Phân lập vi khuẩn pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý amonium trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm pptx

Báo cáo Khoa học Số 32 , 05/2008 27 PHÂN LẬP VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG ðẤT ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ AMONIUM TRONG NƯỚC Ở ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Ths. Phan Trường Khanh ∗ ∗∗ ∗ TÓM TẮT Thu thập 36 mẫu ñất ở ðBSCL ñể phân lập vi khuẩn (VK) Pseudomonas stutzeri và nhận diện chúng bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy dòng P8 xác ñịnh là P. stutzeri bằng cặp mồi ñặc trưng 16S-rDNA và một dòng P2a ñược xác ñịnh có mang gen cd 1 -nirD. Sử dụng riêng rẻ dòng P8, P2a, P10, dòng ñối chứng dương ATCC 14405 và hỗn hợp 2 dòng phối trộn P8-P2a, P10-P8 ñể khử ammonia và nitrat dưới mức an toàn từ 2 ñến 4 ngày sau khi cho các dòng VK này vào trong môi trường nước biển nhân tạo hay nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia. Kết quả là hầu hết các dòng VK ñều có khả năng khử NH 4 + khoảng 80%. Tuy nhiên, hiệu suất xử lý NH 4 + của dòng ATCC 14405 không cao. ABSTRACT Thirty six soil samples were taken from the Mekong Delta to identify Pseudomonas stutzeri by PCR technology. Results indicated that, P8 strain was identified Pseudomonas stutzeri with specific primers 16S-rDNA and that one strain P2a has carried cd 1 -nirD gene. Using alone bacteria strains P8, P10, P2a, ATCC 14405 and a mixture of P8-P2a, P10-P8 reduced ammonia and nitrate concentration to below safety level from 2 to 4 days after inoculating this bacteria into ammonia-wastewater of artificial seawater and shrimp-pond water. As a result, most of bacteria strains reduced about 80% ammonia and nitrate. However, ammonia reducible efficiency of ATCC 14405 was not high. Key words: Pseudomonas stutzeri 1. ðẶT VẤN ðỀ Vấn ñề ô nhiễm các hợp chất nitơ vô cơ trong nước có thể gây nên một số bệnh nguy hiểm cho người sử dụng, nitrat tạo ra chứng thiếu vitamin và có thể kết hợp với các amin ñể tạo nên nitrosamin là nguyên nhân gây ung thư ở người, nồng ñộ NH 4 + cao gây ra hiện tượng phú dưỡng làm cho môi trường nước bị ô nhiễm nặng. Nitơ amon có mặt trong nước cũng làm giảm hiệu quả của khâu khử trùng bằng clo, ngay cả trong môi trường ñất khi lượng nitơ vô cơ quá nhiều ñất sẽ bị chay cứng… Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm và phân lập dòng VK Pseudomonas stutzeri ñể xử lý nitơ vô cơ trong nước là rất cần thiết. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phân lập VK này trên môi trường Pseudomonas isolation agar. Sau ñó xác ñịnh các dòng VK khử ñạm bằng môi trường SW-LB, môi trường Minimal. - Quan sát hình dạng và ño kích thước tế bào VK P. Stutzeri dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 400 lần. - Ly trích DNA và kiểm tra các dòng P. Stutzeri ñã phân lập bằng kỹ thuật PCR - Chạy ñiện di trên Gel Agarose - Xác ñịnh khả năng khử nitơ vô cơ của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri - Xác ñịnh lượng NH 4 + và NO 3 - ñược xử lý bởi VK P.stutzeri trong nước ao nuôi tôm. 3. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1 Hình thái, màu sắc, kích thước dòng Pseudomonas Kết quả phân lập ñược 20 dòng VK Pseudomonas, trong ñó có 5 dòng VK ñược phân lập từ nhóm ñất nhiễm mặn, 5 dòng từ nhóm ñất phèn, 10 dòng ñược phân lập từ nhóm ñất phù sa. Trong số 20 dòng VK Pseudomonas chỉ có 1 dòng P. stutzeri là P8. Dòng P8 ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa xã An Thạnh Trung, huyện Chợ Mới, An Giang. Hầu hết các khuẩn lạc ñều có hình que, màu trắng ñục, trắng sữa hay màu vàng, bề mặt khuẩn lạc mô hoặc trơn, có chiều dài từ 0,4µm–2,5µm; chiều ngang từ 0,5µm– 0,8µm. Bảng 1. Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ ñất ðịa ñiểm thu mẫu Loại ñất Số mẫu Số dòng phân lập Chợ Mới Phù sa 6 6 Ô môn Phù sa 6 4 ∗ Giảng viên BM. Môi trường - PTBV. Email: ptkhanh@agu.edu.vn Báo cáo Khoa học Số 32 , 05/2008 28 Vĩnh Lợi ðất mặn 6 2 Vĩnh Châu ðất mặn 6 3 Tam Nông ðất phèn 6 2 Thạnh Hoá ðất phèn 6 3 3.2 Kiểm tra các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR Sản phẩm ADN sau khi kiểm tra ñược khuếch ñại bằng kỹ thuật PCR, tiếp tục kiểm tra bằng phương pháp ñiện di trên gel agarose 1,2% và ñược chụp hình dưới tia UV. Kết quả ñiện di với cặp mồi F (5 ’ AGT CAC ACT GGA ACT GAG ACA -3’); R (5 ’ -TGT CAG TAT TAG CCC AGG TG-3’), chúng tôi phát hiện ñược một loài VK cho band ADN ở vị trí 625bp là chủng P. stutzeri P8 (Hình 1) phù hợp với vị trí band của VK ñối chứng dương ATCC 14405. Những dòng còn lại không cho band tương ứng chứng tỏ chúng không phải là Pseudomonas stutzeri. Hình 1. Vi khuẩn P8 Hình 2. Vi khuẩn P2a Kết quả ñiện di nhận diện dòng VK mang gen nir tổng hợp cd 1 với cặp mồi F1 (5 ’ -GAA TAC CAC CCC GAG CCG CGC GT-3’); R4 (5’-AC CCG ACC GGT AAG TTC AAC GTG -3’), chúng tôi cũng phát hiện ñược một loài VK cho band ADN ở vị trí 785bp là chủng VK P2a (Hình 2) nhưng không phải là Pseudomonas stutzeri Hình 3. ðoạn gen của P. stutzeri mang gen nos, nir, nor. Hình 4. P2a tổng hợp cd 1 -nirD từ hem D1 3.3 Xác ñịnh khả năng khử nitơ vô cơ của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Thí nghiệm ñược bố trí với 7 nghiệm thức bao gồm: 4 dòng VK ñơn lẻ P10, P8, P2a, ñối chứng dương ATCC 14405; 2 dòng phối trộn P10-P8, P8-P2a và một nghiệm thức ñối chứng âm. Mỗi dòng VK tiến hành lặp lại 3 lần trong 3 bình tam giác khác nhau. Mẫu ñối chứng âm ñược chuẩn bị giống như mẫu thật nhưng không có chủng VK. Chủng vi khuẩn ñối chứng dương ATCC 14405 1 chủng vi khuẩn P8 P. stutzeri 100 bp 300 bp 600 bp 900 bp 1200 bp Thang chuẩn 100bp 300 bp 900 bp 600 bp 100 bp 1 chủng vi khuẩn P2a khử ñạm mang gen cd 1 -nirD Báo cáo Khoa học Số 32 , 05/2008 29 Thí nghiệm ñược tiến hành trên môi trường nước biển nhân tạo với hai nồng ñộ NH 4 + khác nhau (nồng ñộ NH 4 + ban ñầu 10ppm và 30ppm) và nước ao nuôi tôm bị nhiễm ammonia (nồng ñộ NH 4 + ban ñầu 5ppm) . Bố trí thí nghiệm xong chúng tôi tiến hành ño pH, ñếm mật số VK và xác ñịnh lượng NH 4 + , NO 3 - còn lại. Bảng 2. Hiệu suất xử lý NH 4 + của các nghiệm thức sau 4 ngày thí nghiệm với NH 4 + ban ñầu 10ppm (thí nghiệm 1), 30ppm (thí nghiệm 2), ao nuôi tôm 5ppm (thí nghiệm 3). STT Nghiệm Thức Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 1) Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 2) Hiệu Suất (%) (thí nghiệm 3) 1 ðối chứng - 2 Dòng P8 80,78 98,36 80,78% 3 Dòng P2a 59,92 65,39 59,92% 4 Dòng ATCC 14405 55,78 97,40 55,78% 5 Dòng P10 79,96 76,16 79,96% 6 Dòng P10-P8 80,78 99,28 80,78% 7 Dòng P8-P2a 80,58 99,35 80,58% Kết quả cho thấy, tất cả các dòng VK ñều khử ñược NH 4 + , nghĩa là tất cả các dòng VK trên ñều có mang gen nir, tuy nhiên mức ñộ khử NH 4 + của mỗi dòng khác nhau là còn tuỳ thuộc vào dòng VK ñó có mang các gen ñặc hiệu nào khác không? Dòng P8 là dòng P. stutzeri có mang tổ hợp các gen nir, nor, nos khử ñược NH 4 + qua các giai ñoạn NH 4 + >NO 3 > NO 2 > NO > N 2 O > N 2 và cũng