sinh trên cây chàm indigo),

R.leguminosarum (cộng sinh trên các loại đậu), R phaseoli (cộng sinh trên các loại

đậu ve, đậu xanh)

­ Bradyrhizobium (họ Bradyrhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm B betae (cộng sinh trên củ cải đường), B canariense (cộng sinh trên các cây họ đậu, chịu được đất chua), B japonicum (cộng sinh trên đậu nành), B lupine (cộng sinh trên đậu

lupin)

­ Mesorhizobium (họ Phyllobacteriaceae): Các loài quan trọng gồm M huakuii,

M septentrionale và M temperatum (cộng sinh trên các loại đậu đồng cỏ), M loti

(cộng sinh trên sen), M amorphae, M mediterraneum và M tianshanense (cộng sinh trên đậu chickpea), M plurifarium (cộng sinh trên các loài keo)

­ Sinorhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm S abri (cộng sinh trên các loại đậu nhiệt đới, điên điển), S americanus và S terangae (cộng sinh trên các loài keo), S aroris (cộng sinh trên các loại đậu của Phi châu), S medicae và

S meliloti (cộng sinh trên cỏ alfalfa), S saheli (cộng sinh trên thân điên điển, điền

thanh), S xinjiangense (cộng sinh trên các loại đậu ở Trung Quốc)

­ Azorhizobium (họ Hyphomicrobiaceae): Các loài quan trọng gồm

A.caulinodans (cộng sinh trên rễ và thân điền thanh, điên điển), A johannae (cộng

sinh trên đậu, điền thanh, điên điển)

Hình 2: Vi khuẩn Sinorhizobium meliloti

Hình 3: Vi khuẩn Rhizobium và nốt sần rễ

(*nguồn: en.wikipedia.org, ngày 22/11/2013)

 Vi sinh vật cố định đạm không cộng sinh

Vi khuẩn Azospirillum là một loại vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,

vùng đất quanh rễ, thân và lá cây Chúng sống trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ Đây là loài vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng nhiều vì ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (Abscisic acid) và cytokynins (Bashan và Levanony, 1990) Những thí nghiệm ở Mỹ cho thấy

Azospirillum có thể thay thế được 40kg N/ha/năm (Smith et al., 1978) Ở Brazil, Azospirillum lipoferum có thể cung cấp cho bắp 2kg nitơ mỗi ngày Ở Thái Lan,

những thí nghiệm trên bắp năm 1984 – 1985 cho thấy sản lượng bắp tăng 15 – 35%

(Vasuvat et al., 1986)… Ở Việt Nam, thí nghiệm của Nguyễn Thị Phương Tâm (2006)

ở Cù Lao Dung, Sóc Trăng cũng cho thấy dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum

HA28 làm tăng năng suất 6,6 lần so với đối chứng không bón đạm, không chủng vi khuẩn

­ Vi khuẩn Azotobacter Năm 1901, Beyjeirick đã phân lập được từ đất một loài vi sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài này là Azotobacter

­ Vi khuẩn Beyjerinckii Nhà bác học Ấn Độ Stacke (1893) đã phân lập được một

loài vi khuẩn ở ruộng lúa nước pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử và ông

đặt tên là vi khuẩn Beyjerinckii

­ Vi khuẩn Clostridium Loài vi khuẩn này được Vinogratxkii (1939) phân lập đầu

tiên (Lê Xuân Phương, 2005)

­ Ngoài các vi khuẩn trên, còn có rất nhiều loài có khả năng cố định nitơ sống tự

do như:

+ Xạ khuẩn: Một số loài thuộc giống Streptomyces, Actinomyces, Frankia,

Nocardia, Actinopolyspora, Actinosynoema…

+ Các vi khuẩn quang tổng hợp: Chromatium, Rhodomicrobium,

Rhodopseudomonas, Rhodospirillum…

Các tảo lam: Anabaena, Anabaenapsis, Calothris, Nostoc, Tolvcothrix… (Phạm

Văn Kim, 2000)

Hình 4: Vi khuẩn Azotobacter sp

Hình 5: Vi khuẩn Clostridium sp

(*nguồn: microbewiki.kenyon.edu,ngày 22/11/2013)

2.4 Quá trình chuyển hóa lân trong đất

2.4.1 Đối với lân hữu cơ

Trong đất có nhiều loài vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ Các sinh vật này tiết enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate, phản ứng enzyme nhanh khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất sau đó chậm lại khi lân đã bị cố định Lân sẽ tạo phức liên kết với Fe, Al, các hợp chất hữu cơ phân tử lượng cao và bị dính chặt trên các phần tử sét

Tốc độ phân giải lân phụ thuộc vào các yếu tố sau:

Bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Acid nucleic dễ khoáng hóa hơn phytil Nguyên nhân là do hầu hết vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ điều tiết enzyme phân giải acid nucleic

Nếu lượng C/P cao hơn 300, lân sẽ bị các vi sinh vật trong đất cố định, còn ở mức C/P nhỏ hơn 200 thì lân sẽ được khoáng hóa (Lê Phước Thạnh, 2011)

pH tối ưu 6-7 Ở môi trường kiềm lân vô cơ được phóng thích nhanh hơn lân hữu cơ

Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ, thích hợp là từ 45-50oC Do đó, mùa hè tốc độ khoáng hóa lân nhanh hơn các mùa khác

2.4.2 Đối với lân vô cơ

Sự tồn tại các loại ion phosphate tùy thuộc vào pH đất Do vậy thực tế trong đất, lân tồn tại chủ yếu ở 2 dạng: H2PO4

và HPO4

2-

H2PO4 -

HPO4

2 -

PO4

3-

Dung dịch acid dung dịch kiềm

Ở pH=7 tỷ lệ 2 ion này bằng nhau H2PO4- dễ đồng hóa hơn HPO42-, nên về mặt

lý thuyết ở pH= 5-6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất Song trong đất còn có nhiều ion khác nên quá trình chuyển hóa lân cũng rất phức tạp

2.4.2.1 Sự chuyển hóa lân ở đất chua

Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: ion Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng hòa tan phản ứng H2PO4-, tạo thành hợp chất không tan, cây không sử dụng được

Trong môi trường chua còn 2 quá trình cố định lân liên quan đến sét Đó là do

sự tồn tại các ion OH- trên bề mặt khoáng sét

Sét - OH + Ca(H2PO4)2 sét - H2PO4

-

+ 1/2Ca(OH)2

Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự:

Illit > Kaolinit >Montmorillonit

2.4.2.2 Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm

Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H2PO4

phản ứng mạnh với Ca tạo các hợp chất ít tan theo các phản ứng lần lượt sau (Võ Thị Lài, 2006):

Ca(H2PO4)2 + CaCO3 + H2O 2CaHPO4.2H2O +H2O 6CaHPO4.2H2O + 2CaCO3 + H2O Ca8H2(PO4)6.5H2O + 2CO2

Ca8H2(PO4)6.5H2O + CaCO3 Ca3(PO4)2 + CO2 + 6H2O Lân trở nên kém hòa tan hơn nếu gặp các điều kiện thuận lợi và đủ thời gian

để Ca3(PO4)2 có thể chuyển thành các hợp chất không tan như: hydroxyl, carbon và có thể fluoro apatit

2.4.3 Các vi sinh vật chuyển hóa lân

Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus

butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn vùng rễ, xạ

khuẩn có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit Khả năng phân giải lân vô cơ liên quan mật thiết đến tự sản sinh acid của vi sinh vật Quá trình lên men tạo acid carbonic là acid chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ

Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O Ca(PO4)2.H2O + Ca(HCO3)2

Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có vai trò quan trọng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống các loài vi khuẩn này tích lũy trong đất HNO3, H2SO4

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4

Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất, ngoài

ra còn 1 số chủng khác như Penicilin, Rhizopus,…

Hình 6: Vi khuẩn Bacillus megaterium

Hình 7: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (*nguồn: microbewiki.kenyon.edu,ngày 22/11/2013)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 11/2013

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Vi sinh môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Đất vùng rễ cây bắp được thu từ các tỉnh: Bà Rịa- Vũng Tàu, Bình Phước, Tây Ninh, Đồng Nai

3.3 Phương tiện nghiên cứu

Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường, phòng Khử trùng của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Bình tam giác 250ml, bình tam giác 100ml, nút gòn, nắp giấy

Ống nghiệm, nút đậy ống nghiệm

Đĩa petri, cốc thủy tinh

Micropipette, đầu cole

Và một số dụng cụ khác

5 g/l 0,5%(w/v)

20 g/l

Tất cả các môi trường nêu trên sau khi pha xong đều được khử trùng bằng nồi khử trùng nhiệt ướt ở 1210C, áp suất 1atm trong 20 phút

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Thí nghiệm đo đạt một số chỉ tiêu chất lượng đất

Tiến hành thí nghiệm đo một số chỉ tiêu chất lượng đất: pH, hàm lượng chất hữu cơ, đạm tổng số, lân hữu dụng

3.4.1.2 Hàm lượng chất hữu cơ

Chất hữu cơ trong đất được xác định theo phương pháp Walkley-Black Dựa trên nguyên tắc oxy hóa chất hữu cơ bằng K2Cr2O7 trong môi trường H2SO4 đậm đặc, sau đó chuẩn độ lượng dư K2Cr2O7 bằng FeSO4 0,1N

