Phân Lập Vi Khuẩn Pseudomonas Từ Đất Vùng Rễ Cây Sài Đất [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN Pseudomonas TỪ ĐẤT VÙNG RỄ CÂY SÀI ĐẤT [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.] CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGs Ts CAO NGỌC ĐIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGÔ YẾN PHƯƠNG MSSV: 3064473 LỚP: CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGs Ts Cao Ngọc Điệp Ngô Yến Phương DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học này, cố gắng thân, tơi cịn nhận hướng dẫn, ủng hộ, giúp đỡ nhiều người Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Công Nghệ Sinh Học-trường Đại Học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu thực đề tài Xin chân thành cảm ơn tất quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức chuyên môn cho suốt q trình học tập trường Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Cao Ngọc Điệp tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức tạo điều kiện cho suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32, ln quan tâm, động viên tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học thực đề tài Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị cán phịng thí nghiệm vi sinh vật Viện Nghiên Cứu Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực tốt đề tài Xin cảm ơn ba mẹ động viên, khuyến khích, hỗ trợ cho tơi học tập hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn tất bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học khóa 32 cổ vũ giúp đỡ suốt thời gian qua Tơi xin kính chúc q thầy bạn sinh viên dồi sức khoẻ công tác tốt Cần Thơ, ngày tháng Ngô Yến Phương năm 2010 TÓM TẮT Cây sài đất (Wedelia chinensis (Osb.) Merr.) thuộc họ Cúc phổ biến tự nhiên Đây dạng thân thảo, có khả sinh trưởng mạnh hầu hết tất loại đất, thường trồng để tạo cảnh quan Ngồi sài đất cịn sử dụng loại thuốc Đông y để trị cảm mạo, sốt, viêm họng, viêm phế quản phổi, mụn nhọt… Hai mươi tám dòng (chủng) vi khuẩn phân lập từ đất vùng rễ sài đất thu từ tỉnh: An Giang, Bạc Liêu, Đồng tháp, Vĩnh Long, môi trường Pseudomonas isolation agar Tất 28 chủng khả cố định đạm Tuy nhiên, tất chúng có khả hịa tan lân khó tan Trong đó, chủng BL2a AG2a tốt với lượng lân hòa tan 378,73 mg/lít 355,09 mg/lít, có tiềm cao việc ứng dụng để sản xuất phân lân sinh học Từ khóa: sài đất, hịa tan lân, phân lập, Pseudomonas, vi khuẩn vùng rễ i MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Cây sài đất 2 Vi khuẩn Pseudomonas Vi khuẩn Pseudomonas 3 Vi khuẩn cố định đạm 3.1 Vai trò Nitơ 3.2 Quá trình cố định Nitơ (Nitrogen fixation) 3.3 Vi khuẩn cố định đạm Vi khuẩn hòa tan lân 4.1 Vai trò lân (P) 4.2 Chu trình P 4.3 Vi khuẩn hòa tan P Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Pseudomonas cố định đạm hòa tan lân giới Việt Nam 5.1 Trên giới 5.2 Tại Việt Nam 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.Phương tiện nghiên cứu 12 12 1.1 Dụng cụ thiết bị 12 1.2 Vật liệu 14 ii 1.3 Hóa chất 14 Phương pháp 14 2.1.Thời gian địa điểm 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Thu mẫu 15 2.2.2 Phân lập vi khuẩn 15 2.2.