có khả năng khử ñược NH 4 + ->NO 3 > NO 2 >NH 3 . Vì vậy, hiệu suất khử NH 4 + của dòng P8 cao nhất trong tất cả các dòng VK. Trong khi ñó, dòng P2a là dòng Pseudomonas có mang gen cd 1 -nirD khử ñược nitơ vô cơ mạnh nhất ở giai ñoạn NO 2 >NO > N 2 O > N 2 . Còn giai ñoạn khử NH 4 + sang NO 3 sang NO 2 xảy ra nhưng rất chậm. Vì vậy, hiệu suất khử NH 4 + ở dòng P2a thấp hơn so với dòng VK P8. Khi ứng dụng VK vào xử lý các mẫu nước ao nuôi tôm bị nhiễm amonium thì hầu hết chúng làm giảm nồng ñộ NH 4 + khoảng 80% sau bốn ngày thí nghiệm. Tuy nhiên, hiệu suất xử lý thấp hơn so với thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2. Biểu ñồ 2 cũng cho thấy nồng ñộ NO 3 - còn lại sau bốn ngày thí nghiệm rất thấp dao ñộng trong khoảng 0,042-0,087 ppm, rõ ràng khi có sự tham gia của các dòng VK thì hầu hết nồng ñộ NH 4 + chuyển hoá thành NO 3 - , sau công ñoạn nitrat hoá amoni là khâu khử nitrat sinh hoá nhờ các dòng vi sinh vật trong ñiều kiện thiếu khí. Nitrit và nitrat sẽ chuyển thành dạng khí N 2 . Vì vậy nồng ñộ NO 3 - giảm một cách ñáng kể ở hầu hết các nghiệm thức và mật số VK có xu hướng giảm theo thời gian thí nghiệm. ðiều này cho thấy, trong mẫu nước ao nuôi tôm các hợp chất hữu cơ chứa cacbon ñã cạn kiệt do ñó mật số VK có xu hướng giảm xuống ở những ngày thí nghiệm cuối cùng. ðiều này có thể giải thích VK thu năng lượng ñể tăng trưởng từ quá trình chuyển hoá NO 3 - thành khí N 2 và cần có nguồn cacbon ñể tổng hợp tế bào. 0 1 2 3 4 5 6 Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Nồng ñộ NH4 ppm ðC P8 P2a ATCC P10 P10-P8 P8-P2a 4.185 0.048 0.061 0.087 0.042 0.045 0.046 ð C P 8 P 2a ATCC14405 P 10 P 10-P 8 P 8-P 2a nghiệm thức Biểu ñồ 1. Sự biến ñộng NH 4 + trong mẫu nước ao Biểu ñồ 2. Nồng ñộ NO 3 - còn lại trong nước ao nuôi tôm sau xử lý. nuôi tôm sau khi xử lý Báo cáo Khoa học Số 32 , 05/2008 30 4. KẾT LUẬN - Bằng kỹ thuật PCR kết quả nhận diện ñược một dòng VK P.stutzeri ñó là dòng P8 ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa, huyện Chợ Mới, tỉnh An Giang. Dòng P2a không phải là VK P. stutzeri nhưng có gen cd 1 -nirD khử ñược oxyt nitơ từ NO sang N 2 O ñến N 2 và ñược phân lập từ mẫu ñất phù sa huyện Ô Môn, Cần Thơ. - Tất cả các dòng VK P8, ATCC14405, P2a, P10 hệ phối trộn P8-P2a, P8-P10 ñều có khả năng khử ñược nitrat và ñạm amon trong mẫu nước ao nuôi tôm. Dòng P8, P8-P2a, P10-P8 hiệu suất xử lý NH 4 + ñạt khoảng 80%. Dòng P10 không phải là VK P.stutzeri nhưng khả năng xử lý NH 4 + ñạt 79,96%. Dòng P2a khả năng xử lý ñạm amon không ổn ñịnh và hiệu suất xử lý thấp chỉ ñạt 59,92%. Dòng ñối chứng dương ATCC 14405 là dòng VK P.stutzeri lấy từ nước ngoài nên khả năng thích nghi kém trong ñiều kiện của nước ta vì vậy hiệu suất xử lý cũng không cao. 5. KIẾN NGHỊ - Cần phải ứng dụng các dòng VK này ở ngoài ñồng ñể có kết luận chính xác hơn. - Cần nghiên cứu sâu hơn nửa các dòng VK này ñể sản xuất chế phẩm sinh học trong xử lý môi trường nước ao tôm bị nhiễm ñạm amon và nitrat. - Chúng ta nên phân lập, tìm kiếm và ứng dụng những dòng VK có tại ñịa phương ñể xử lý nước bị nhiễm amonium và nitrat sẽ cho kết quả tốt hơn. . 05/2008 27 PHÂN LẬP VI KHUẨN PSEUDOMONAS STUTZERI TRONG ðẤT ðỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ AMONIUM TRONG NƯỚC Ở ðIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Ths ñất ở ðBSCL ñể phân lập vi khuẩn (VK) Pseudomonas stutzeri và nhận diện chúng bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy dòng P8 xác ñịnh là P. stutzeri bằng