3.4.1.3 Hàm lượng lân hữu dụng

Hàm lượng lân hữu dụng được xác định bằng phương pháp Oniani, lân hữu dụng được lôi cuốn bằng acid loãng 0.1N và xác định hàm lượng bằng máy đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 880nm

3.4.1.4 Hàm lượng đạm tổng số

Sử dụng phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ tổng trong đất amoni, N- nitrat và N- trong các hợp chất hữu cơ)

(N-3.4.2 Khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân

Thí nghiệm được tiến hành nhằm kiểm tra, đánh giá mật số của hai loại vi khuẩn có lợi là cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp ở các tỉnh Đông Nam

Bộ Mật số vi khuẩn cố định đạm được xác định trên môi trường Burk’s và vi khuẩn hòa tan lân trên môi trường NBRIP

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại

3.4.3 Xác định mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt

(Drop plate count) (Hoben và Somasegaran, 1982)

Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate count) được sử dụng để xác định mật số vi khuẩn, nhằm xác định số tế bào vi khuẩn sống trong mẫu đất tại thời điểm khảo sát Phương pháp này có ưu điểm là có số lần lặp lại cao (5 giọt) và khảo sát trên cùng 1 đĩa petri nhiều nồng độ pha loãng, nên cho kết quả tương đối chính xác

Các bước tiến hành như sau :

- Pha loãng mẫu: Mỗi mẫu được pha loãng thành 3 độ pha loãng bậc 10 liên

tiếp với 3 ống nghiệm

+ Cân 1 gam mẫu cho vào bình tam giác chứa 100 ml nước cất vô trùng Lúc này mẫu được pha loãng 100 lần, độ pha loãng là 102 Lắc đều bình tam giác này bằng máy lắc mẫu khoảng 2 – 3 giờ

+ Hút 1 ml mẫu từ bình tam giác chứa mẫu ở trên cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng Trộn đều mẫu trong ống nghiệm thứ nhất bằng máy Vortex, lúc này mẫu gốc được pha loãng 1.000 lần, độ pha loãng là 103

+ Tiếp tục hút 1 ml mẫu ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai chứa 9 ml nước cất vô trùng (trộn đều mẫu trước khi hút), mẫu gốc đã được pha loãng 10.000 lần, độ pha loãng 104 Pha loãng tương tự để được mẫu có độ pha loãng 105 ở ống nghiệm thứ ba

Hình 8: Pha loãng (A) và nhỏ giọt (B) trong phương pháp đếm sống nhỏ giọt

- Đếm: Chọn đếm phần đĩa có các khuẩn lạc rời và số lượng đủ lớn trong mỗi giọt, tính số khuẩn lạc trung bình:

Số khuẩn lạc trung bình/10 µl = (Tổng số khuẩn lạc trong 5 giọt)/5

- Cách tính số mật số vi khuẩn có trong 1 gam chất mang khô:

B: Số lượng tế bào vi khuẩn/gam chất mang khô

A: Số khuẩn lạc trung bình của mỗi giọt ở độ pha loãng tốt nhất

DF: Độ pha loãng

W: Trọng lượng khô của mỗi gam chất mang

Hằng số 100: Mỗi ml mẫu pha loãng bằng thể tích của 100 giọt (10 µl/giọt)

3.4.4 Xác định độ ẩm

Nguyên lý: Xác định độ ẩm bằng cách sấy mẫu đã biết khối lượng trước (khoảng 5 - 10g) đến khi kiệt nước hoàn toàn Chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy nhân với 100% là kết quả của ẩm độ (Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, 1998)

Tiến hành: Cân khoảng 5 - 10g mẫu trên cân điện tử có độ chính xác 0,01g cho vào đĩa petri sấy khô đã biết khối lượng Đặt đĩa petri chứa mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ

1050C trong 1 giờ Tính phần trăm độ ẩm theo công thức:

Độ ẩm (%) = 100

0 1

P P

Trong đó:

P1: Khối lượng đĩa và mẫu trước khi sấy (g)

P2: Khối lượng đĩa và mẫu sau khi sấy (g)

P0: Khối lượng đĩa (g)

3.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được phân tích thống kê, phân tích tương quan giữa mật số vi khuẩn với các chỉ tiêu đất và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các chỉ tiêu hóa lý của các mẫu đất xám trồng bắp ở Đông Nam Bộ

4.1.1 Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH trong các mẫu đất

Lân, chất hữu cơ là một chỉ tiêu của độ phì nhiêu đất, đất giàu lân mới có độ màu mỡ cao và ngược lại đất có độ màu mỡ cao đều giàu lân (E Detrunk, 1931) Kết quả đo lân hữu dụng, hữu cơ các mẫu đất xám ở Đông Nam Bộ được trình bày qua bảng 2

Bảng 2: Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH

Lân hữu dụng (mg/100g đất)