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 16 2.2.4 Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn 16 2.2.5 Kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập 16 2.2.6 Chọn lọc dòng vi khuẩn hòa tan lân tốt 17 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 19 19 1.1 Phân lập vi khuẩn 19 1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn 20 1.2.1 Đặc điểm tế bào vi khuẩn 21 1.2.2 Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 21 Khảo sát khả cố định đạm hịa tan lân khó tan dịng vi khuẩn phân lập 24 2.1 Kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dịng vi khuẩn mơi trường đặc 24 2.2 Kết đo khả hòa tan lân khó tan dịng vi khuẩn phân lập 25 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 Kết luận 28 Đề nghị 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 iii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Môi trường Pseudomonas isolation agar 14 Bảng 2: Môi trường lỏng King B 14 Bảng 3: Môi trường Burk không đạm 14 Bảng 4: Môi trường NBRIP 14 Bảng Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập 19 Bảng Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn phân lập 20 Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm vi khuẩn phân lập 21 Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 22 Bảng Bảng tổng hợp kết kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập 24 Bảng 10 Kết đo khả hịa tan lân khó tan dịng vi khuẩn phân lập26 iv DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cây sài đất Wedelia chinensis (Osb.) Merr Hình 2: Các thiết bị, dụng cụ phịng thí nghiệm 13 Hình Sơ đồ bước xác định khả hịa tan lân khó tan 18 Hình Vi khuẩn phát triển làm biến đổi màu môi trường phân lập 20 Hình Đặc điểm số dạng khuẩn lạc phân lập 23 Hình Phản ứng màu lượng lân hòa tan với thuốc thử Oniani 25 v Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU Cúc lồi thực vật hạt kín, hai mầm, có khoảng 350 lồi, trồng phổ biến nước ta Các loài thuộc họ cúc có nhiều cơng dụng khác trồng làm kiểng, làm thuốc, làm rau ăn… Ngoài ra, số họ cúc cịn có khả cải tạo đất, cụ thể Sài Đất (tên khoa học Wedelia chinensis (Osb.) Merr.) Đây dạng thân thảo, có khả sinh trưởng mạnh hầu hết tất loại đất, thường trồng lấn cỏ diện tích rộng nhằm tạo cảnh quan đẹp mắt Tuy nhiên, tiềm lớn mạnh sài đất khả cố định đạm hòa tan lân số dòng vi khuẩn vùng rễ Trong số dòng vi khuẩn cố định đạm Pseudomonas lồi có triển vọng to lớn số lượng dòng khả cố định đạm Lượng Nitơ tự tồn khơng khí lớn (khoảng 80%) xanh khơng tận dụng Chính nhờ vào dịng vi khuẩn cố định đạm vùng rễ mà lượng Nitơ khổng lồ chuyển hóa thành dạng đạm dễ tiêu cho xanh làm giàu đạm cho đất Việc sử dụng dòng vi khuẩn cố định đạm để bổ sung lượng đạm cho đất có nhiều ưu bón phân hóa học hạn chế tạo thành hai loại khí thải CO2 NO2 trình sản xuất sử dụng Bên cạnh Nitơ, lân (P) đóng vai trị quan trọng dinh dưỡng trồng P thành phần cấu tạo tế bào, liên quan đến tổng hợp giải phóng lượng q trình thành lập tế bào (Alexander, 1977) Từ xưa, nguồn bổ sung P chủ yếu cho đất thường loại phân lân sản xuất đường hóa học Việc sản xuất gây ô nhiễm môi trường giá thành cao Do q trình vơ hóa P nhờ vi sinh vật đóng vai trị quan trọng trồng Thêm vào đó, Pseudomonas ln biết đến nhân tố tích cực trình chuyển hóa P khó tan thành P vơ dễ tiêu cho trồng Chính yếu tố nêu mà yêu cầu cấp thiết đặt nghiên cứu, phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas vừa có khả cố định đạm, vừa có khả hịa tan lân Đây mục tiêu đề tài: “Phân lập vi khuẩn Pseudomonas từ vùng rễ sài đất [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]” Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Cây sài đất Họ Cúc (Asteraceae hay Compositae), gọi họ Hướng dương, họ Cúc tây, họ lớn có mức tiến hóa cao lồi thực vật hạt kín hai mầm Họ Cúc bao gồm chủ yếu thân cỏ, bụi số thân gỗ Theo liệu Vườn thực vật hoàng gia Kew mà APG II trích dẫn, họ chứa 1,620 chi 23,600 lồi Lá họ hoa mọc đối, so le phổ biến kiểu mọc vịng Lá đơn có hình lơng chim kép hình chân vịt khơng có kèm Hoa cúc chia làm hai kiểu bản: loại có hình ống, đối xứng, tỏa tia loại có hình dây (strap-shaped) đối xứng hai bên Hoa cúc đơn tính lưỡng tính tùy loại Bộ nhị thường có – nhị hoa bọc bao phấn Sài đất gọi Ngổ núi, Cúc nháp, Húng trám; có tên khoa học Wedelia chinensis (Osb.) Merr., thuộc họ Cúc Cây mọc hoang trồng nhiều nơi nước ta Cây thân thảo sống dại, đứng thẳng hay mọc bò, cao tới 40 cm Thân màu xanh, có lơng trắng Lá mọc đối, hình bầu dục, có cưa to Hình 1: Cây sài đất Wedelia chinensis (Osb.) Merr nông, có lơng thơ hai mặt Lá có gân hai gân phụ xuất phát gần từ điểm phía cuống lá, rõ mặt Hoa màu vàng tươi, xếp thành đầu nách cành Dịch ép chứa dầu hoà tan 11,2%, hợp chất béo 29,7%, phytosterol 3,75%, caroten 1,14%, chlorophylle 3,75%, nhựa 44,95%, cịn có đường, tanin, saponin, chất có solice, pectin, mucin, lignin chất có cellulose Ngồi cịn có tinh dầu muối vô Theo Đông y, sài đất có vị ngọt, chua, tính mát, có tác dụng nhiệt, giải độc, cầm ho, mát máu nên thường dùng để trị cảm mạo, sốt, viêm họng, viêm phế quản phổi, mụn nhọt… (http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/saidat.htm) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ + Dùng que cấy để nguội sau khử trùng lửa đèn cồn lấy khuẩn lạc rời trải lên giọt nước lame + Lấy lamelle đậy lên giọt nước cách để lamelle tiếp xúc với lame giọt nước góc 45o, hạ lamelle xuống nhẹ nhàng để tránh bị bọt khí + Quan sát kiểm tra độ ròng mẫu - Khi thấy mẫu rịng cấy chuyển (xem dịng- isolate) vào ống nghiêng chứa môi trường đặc tương ứng, trữ 40C xem dòng (isolate) 2.2.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc Trong cấy chuyển vi khuẩn môi trường đặc, ta tiến hành đo kích thước quan sát hình thái dạng khuẩn lạc bao gồm tiêu: màu sắc, hình dạng, độ dạng bìa khuẩn lạc mắt thường (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2000) Các khuẩn lạc đo kích thước milimet (mm) 2.2.4 Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn Sau phân lập tách rịng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng chuyển động vi khuẩn phương pháp giọt ép kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp (2000) 2.2.5 Kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập Kiểm tra khả cố định đạm Cấy dòng vi khuẩn ròng lên đĩa petri có chứa mơi trường Burk khơng đạm Đem ủ nhiệt độ 30oC Sau ngày, dòng phát triển tăng sinh khối ta kết luận dịng có khả cố định đạm Kiểm tra khả hòa tan lân Tương tự kiểm tra khả cố định đạm, ta đem cấy dịng vi khuẩn rịng lên đĩa petri có chứa môi trường NBRIP Đem ủ nhiệt độ 30 oC Sau ngày, quan sát khuẩn lạc dịng, dịng phát triển tăng sinh khối ta kết luận dịng có khả hịa tan lân Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 21 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ 2.2.6 Chọn lọc dòng vi khuẩn hòa tan lân tốt Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn Nhằm đảm bảo lượng vi khuẩn chủng vào môi trường lỏng để tiến hành thí nghiệm tương đương nhau, dùng que cấy lấy phần sinh khối vi khuẩn làm ròng cho đầy vòng tròn đầu que cấy cho vào ống nghiệm có chứa sẵn ml môi trường King B lỏng, ủ máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút, 300C ngày Chọn lọc dòng vi khuẩn hòa tan lân tốt Dùng thuốc thử Acid Ascorbic - Ammoniummolypdate - Potassium antinomol tartrate để đánh giá lượng lân vi khuẩn hòa tan dung dịch theo nguyên lý: - Chất lân sau hịa tan mơi trường tác dụng với ammoniummolypdate môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolypdate màu vàng H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H+  (NH4)3[P(MoO10)4] - Dưới diện chất khử, Mo 6+ bị khử thành Mo3+ Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có dịch huyền phù vi khuẩn, pH điều kiện khử môi trường Đo mẫu máy so màu bước sóng λ 880 nm - Trong mơi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ P nhỏ phạm vi định mật độ quang học màu xanh tỉ lệ thuận với hàm lượng P theo định luật Bir Lambeg Để chọn lọc dịng vi khuẩn có khả hịa tan lân khó tan tốt nhất, thí nghiệm tiến hành sau: - Chủng 500 µl dịch huyền phù vi khuẩn nuôi vào ống falcon có chứa 15 ml mơi trường NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999), lắc máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút, 300C 10 ngày Mỗi nghiệm thức lặp lại lần - Lấy mẫu vào thời điểm 10 ngày ni để xác định hàm lượng lân hịa tan máy so màu theo phương pháp Oniani Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 22 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ Vi khuẩn Nuôi môi trường NBRIP lỏng Lọc lấy phần dịch Trộn với thuốc thử Đo OD bước sóng 880 nm Hình Sơ đồ bước xác định khả hịa tan lân khó tan Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học 23 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 1.1 Phân lập vi khuẩn Vi khuẩn ngoại sinh vùng rễ sài đất phong phú, đa dạng hình thái, màu sắc hình dạng khuẩn lạc Qua phân lập tách ròng vi khuẩn từ mẫu đất vùng rễ sài đất thu tỉnh Vĩnh Long, An Giang, Đồng Tháp, Bạc Liêu môi trường Pseudomonas isolation agar đặc thu 28 dòng vi khuẩn khác Bảng Nguồn gốc dòng vi khuẩn phân lập STT Vi khuẩn Nguồn gốc mẫu AG 1a AG 1b AG 1c Mỹ Luông-An Giang Mỹ Luông-An Giang Mỹ Luông-An Giang 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 AG 2c AG 2b’ AG 2a AG 2b AG 4a AG 4c BL 1c BL 2a BL 2b BL 2c ĐT 1a ĐT 1b ĐT 1d ĐT 1f ĐT 2g ĐT 2e ĐT 2d VL 1b Long Điền A-An Giang Long Điền A-An Giang Long Điền A-An Giang Long Điền A-An Giang Mỹ Luông-An Giang Mỹ Luông-An Giang Thị xã Bạc Liêu-Bạc Liêu Giá Rai-Bạc Liêu Giá Rai-Bạc Liêu Giá Rai-Bạc Liêu Lai Vung-Đồng Tháp Lai Vung-Đồng Tháp Lai Vung-Đồng Tháp Lai Vung-Đồng Tháp Hồng Ngự-Đồng Tháp Hồng Ngự-Đồng Tháp Hồng Ngự-Đồng Tháp Trà Ôn-Vĩnh Long 22 23 24 25 26 27 VL 1c VL 1e VL 3a VL 3b VL 4c VL 4b Trà Ôn-Vĩnh Long Trà Ôn-Vĩnh Long Trà Ôn-Vĩnh Long Trà Ôn-Vĩnh Long Trà Ôn-Vĩnh Long Trà Ôn-Vĩnh Long 28 VL 4d Trà Ôn-Vĩnh Long Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 24 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ Trong số 28 dòng vi khuẩn phân lập, số dòng phân lập từ mẫu đất An Giang dòng (chiếm 32,14%), Vĩnh Long dòng (chiếm 28,57%), Đồng Tháp dòng (chiếm 25%) Bạc Liêu dòng (chiếm 14,29%) Do sử dụng môi trường phân lập (Pseudomonas isolation agar) chuyên biệt nên hầu hết dòng vi khuẩn phân lập thuộc loài Pseudomonas Chúng sinh trưởng phát triển mạnh mơi trường đặc, điều kiện hiếu khí Đặc biệt, có dịng vi khuẩn AG 1c làm thay đổi màu mơi trường q trình phân lập Mơi trường bị đổi màu Hình Vi khuẩn phát triển làm biến đổi màu môi trường phân lập 1.2 Đặc điểm dịng vi khuẩn Bảng Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn phân lập Số TT Vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Hình dạng Chuyển động Đặc điểm khuẩn lạc Màu sắc Hình dạng Dạng bìa ĐK (mm) Độ 10 AG 1a AG 1b AG 1c AG 2a AG 2b AG 2c AG 2b’ AG 4a AG 4c BL 1c Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ ++ ++ + +++ ++ +++ ++ +++ + Trắng Trắng đục Trắng Trắng Đỏ Trắng đục Trắng Trắng Trắng đục Trắng đục Khơng Trịn Khơng Khơng Trịn Trịn Khơng Khơng Tròn Tròn Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Nguyên Nguyên Răng cưa Răng cưa Nguyên Răng cưa Lài Lài Lài Lài Mô Lài Lài Mô Lài Lài 1,5 1 1,5 1,5 1,5 1 11 12 13 14 15 16 BL 2a BL 2b BL 2c ĐT 1a ĐT 1b ĐT 1d Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ +++ ++ ++ +++ ++ Trắng đục Trắng đục Trắng Trắng đục Trắng Trắng đục Không Trịn Khơng Khơng Khơng Khơng Nguyên Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Lài Lài Lài Lài Lài Lài 1 1,5 Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 25 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ 17 ĐT 1f 18 ĐT 2g Que ngắn Que ngắn +++ ++ Trắng đục Trắng Tròn Răng cưa Không Răng cưa Lài Lài 19 20 21 22 23 24 ĐT 2e ĐT 2d VL 1b VL 1c VL 1e VL 3a Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ +++ ++ +++ ++ + Trắng Trắng Trắng Trắng Trắng đục Trắng đục Trịn Khơng Hình thoi Trịn Trịn Trịn Răng cưa Xẻ thùy Nguyên Răng cưa Nguyên Răng cưa Lài Lài Lài Lài Mô Lài 1 1,5 25 26 27 28 VL 3b VL 4c VL 4b VL 4d Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn ++ +++ +++ +++ Trắng đục Trắng đục Trắng Trắng đục Trịn Trịn Khơng Trịn Răng cưa Răng cưa Răng cưa Răng cưa Lài Lài Lài Mô 1,5 1,5 1,5 (+) chuyển động chậm; (+ +) chuyển động nhanh; (+ + +) chuyển động nhanh ĐK: đường kính khuẩn lạc vi khuẩn sau 24 cấy môi trường phân lập 1.2.1 Đặc điểm tế bào vi khuẩn Các dòng vi khuẩn phân lập có số đặc điểm sau: - 28 dịng vi khuẩn có dạng que ngắn, chiếm tỷ lệ 100% - Tất dịng vi khuẩn phân lập có khả chuyển động với nhiều tốc độ khác Cụ thể tổng số 28 dịng có 14 dịng chuyển động nhanh, chiếm tỷ lệ cao (50%); có 11 dịng chuyển động nhanh, chiếm tỷ lệ 39,29%; lại dòng (tương ứng với 10,71%) di chuyển chậm Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm vi khuẩn phân lập Đặc điểm vi khuẩn Số lượng Tỷ lệ % Hình dạng Que ngắn 28 100 Chuyển động Chậm Nhanh Rất nhanh 14 11 10,71 50,00 39,29 1.2.2 Đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập - Hình dạng khuẩn lạc: Phần lớn khuẩn lạc có dạng hình trịn khơng Trong số 28 dịng vi khuẩn phân lập dịng có khuẩn lạc hình trịn chiếm 14/28 dịng (tỷ lệ 50%); dịng có khuẩn lạc khơng chiếm 12/28 dịng (tỷ lệ 42,86%) Đặc biệt có dịng có khuẩn lạc hình thoi, chiếm 3,57% dịng có khuẩn lạ dạng mọc lan, chiếm tỷ lệ 3,57% Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 26 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ - Màu sắc khuẩn lạc: Đa số dịng có màu trắng trắng đục, bật có dịng có khuẩn lạc màu đỏ Trong tổng số dòng vi khuẩn phân lập, 14/28 dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm tỷ lệ 50%; 13/28 dịng có khuẩn lạc màu trắng trong, chiếm tỷ lệ 46,43%; có dòng màu đỏ, chiếm tỷ lệ 3,57% Tuy nhiên, trình cấy trữ lâu ngày, khuẩn lạc số dịng vi khuẩn có tượng chuyển từ trắng trắng đục sang màu nâu nhạt - Dạng bìa khuẩn lạc: Hầu hết dịng vi khuẩn phân lập có khuẩn lạc dạng bìa cưa, số có dạng bìa ngun dạng bìa xẻ thùy Số lượng cụ thể là: 21/28 dịng vi khuẩn có khuẩn lạc bìa dạng cưa, chiếm 75%; 13/28 dịng vi khuẩn có bìa dạng ngun, chiếm tỷ lệ 21,43%; cịn lại dịng có bìa xẻ thùy, chiếm tỷ lệ 3,57% - Độ khuẩn lạc: số 28 dịng phân lập dịng vi khuẩn có khuẩn lạc với độ lài chiếm đa số với 22 dòng, chiếm tỷ lệ 78,57%; lại dịng khuẩn lạc có độ mơ, chiếm tỷ lệ 21,43% - Đường kính khuẩn lạc: Phần lớn dịng vi khuẩn phân lập có đường kính khuẩn lạc dao động từ 1-2 mm sau cấy môi trường đặc, ủ 30 0C 24 Đặc biệt, điều kiện ủ đường kính khuẩn lạc dịng vi khuẩn ĐT2e có kính thước lên đến mm Bảng Tỷ lệ (%) đặc điểm khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập Hình thoi Mọc lan Khơng Tròn Số lượng 1 12 14 Tỷ lệ % 3,57 3,57 42,86 50,00 Màu sắc Đỏ Trắng Trắng đục 13 14 3,57 46,43 50,00 Dạng bìa Xẻ thùy Nguyên Răng cưa 21 3,57 21,43 75,00 Độ Mô Lài 22 21,43 78,57 Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học 27 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ (A) (B) (C) (D) (E) (F) Hình Đặc điểm số dạng khuẩn lạc phân lập (A) Khuẩn lạc có màu trắng trong, hình thoi, độ lài, bìa cưa (B) Khuẩn lạc có màu trắng đục, khơng đều, độ lài, bìa cưa (C) Khuẩn lạc có màu đỏ, dạng trịn, độ mơ, bìa ngun (D) Khuẩn lạc có màu trắng đục, khơng đều, độ lài, bìa cưa (E) Khuẩn lạc có màu trắng đục, khơng đều, độ mơ, bìa cưa (F) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng trịn, độ mơ, bìa ngun Chun ngành Công Nghệ Sinh Học 28 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ Khảo sát khả cố định đạm hịa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập 2.1 Kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dịng vi khuẩn mơi trường đặc Bảng Bảng tổng hợp kết kiểm tra khả cố định đạm hòa tan lân dòng vi khuẩn phân lập STT Vi khuẩn Môi trường Burk không đạm (kiểm tra khả cố định đạm) Mơi trường NBRIP (kiểm tra khả hịa tan lân) AG 1a AG 1b - + - 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 AG 1c AG 2c AG 2b’ AG 2a AG 2b AG 4a AG 4c BL 1c BL 2a BL 2b BL 2c ĐT 1a ĐT 1b ĐT 1d ĐT 1f ĐT 2g ĐT 2e ĐT 2d - + + + + + + + + + + + + + + + - 21 22 23 24 25 26 27 28 VL 1b VL 1c VL 1e VL 3a VL 3b VL 4c VL 4b VL 4d - + + + + + + + + (+) phát triển (-) không phát triển Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 29 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ - Trong 28 dịng vi khuẩn ni cấy mơi trường Burk khơng đạm, sau ngày ni 300C khơng có dịng vi khuẩn phát triển tăng sinh khối lên yếu - Trái lại, ni cấy 28 dịng vi khuẩn phân lập mơi trường NBRIP sau ngày ủ 300C dòng phát triển tốt Chỉ có dịng khơng phát triển AG1b, AG1c, AG4a ĐT2d Như vậy, theo kết kiểm tra mơi trường Burk khơng đạm ta kết luận dòng vi khuẩn phân lập khơng có khả cố định đạm Do đó, thí nghiệm đo khả cố định đạm dịng vi khuẩn khơng tiến hành Tuy nhiên, ta lại chọn 24/28 dòng vi khuẩn phân lập có khả hịa tan lân tốt để tiến hành thí nghiệm 2.2 Kết đo khả hịa tan lân khó tan dịng vi khuẩn phân lập Sau kiểm tra cách cấy dòng vi khuẩn phân lập mơi trường đặc, 24 dịng vi khuẩn chọn tiếp tục nuôi môi trường NBRIP lỏng để xác định xác khả hịa tan lân khó tan chúng Lấy mẫu vào thời điểm ngày 10 ngày sau nuôi để đo lượng lân hịa tan có mơi trường ni cấy phương pháp Oniani Lượng lân vi khuẩn hòa tan có dung dịch phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu xanh dương, lượng lân vi khuẩn hịa tan nhiều màu xanh dung dịch phản ứng đậm Hình Phản ứng màu lượng lân hòa tan với thuốc thử Oniani Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 30 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ Bảng 10 Kết đo khả hịa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập Đơn vị: mg/l Số TT Vi khuẩn Hàm lượng lân hòa tan (đã hiệu chỉnh mẫu đối chứng) Hàm lượng lân hòa tan đo Ngày Ngày Ngày 10 Ngày Ngày Ngày 10 Trung bình BL 2b BL1c BL 2c BL 2a VL 1b VL 4d VL 3b 0,02 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 35,52 30,78 34,28 22,91 22,37 30,03 32,52 79,89 23,37 82,07 384,24 78,80 12,50 90,76 0,02 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 23,55 18,81 22,31 10,94 10,40 18,06 20,55 77,78 21,12 86,30 378,73 136,25 10,49 167,42 33,78 13,31 36,21 129,90 48,89 9,52 62,66 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 VL 4c VL 4b VL 1c VL 1e VL 3a ĐT 1d ĐT 1f ĐT 2g ĐT 1b ĐT 2e ĐT 1a AG 2b AG 2a AG 2b' AG 1a AG 4c AG 2c DC 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,02 0,00 33,56 37,17 31,02 29,42 26,24 28,93 38,46 47,24 35,89 18,82 19,83 30,84 23,41 27,95 33,93 28,22 29,75 11,97 79,89 316,85 121,20 42,93 314,67 155,98 92,93 285,33 26,63 22,28 36,41 123,37 216,85 294,02 34,24 45,11 53,80 1,63 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,01 0,02 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,02 21,59 25,20 19,05 17,45 14,27 16,96 26,49 35,27 23,92 6,85 7,86 18,87 11,44 15,98 21,96 16,25 17,78 85,50 312,25 169,21 40,92 277,02 199,93 102,07 312,83 25,20 19,44 34,39 230,66 355,09 315,92 46,01 37,78 52,18 35,70 112,49 62,76 19,46 97,10 72,30 42,86 116,04 16,38 8,77 14,09 83,18 122,18 110,64 22,66 18,01 23,33 CV % = 7,51 (DC) đối chứng (CV %) độ sai lệch Qua kết kiểm định, tất 24 dịng vi khuẩn khảo sát có khả hịa tan lân khó tan với kết cụ thể sau: Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 31 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ - Lượng lân trung bình mà dịng vi khuẩn hịa tan vào thời điểm ngày (0,02 mg/lít), ngày (18,27 mg/lít), ngày 10 (145,62 mg/lít) khác biệt có ý nghĩa thống kê Chứng tỏ từ ngày đến ngày 10, lượng lân hòa tan vi khuẩn tạo thành sau cao - Hầu hết dịng vi khuẩn khảo sát có khả hòa tan lân cao vào ngày 10 - Trong số đó, ngày 10, dịng BL2a, AG2a, AG2b’ có khả hịa tan lân trội hẳn khác biệt có ý nghĩa thống kê so với dòng lại Lượng lân hòa tan tạo thành dòng BL2a, AG2a AG2b’ 378,73 mg/lít; 355,09 mg/lít 315,92 mg/lít Tuy nhiên lượng lân hòa tan dòng BL2a AG2a khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê, dịng AG2b’ dịng lại khác biệt có ý nghĩa thống kê Do đó, ta kết luận dịng vi khuẩn BL2a AG2a có khả hòa tan lân tốt - Bên cạnh đó, dịng VL4b ĐT2g có khả hòa tan lân tương đối cao Tuy lượng lân hòa tan tạo thành vào ngày 10 dòng VL4b (312,25 mg/lít) ĐT2g (312,83 mg/lít) thấp dịng BL2a AG2a vào ngày lại cao - Ngồi ra, dịng vi khuẩn ĐT2e VL4d lại có khả hịa tan lân nhất, lượng lân hịa tan có 8,77 mg/lít 9,52 mg/lít Chun ngành Cơng Nghệ Sinh Học 32 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Phân lập đươc 28 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ sài đất tỉnh An Giang, Bạc Liêu, Đồng Tháp Vĩnh Long Qua khảo sát đặc tính dòng vi khuẩn, xác định 24/28 dòng vi khuẩn có khả hịa tan lân khó tan, dịng BL2a AG2a tốt với lượng lân hòa tan 378,73 mg/lít 355,09 mg/lít Ngồi ra, tất 28 dịng vi khuẩn phân lập khơng có khả cố định đạm Đề nghị Do thời gian kinh phí thực luận văn có hạn, dịng vi khuẩn khảo sát đặc tính qui mơ phịng thí nghiệm Đề nghị tiến hành khảo sát, đánh giá ngồi đồng để có bước khảo sát tốt tiếp tục ứng dụng vào việc sản xuất phân lân sinh học Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 33 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Cao Ngọc Điệp 2008 Nghiên cứu sản xuất phân sinh học bón cho đậu nành: chất mang thích hợp cho sống sót vi khuẩn nốt rễ vi khuẩn Pseudomonas spp, Tạp chí khoa học, trường Đại học Cần Thơ Cao Ngọc Điệp Bùi Thị Kiều Oanh 2005 Hiệu vi khuẩn Pseudomonas spp Trên suất trữ lượng đường mía đường (Saccharum officinarum L giống VĐNL-7) trồng đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An Trường Đại Học Cần Thơ Hà Danh Đức 2005 Xác định dòng vi khuẩn cố định đạm hòa tan lân đậu phộng trồng tỉnh Trà Vinh Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học, trường đại học Cần Thơ Lê Văn Hịa Nguyễn Bảo Tồn 2004 Giáo trình sinh lý thực vật, Khoa nơng nghiệp sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ Tiếng Anh Beauchamp C J, Lộvesque G, Prộvost D and Franỗois-P Chalifour 2005 Isolation of free-living dinitrogen-fixing bacteria and their activity in compost containing deinking paper sludge Département de phytologie, Université Laval, Sainte-Foy, Québec, Canada G1K 7P4 Soils and Crops Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, Sainte-Foy, Québec, Canada G1V 2J3 Gaur A C, Arora D and Prakash N 1978 Electron microscopy of some rock phosphate dissolving bacteria and fungi Division of Microbiology, Indian Agricultural Research Institute, 12 New Delhi, India Illmer P and Schinner F 1995 Phosphate solubilizing microorganisms under nonsterile conditions Institute of Microbiology (NF), University of Innsbruck, Austria Keneni A, Assefa F and Prabu P C 2009 Isolation of Phosphate Solubilizing Bacteria from the Rhizosphere of Faba Bean of Ethiopia and Their Abilities on Solubilizing Insoluble Phosphates Department of Applied Biology, Ambo University College, Ambo, Ethiopia Department of Biology, Addis Ababa University, Addis Ababa, Ethiopia Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 34 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 32 – 2010 trường Đại Học Cần Thơ Martinez A 2007 Microorganism of the Month: Pseudomonas species EMLab P&K Analyst Trang web http://www.dostbentre.gov.vn/index.php?option=com_content&task=view&id=1247&Itemid=138 (ngày 25/12/2009) http://www.dthu.edu.vn/bgdt/BG/Nguyen%20Kim%20Bup/Baigiangdientusltv/Chuon g5/C5m4.htm (ngày 25/12/2009) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/527907 (ngày 18/11/2009) http://www.springerlink.com/content/w4424837341x571l/ (ngày 21/11/2009) (http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/saidat.htm) (ngày 15/11/2009) (http://agri.agu.edu.vn/?q=dtncct.nckh) (ngày 18/11/2009) (http://www.skhcndaklak.gov.vn/Trangchủ/ThôngtinKHCN/Bảntinphụcvụnôngthôn/S ố022007/tabid/126/ctl/Details/mid/493/ItemID/166/Default.aspx) (ngày 18/11/2009) (http://www.agro.gov.vn/news/newsDetail.asp?targetID=12617&CAT_ID=71) (ngày 18/11/2009) Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 35 Viện NC & PT CNSH ... vùng khác Nhóm vi khuẩn gọi ? ?vi khuẩn vùng rễ kích thích trồng”, chúng phân lập để làm phân bón cho trồng Đất mát mẻ, ẩm thấp, vi khuẩn hòa tan lân diện nhiều vùng đất khơ cạn Chính vậy, vi khuẩn. .. lân dòng vi khuẩn phân lập 16 2.2.6 Chọn lọc dòng vi khuẩn hòa tan lân tốt 17 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập 19 19 1.1 Phân lập vi khuẩn. .. khả hịa tan lân Đây mục tiêu đề tài: ? ?Phân lập vi khuẩn Pseudomonas từ vùng rễ sài đất [Wedelia chinensis (Osb.) Merr.]? ?? Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Vi? ??n NC & PT CNSH Luận văn tốt nghiệp